Name: Génération et vérification fonctionnelle de cellules T à récepteur antigénique chimérique sensible à l’hypoxie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Découvrez la génération de cellules CAR-T sensibles à l'hypoxie par lentivirus pour l'immunothérapie anticancéreuse. Ce protocole permet de valider leur expression dépendante de l'hypoxie et leur cytotoxicité sélective contre les tumeurs solides.

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Dans cette étude, HER2-BBz-ODD, un CAR sensible à l’hypoxie ciblant HER2 (ID du gène : 2064) a été comparé à son homologue régulier, HER2-BBz. Les schémas des deux RAC sont illustrés à la figure 1A, qui montre que HER2-BBz-ODD est dérivé de HER2-BBz en ajoutant la séquence ODD à la séquence C-terminale de CD3ξ. La construction de vecteurs lentiviraux exprimant les deux CAR, et la génération du lentivirus correspondant par transfection des cellules 293T, ont déjà été décrites31.
1. Génération de cellules CAR-T sensibles à l’hypoxie par infection lentivirale
<ol><li>Décongelez rapidement des cellules mononucléées de sang périphérique humain (PBMC) cryopréservées à 37 °C dans un bain d’eau. Transférez les PBMC décongelés dans un tube de 15 mL contenant 9 mL de milieu de culture de lymphocytes sans sérum complété par 400 UI d’IL-2, 5 ng/mL d’IL-7 et 10 ng/mL d’IL-15 (milieu de croissance des lymphocytes T humains, appelé TGM par la suite).</li>
	<li>Après avoir prélevé une aliquote pour le comptage cellulaire, centrifuger le tube à 300 × g pendant 5 min. Remettre en suspension les PBMC granulés avec du TGM à une densité de 4 × 106 cellules/mL et transférer la suspension dans une plaque à 6 puits.</li>
	<li>Préparez des immunobilles enrobées d’anti-hCD3/hCD28.<ol><li>Transférez 100 μL de billes magnétiques IgG de souris dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et lavez-les 2 fois à l’aide d’un support magnétique avec PBS.</li>
		<li>Remettre les billes en suspension dans 100 μL de PBS et ajouter 0,2 μg d’anticorps CD3 anti-humain de souris et 2 μg d’anticorps CD28 de souris. Mélangez délicatement le mélange à l’aide d’une pipette et balancez-le toute la nuit à 4 °C.</li>
		<li>Lavez les billes 2 fois à l’aide d’un support magnétique avec PBS et mettez-les en suspension dans 100 μL de PBS.</li>
	</ol></li>
	<li>Ajoutez des immunobilles enrobées d’anti-hCD3/hCD28 à la plaque à l’étape 1.2 avec un rapport bille/cellule de 1:1. Placez la plaque dans un incubateur humidifié avec 5% de CO2 à 37 °C.</li>
	<li>Après 48 h d’incubation, transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 ml après avoir délicatement mélangé les cellules à l’aide d’une pipette. Placez le tube sur un support magnétique pendant 3 min, puis transférez soigneusement le surnageant dans un nouveau tube de 15 ml pour éliminer les billes immunitaires des PBMC.</li>
	<li>Prélever une aliquote pour le comptage des cellules, puis ensemencer les PBMC à 5 × 105 cellules/puits dans 300 μL de TGM dans une plaque plate à 48 puits. Ajouter 200 μL de stock lentiviral dans les puits correspondants et ajouter du sulfate de protamine à une concentration finale de 10 μg/mL.</li>
	<li>Centrifuger la plaque à 1 000 × g à 32 °C pendant 1,5 h et retirer et jeter soigneusement 300 μL de surnageant de chaque puits à l’aide d’une pipette. Ajoutez ensuite 1 ml de TGM frais à l’aide d’une pipette et placez la plaque dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO2 à 37 °C.</li>
	<li>Ajoutez du TGM frais pour ajuster la densité cellulaire à 0,5-2 × 106 cellules/ml tous les 2-3 jours. Commencez par transférer les cellules d’abord sur une plaque à 12 puits, puis sur une plaque à 6 puits. Continuez à cultiver les cellules jusqu’à ce que le nombre total atteigne 6 × 106 dans un volume de 4 ml. REMARQUE : En parallèle, effectuer la transduction CAR des lymphocytes T Jurkat en suivant les mêmes procédures décrites ci-dessus, sauf que le TGM est remplacé par RPMI1640 milieu contenant 10 % de sérum de bovin fœtal (FBS).</li>
</ol>2. Évaluation de l’expression des CAR dépendants de l’oxygène dans les cellules CAR-T à l’aide de la cytométrie en flux
<ol><li>Placez les cellules T transduites par le CAR de l’étape 1.8 en deux plaques de 12 puits à une densité de 2,5 × 106 cellules/puits dans 2 mL de TGM. Placez une plaque directement dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO2 à 37 °C (condition normoxique, car la condition standard pour la culture de cellules a 21 % d’O2) et placez l’autre plaque dans une chambre d’incubation mobile de CO2/O2/N2 avec le niveau de O2 préréglé à 1 % (condition hypoxique), puis maintenez la chambre dans un Incubateur 5% CO2/94% N2 à 37 °C.</li>
	<li>Toutes les 24 h, prélever 5 × 105 cellules des plaques dans des conditions hypoxiques ou normoxiques dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 ml. Centrifuger les tubes à 500 × g pendant 5 min, retirer le surnageant et remettre doucement les cellules en suspension dans 1 mL de PBS par pipetage. Répétez le lavage PBS une fois de plus.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules granulées dans 50 μL de tampon FACS (PBS complété par 2% FBS) dans chaque tube. Ajouter 50 μL d’une dilution de 1:100 d’anticorps anti-Flag conjugué au PE (0,2 μg/mL) et bien mélanger par pipetage. Incuber à l’obscurité à température ambiante pendant 20 min.</li>
	<li>À la fin de l’incubation, ajoutez 1 mL de tampon FACS dans chaque tube. Bien mélanger par pipetage, puis centrifuger à 500 × g pendant 5 min.</li>
	<li>Retirez et jetez délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette et répétez l’étape 2.4 une fois de plus.</li>
	<li>Retirez et jetez délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette. Remettez les cellules en suspension dans 200 μL de tampon FACS, puis transférez la suspension cellulaire résultante dans des tubes d’écoulement de 5 mL.</li>
	<li>Effectuez une cytométrie en flux sur la suspension cellulaire à l’étape 2.6 pour déterminer l’expression du CAR en surface. Inclure les lymphocytes T non transfectés comme contrôle négatif.<ol><li>Utilisez les portes FSC/SSC et FSC-A/FSC-H pour filtrer les cellules individuelles en direct. Collectez 1 × 104 événements uniques en direct pour chaque échantillon. Gate les cellules positives pour l’EGFP (un marqueur constitutif porté dans le vecteur lentiviral comme indicateur de la transduction réussie des lymphocytes T) puis les cellules positives pour la phycoérythrine (PE) (cellules exprimant CAR) pour mesurer la positivité de la PE et l’intensité médiane de fluorescence (MFI).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Analyse de la dépendance à l’oxygène de l’expression des CAR dans les lymphocytes T Jurkat modifiés par CAR par western blot
<ol><li>Plaquez les cellules T Jurkat transduites CAR-transduites de la section 1 en deux plaques de 48 puits à une densité de 5 × 105 cellules par puits (volume de culture de 500 μL) dans RPMI1640 milieu avec 10 % de FBS.</li>
	<li>Pour une plaque, ajoutez du CoCl2 dans les puits expérimentaux jusqu’à une concentration finale de 0 μM, 50 μM ou 200 μM. Ensuite, placez la plaque dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2 à 37 °C (condition normoxique). Pour l’autre plaque, n’ajoutez pas de CoCl2 et placez-la dans une chambre d’incubation mobile de CO2/O2/N2 avec le niveau d’O2 préréglé à 1 % (condition hypoxique) avant de la transférer dans le même incubateur.</li>
	<li>Après 24 h d’incubation, transférez les suspensions cellulaires dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL. Centrifuger les tubes à 500 × g pendant 5 min. Retirez et jetez complètement les surnageants d’abord à l’aide d’une pipette de 1 ml, puis d’une pipette de 100 μL, et remettez les granules de cellule en suspension dans 50 μL de 1x tampon d’échantillon SDS-PAGE.</li>
	<li>Faites chauffer les échantillons dans un bain d’eau bouillante pendant 10 min. Placez immédiatement le tube sur de la glace pendant 30 s, puis centrifugez à 16 000 × g pendant 30 s.</li>
	<li>Chargez 30 μL des échantillons nettoyés dans chaque fente d’un gel SDS PAGE à 10 puits, à 10 %, d’une épaisseur de 1,5 mm. Faites fonctionner le gel à 80 V pendant 30 min, puis augmentez la tension à 100 V et faites fonctionner pendant 1,5 h.</li>
	<li>À la fin de l’électrophorèse, transférer les protéines du gel vers une membrane PVDF en utilisant la méthode de transfert humide standard, avec un courant et une durée réglés à 400 mA et 1 h, respectivement.</li>
	<li>Bloquer la membrane dans le tampon de blocage (5% de lait (p/v) dans PBST (PBS+0,05% Tween-20)) pendant 1 h à température ambiante. Ensuite, découpez la pièce entre 30 kD et 40 kD pour la détection du contrôle de charge GAPDH et la pièce entre 50 kD et 70k D pour la détection des molécules CAR.</li>
	<li>Incuber les morceaux de 30 à 40 kD et de 50 à 70 kD avec un anticorps anti-GAPDH de souris (dilution de 1:2 000) et un anticorps anti-Flag de souris (dilution de 1:2 000), respectivement, dans 3 mL de tampon de blocage, soit à température ambiante pendant 2 h, soit à 4 °C pendant la nuit.</li>
	<li>Lavez les membranes avec du PBST à température ambiante sur une plate-forme à bascule pendant 3 x 5 min.</li>
	<li>Incuber les membranes avec un anticorps anti-souris de chèvre conjugué à la HRP (dilution 1:5 000) dans 3 mL de tampon bloquant à température ambiante pendant 1 h ; puis laver la membrane avec du PBST pendant 5 x 10 min.</li>
	<li>Développer les membranes en les incubant avec un substrat HRP, puis visualiser les bandes de protéines détectées à l’aide d’un analyseur d’images luminescentes.</li>
</ol>4. Évaluation in vitro de la dépendance à l’oxygène de la cytotoxicité médiée par les cellules CAR-T sensibles à l’hypoxie
<ol><li>Le jour 0, ensemencer 1 × 104 cellules cibles (cellules SKOV3-Luc) par puits expérimental dans 200 μL de DMEM contenant 10 % de FBS dans deux plaques de culture tissulaire noires à fond plat à 96 puits.</li>
	<li>Le jour 1, retirez soigneusement 100 μL de surnageant du haut de chaque puits. Ajoutez des cellules CAR-T ou des cellules T non transduites à des rapports effecteur-cible de 1:1, 2:1 et 4:1 dans 100 μL de milieu DMEM contenant 10 % de FBS.</li>
	<li>Placer une plaque dans une atmosphère à 21 % d’O2 et l’autre dans une atmosphère à 1 % d’O2 à l’aide d’une chambre d’incubation mobile de CO2/O2/N2 , comme décrit à l’étape 2.1. REMARQUE : Si une chambre d’incubation mobile de CO2/O2/N2 n’est pas disponible, l’ajout de CoCl2 au milieu de culture peut être utilisé pour imiter une condition hypoxique.</li>
	<li>Le jour 2, après 24 h de coculture, transférez soigneusement tout le surnageant (environ 150-200 μL) dans une nouvelle plaque à fond en U à 96 puits à l’aide d’une pipette. Conserver à -20 °C pour une détection ultérieure des cytokines, en suivant les procédures décrites à la rubrique 5.</li>
	<li>Ajouter 60 μL de 1x tampon de lyse passive à chaque puits expérimental des plaques noires à fond plat à 96 puits de l’étape 4.4. Ensuite, placez les plaques sur un agitateur et agitez pendant 30 min pour assurer une lyse cellulaire efficace.</li>
	<li>Ajoutez 60 μL de substrat de luciférase de luciférase dans chaque puits expérimental et mesurez immédiatement l’activité de la luciférase à l’aide d’un lecteur de microplaques.</li>
	<li>Calculer la cytotoxicité normalisée (%) à l’aide de l’équation (1) : Cytotoxicité normalisée (%) = 100 - <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66697/66697eq01.jpg" style="margin: auto;"> ×100 (1)</li>
</ol>5. Détection de la sécrétion d’IL-2 et d’IFN-γ par les cellules CAR-T sensibles à l’hypoxie
<ol><li>Le jour 0, préparer une dilution de 1:250 de l’anticorps de capture de l’IL-2 ou de l’IFN-γ dans le tampon d’enrobage. Ajouter 100 μL de l’anticorps dilué dans chaque puits d’une plaque ELISA à 96 puits et incuber la plaque à 4 °C pendant la nuit. REMARQUE : Le tampon d’enrobage est fabriqué en dissolvant 7,13 g de NaHCO3 et 1,59 g de Na2CO3 dans 1 L d’eau distillée et en ajustant le pH à 9,5.</li>
	<li>Le jour 1, retirez l’anticorps de capture non adsorbé en retournant vigoureusement la plaque, puis lavez les puits 3 fois avec 200 μL de tampon de lavage (PBS contenant 0,05 % de Tween 20).</li>
	<li>Ajouter 200 μL de diluant d’essai (PBS contenant 10 % de FBS) dans chaque puits et incuber à température ambiante pendant 1 h.</li>
	<li>Jetez la solution en retournant vigoureusement l’assiette ; ensuite, lavez les puits 3 fois avec 200 μL de tampon de lavage.</li>
	<li>Décongeler les échantillons/plaques surnageants congelés de l’étape 4.4 à température ambiante. Une fois complètement décongelés, diluez les échantillons et les étalons avec le diluant d’essai. Ajouter 100 μL d’échantillons ou d’étalons dilués dans chaque puits de la plaque ELISA revêtue et incuber à température ambiante pendant 2 h. REMARQUE : Pour la détection de l’IL-2, une dilution de 10 fois est recommandée, tandis que pour la détection de l’IFN-γ, une dilution de 50 fois est préférable.</li>
	<li>Retirez les échantillons et les étalons en retournant vigoureusement la plaque, puis lavez les puits 5 fois avec 200 μL de tampon de lavage par puits.</li>
	<li>Préparez une solution de détection fonctionnelle en diluant l’anticorps de détection IL-2 ou l’anticorps de détection de l’IFN-γ/streptavidine-HRP (SAv-HRP) dans un rapport de 1:250 dans le diluant de dosage. Ajouter 100 μL de la solution de détection de travail dans chaque puits et incuber la plaque à température ambiante pendant 1 h en secouant doucement.</li>
	<li>Jetez la solution et lavez les puits 7 fois avec 200 μL de tampon de lavage.</li>
	<li>Ajoutez 100 μL de réactif de substrat dans chaque puits et incubez la plaque à température ambiante pendant 30 min dans l’obscurité.</li>
	<li>Ajouter 50 μL de solution d’arrêt (1 M H2SO4) dans chaque puits. Lire immédiatement l’absorbance à 450 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Validation fonctionnelle de cellules CAR-T sensibles à l’hypoxie pour des tumeurs sélectives

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<li>Kroemer, G., Pouyssegur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+metabolism%3A+Cancer%27s+achilles%27+heel%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor cell metabolism: Cancer's achilles' heel.</a> Cancer Cell. 13 (6), 472-482 (2008).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1,5 mL Tube à centrifuger</td><td>QSP</td><td>509-GRD-Q</td><td>Supernageants et cellules cellection Protocole Étape 2,3,4</td></tr><tr><td>10 % ExpressCast PAGE</td><td>NCM biotech</td><td>P2012</td><td>Immunoblotting Protocole Étape 3</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>NCM biotech</td><td>20220812</td><td>Culture cellulaire Protocole Étape 4</td></tr><tr><td>Pipette de 10 mL</td><td>Yueyibio</td><td>YB-25H</td><td>Pipette Protocole Etape 1</td></tr><tr><td>10xTRIS-Glycine-SDS tampon d’électrophorèse</td><td>Epizyme</td><td>3673020</td><td>Immunoblotting Protocole Etape 3</td></tr><tr><td>15 mL Tube à centrifuger</td><td>Thermo Scientific</td><td>339650</td><td>Supernageants et cellules cellection Protocole Etape 1</td></tr><tr><td>25 cm2 EasYFlask</td><td>Thermo Scientific</td><td>156367</td><td>Culture cellulaire Protocole Etape 3,4</td></tr><tr><td>4x Protein SDS PAGE Loading Buffer</td><td>Takara</td><td>9173</td><td>Protocole d’immunoblotting Étape 3</td></tr><tr><td>Plaques de culture de tissus à fond plat à 6 puits</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td>T Cells culture Protocole Étape 1</td></tr><tr><td>Plaques de culture de tissus à fond plat noires à 96 puits</td><td>Greiner</td><td>655090</td><td>Essai de cytotoxicité Protocole Étape 4</td></tr><tr><td>Plaques ELISA à 96 puits</td><td>Corning</td><td>3590</td><td>Protocole ELISA Étape 5</td></tr><tr><td>Agitateur de plaques à 96 puits</td><td>QILINBEIER</td><td>MH-2</td><td>Shake Protocole Étape 4</td></tr><tr><td>Plaques de culture tissulaire à fond en U à 96 puits</td><td>Thermo Scientific</td><td>268200</td><td>Supernatants cellection Protocole Étape 4,5</td></tr><tr><td>anticorps anti-FLAG</td><td>Sigma</td><td>F1804-50UG</td><td>Protocole immunobuvard Étape 3</td></tr><tr><td>Carbinol</td><td>Sinopharm</td><td>10010061</td><td>Immunoblotting Protocole Étape 3</td></tr><tr><td>Incubateur de dioxyde de carbone</td><td>Thermo Scientific</td><td>360</td><td>Culture cellulaire Protocole Étape 1,2,3,4</td></tr><tr><td>Plaque de comptage</td> cellulaire <td>Hausser scientific</td><td>1492</td><td>Comptage cellulaire Protocole Étape 1,3,4</td></tr><tr><td>CELLection Pan Mouse IgG Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>11531D</td><td>Mouse IgG beads magnétiques Protocole Etape 1</td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002432</td><td>Culture cellulaire Protocole Etape 1,3,4</td></tr><tr><td>Système d’imagerie sur gel de chimiluminescence</td><td>BIO-RAD</td><td>12003154</td><td>Immunoblotting Protocole Etape 3</td></tr><tr><td>Solution de chlorure de cobalt (0,5 M)</td><td>bioleaper</td><td>BR4000203</td><td>État hypoxique Protocole Etape 2,3,4</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-103- CV</td><td>Culture cellulaire Protocole Etape 4</td></tr><tr><td>Balance électronique</td><td>Sartorius</td><td>PRACTUM612-1CN</td><td>pesée Protocole Etape 5</td></tr><tr><td>FBS</td><td>BI</td><td>04-001-1ACS</td><td>Culture cellulaire Protocole Etape 3,4</td></tr><tr><td>GAPDH MAb de souris</td><td>ABclonal</td><td>AC002</td><td>Protocole d’immunobuvardage Etape 3</td></tr><tr><td>Appareil d’électrophorèse sur gel</td><td>BIO-RAD</td><td>1645070</td><td>Protocole Immunoblotting Étape 3</td></tr><tr><td>Lecteurs de microplaques GloMax</td><td>Promega</td><td>GM3000</td><td>Mesure de l’activité de la luciférase Protocole 4</td></tr><tr><td>Anti-Souris IgG (H+L)</td><td>Yeasen</td><td>P1126151</td><td>Immunoblotting Protocole Étape 3</td></tr><tr><td>Centrifugeuse de microcongélation à grande vitesse</td><td>eppendorf</td><td>5810&nbsp ; R</td><td>Culture cellulaire Protocole Étape 1</td></tr><tr><td>IFN-&gamma humain ; Ensemble ELISA</td><td>BD</td><td>555142</td><td>Protocole ELISA Étape 5 Éléments : IFN-&gamma humain recombinant ; étalon lyophilisé, anticorps de détection biotine anti-IFN-&gamma humain ; , Anticorps de capture anti-IFN-&gamma humain purifié, Réactif enzymatique Conjugué streptavidine-peroxydase de raifort (SAv-HRP)</td></tr><tr><td>Ensemble ELISA IL-2 humain</td><td>BD</td><td>555190</td><td>Protocole ELISA Étape 5 Items : IL-2 humaine recombinante étalon lyophilisée, Anticorps de détection Biotine Anti-IL-2 humaine, Anticorps de capture IL-2 purifié Anti-humain IL-2, Réactif enzymatique Conjugué streptavidine-peroxydase de raifort (SAv-HRP)</td></tr><tr><td>IL-15</td><td>R& D systems</td><td>P40933</td><td>Culture de cellules T Protocole Étape 1</td></tr><tr><td>IL-21</td><td>Novoprotéine</td><td>GMP-CC45</td><td>Culture de cellules T Protocole Étape 1</td></tr><tr><td>IL-7</td><td>R& D systems</td><td>P13232</td><td>Culture de cellules T Protocole Étape 1</td></tr><tr><td>Microscope inversé</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td>Culture cellulaire Protocole Étape 1,3,4</td></tr><tr><td>Jurkat</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td>Construction CAR-Jurkat Protocole Étape 3</td></tr><tr><td>LSRFortessa</td><td>BD</td><td>LSRFortessa</td><td>Cytométrie en flux Protocole Étape 2</td></tr><tr><td>Système</td> <td>de dosage de la luciférasePromega</td><td>E1501</td><td>luciférase rapporteur essai Protocole Étape 4 Éléments : Tampon de lyse passive, substrat de luciférase luciluciole</td></tr><tr><td>Lecteur de microplaques</td><td>BioTek</td><td>HTX</td><td>ELISA Protocole Étape 5</td></tr><tr><td>mobile CO2/O2/N2 Chambre d’incubation</td><td>China Innovation Instrument Co., Ltée.</td><td>Smartor118</td><td>Condition hypoxique Protocole Étape 2, 3, 4</td></tr><tr><td>Souris Anti-Hexa Histidine</td><td>tag Sigma</td><td>SAB2702218</td><td>Immunoblotting Protocole Étape 3</td></tr><tr><td>NcmBlot Rapid Transfer Buffer</td><td>NCM biotech</td><td>WB4600</td><td>Immunoblotting</td></tr><tr><td>NcmECL Ultra</td><td>NCM biotech</td><td>P10300</td><td>Protocole d’immunoblotting Étape 3 Articles : NcmECL Ultra Luminol/Enhancer Reagent (A), NcmECL Ultra Stabilized Peroxide (B)&nbsp ;</td></tr><tr><td>Plaques plates à 48 puits recouvertes de NovoNectin</td><td>Novoprotein</td><td>GMP-CH38</td><td>Construction des cellules CAR-T Protocole Étape 1</td></tr><tr><td>OPD (dichlorhydrate d’o-phénylènediamine) ensemble de comprimés Sigma</td><td></td><td>P9187</td><td>Réactif de substrat Étape 5 Articles : Comprimé OPD (feuille d’argent),comprimé de peroxyde d’hydrogène uré (feuille d’or)</td></tr><tr><td>Anti-DYKDDDDK</td><td>Biolegend</td><td>637310</td><td>Cytométrie en flux Protocole Étape 2</td></tr><tr><td>Sulfate de protamine</td><td>Sigma</td><td>P3369-1OG</td><td>Infection par lentivirus Protocole Étape 1</td></tr><tr><td>Marqueur protéique 10 Kda-250 KDa</td><td>Epizyme</td><td>WJ102</td><td>Protocole d’immunobuvard Étape 3</td></tr><tr><td>&nbsp ; Souris NA/LE purifiées Anti-Human CD3</td><td>BD</td><td>566685</td><td>T CellS Protocole Etape 1</td></tr><tr><td>Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28</td><td>BD</td><td>555725</td><td>T CellS Protocole Etape 1</td></tr><tr><td>Membrane PVDF</td><td>Millipore</td><td>168627</td><td>Immunoblotting Protocol Etape 3</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CVRC</td><td>Culture cellulaire Protocol Etape 3</td></tr><tr><td>Lait écrémé en poudre</td><td>Yeasen</td><td>S9129060</td><td>Protocole d’immunobuvard Étape 3</td></tr><tr><td>SKOV3-Luc</td><td>ATCC</td><td>HTB-77</td><td>Essai de cytotoxicité Protocole 4</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>NCM biotech</td><td>C125C1</td><td>Culture cellulaire Protocole Etape 4</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sinopharm</td><td>30189328</td><td>Protocole d’immunobuvard Étape 3 Bain-marie</td></tr><tr><td></td><td></td><td>NB014467 de quillard Chauffage Protocole Étape 1</td><td></td></tr> <tr><td>X-VIVO 15&nbsp ;</td><td>LONZA</td><td>04-418Q</td><td>Milieu de culture de lymphocytes sans sérum Protocole Étape 1</td></tr></tbody></table>

génération et vérification fonctionnelle de cellules t à récepteur antigénique chimérique sensible à l’hypoxie

Generation and Functional Verification of Hypoxia-Sensitive Chimeric Antigen Receptor-T Cells

La fusion du domaine ODD de HIF-1α avec la fraction CAR représente une stratégie primaire pour générer un CAR sensible à l’hypoxie. Le CAR ciblant HER2 sensible à l’hypoxie analysé dans cette étude, nommé HER2-BBz-ODD, a été construit à l’aide de cette stratégie en intégrant la séquence ODD dans son HER2-BBz conventionnel (Figure 1A). Dans cette étude, nous avons utilisé la transduction lentivirale pour exprimer HER2-BBz-ODD CAR ou HER2-BBz CAR et avons ensuite examiné leur sensibilité à l’oxygène dans deux types de cellules : les PBMC humaines et les cellules T Jurkat.
Le premier examen porte sur l’expression de CAR dans des conditions hypoxiques par rapport à des conditions normoxiques, qui a été réalisée à la fois dans des cellules T dérivées de PBMC transduites par CAR-transduction par cytométrie en flux et dans des cellules T Jurkat transduites par CAR-transduits par western blot. Dans le cadre de cellules T dérivées de PBMC transduites par CAR, nous avons observé que HER2-BBz-ODD CAR avait une expression significativement plus élevée sous 1 % O2 que sous 21 % O2 en termes de pourcentage de cellules CAR-positives et d’intensité de fluorescence médiane (MFI) (Figure 1B). L’analyse immunobuvante des lymphocytes T Jurkat transduits par CAR-CAR a également confirmé l’induction dépendante de l’hypoxie de HER2-BBz-ODD.
Il convient de noter que, dans ce contexte, l’état hypoxique peut être commodément imité en ajoutant du CoCl2, un inducteur chimique de l’hypoxie, au milieu de culture. Comme l’illustre la figure 1C, nos résultats d’immunoblot ont démontré que l’exposition à 50 ou 200 μM CoCl2 récapitulait l’effet de l’exposition à 1 % d’O2, induisant de manière marquée l’expression du CAR HER2-BBz-ODD mais pas celle du CAR HER2-BBz. La caractérisation fonctionnelle des cellules CAR-T sensibles à l’hypoxie a été réalisée avec des cellules CAR-T dérivées de PBMC. Dans l’étude, une lignée cellulaire SKOV-3 porteuse de luciférase a été utilisée comme lignée cellulaire cible. Cette configuration nous a permis de mesurer l’activité de la luciférase associée aux cellules cibles comme indicateur pour évaluer la cytotoxicité médiée par les cellules CAR-T co-cultivées.
Comme le montre la figure 1D, les mesures ont indiqué que les cellules CAR-T HER2-BBz tuent efficacement les cellules cibles, que l’atmosphère soit normoxique ou hypoxique. En revanche, les cellules CAR-T HER2-BBz-ODD ont montré une cytotoxicité significativement plus faible dans des conditions normoxiques pour les trois rapports E :T examinés. Cependant, leur cytotoxicité était significativement accrue lorsqu’ils étaient exposés à des conditions hypoxiques. Les niveaux surnageants d’IL-2 et d’IFN-γ ont également été mesurés par ELISA après co-culture de cellules CAR-T avec des cellules cibles pendant 24 h. Pour les deux cytokines, une sécrétion plus élevée sous 1 % d’O2 par rapport à 21 % d’O2 a été observée pour les cellules CAR-T HER2-BBz-ODD, ce qui est cohérent avec les données de cytotoxicité. En revanche, les cellules CAR-T HER2-BBz ont montré une sécrétion plus faible des deux cytokines sous 1 %d’O2 par rapport à 21 % d’O2, ce qui indique un impact négatif de l’hypoxie sur l’activité cellulaire (Figure 1E). Pris ensemble, ces résultats ont validé de manière convaincante la nature sensible à l’hypoxie de HER2-BBz-ODD CAR.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66697/66697fig01.jpg"> Figure 1 : Construction et caractérisation de cellules CAR-T sensibles à l’hypoxie. (A) Représentation schématique des conceptions d’une cellule CAR-T sensible à l’hypoxie, HER2-BBz-ODD, et de son homologue conventionnel, HER2-BBz. Les deux CARs se composent d’un peptide signal CD8α N-terminal, d’une étiquette FLAG, d’un scFv humain ciblant HER2, d’une charnière CD8 et d’un domaine transmembranaire, et d’une partie intracellulaire composée d’un domaine de costimulation de 4-1BB, d’un domaine de signalisation CD3ξ, d’un IRES et d’un EGFP. HER2-BBz-ODD diffère de HER2-BBz par la fusion d’un domaine ODD avec le C-terminal du domaine de signalisation CD3ξ, permettant son expression hypoxique dépendante en favorisant sa dégradation dépendante de l’ubiquitine dans des conditions normoxiques. (B, C) Évaluations de l’expression dépendante de l’oxygène de HER2-BBz-ODD CAR. (B) Une évaluation a été réalisée avec des cellules CAR-T humaines dérivées de PBMC après culture sous 1 % ou 21 % d’O2 pendant 24, 48 ou 72 heures à l’aide de la cytométrie en flux. (C) L’autre évaluation a été réalisée avec des cellules T Jurkat transduites par CAR, où les lysats cellulaires ont été récoltés 24 h après la culture sous 21 % d’O2, 50 ou 200 μM CoCl2, ou 1 % d’O2, et analysés pour l’expression de CAR à l’aide du western blot, avec des cellules HER2-BBz transduites en CAR incluses comme témoin. (D, E) Cytotoxicité in vitro et sécrétion de cytokines par les cellules CAR-T dans différentes conditions d’oxygène. (D) Les cellules CAR-T ont été co-cultivées avec des cellules SKOV3 exprimant la luciférase des luciféroses à des rapports E :T indiqués inférieurs à 1 % ou 21 % O2. Après 24 heures de co-culture, l’efficacité de destruction des cellules cibles a été déterminée en mesurant la variation de l’activité de la luciférase associée aux lucioles associée aux cellules par rapport à celle des cellules T non transduites. (E) Les surnageants ont été collectés pour la détection de l’IL-2 et de l’IFN-γ sécrétés. Les résultats sont affichés sous la forme de la moyenne ± SEM (n = 3 donneurs sains) (****p &lt; 0,0001). Abréviations : scFv = variable de fragment à chaîne unique ; CAR = récepteur antigénique chimérique. Les panneaux C et D sont adaptés de Liao et al.31. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66697/66697fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Génération et vérification fonctionnelle de cellules T à récepteur antigénique chimérique sensible à l’hypoxie

Extensive studies have proven the promise of chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy in treating hematological malignancies. However, treating ...

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