Diagnostics basés sur CRISPR au point d’intervention avec réactifs prémélangés et lyophilisés
16 août 2024
Ici, nous présentons la préparation étape par étape de l’amplification isotherme prémélangée et lyophilisée basée sur la recombinase et des réactions basées sur CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), qui peuvent être utilisées pour la détection de biomarqueurs d’acides nucléiques d’agents pathogènes de maladies infectieuses ou d’autres marqueurs génétiques d’intérêt.
Nous développons des tests sur le lieu d’intervention pour détecter ces matériaux de maladies infectieuses. Ce test utilise l’amplification isotherme des acides nucléiques et la détection basée sur CRISPR. Avec une précision osmotique élevée similaire à la PCR, ils peuvent détecter de petites différences de séquence, y compris le polymorphisme nucléotidique unique, et peuvent être multiples.
CRISPR, les réactions osmotiques contiennent plusieurs composants et étapes et sont difficiles à réaliser sur le lieu de soins. Comme les osmotiques sont très sensibles, il existe un risque de contamination par transfert qui peut conduire à de faux résultats. Heureusement, ce problème peut être atténué si nous simplifions les procédures des réactions.
Nous proposons une méthode facile à utiliser pour détecter nos pathogènes et marqueurs génétiques à l’aide de la recombinase, de l’amplification isotherme et des réactifs basés sur CRISPR. Ces réactifs sont simples à stocker et à utiliser. Nous proposons également des conseils pour résoudre les problèmes courants lors de l’utilisation de ces méthodes et réactifs, ce qui facilite leur utilisation par les gens.
Le protocole utilise ici des réactifs CRISPR, qui facilitent le transport et le stockage. Les réactifs lyophilisés peuvent facilement être réhydratés aux points d’utilisation et conservent des efficacités d’amplification et de détection élevées. Nous espérons appliquer les technologies de diagnostic CRISPR pour détecter les maladies infectieuses endémiques et émergentes.
Si ce test peut être effectué régulièrement et correctement sur le lieu de soins, cela pourrait éclairer les options de traitement antiviral et antibiotique, potentiellement sauver des vies, réduire la surutilisation de médicaments et le développement de la résistance.
Aperçu
Cet article présente une méthode pour développer des tests de point-of-care qui utilisent l'amplification isothermique des acides nucléiques et la détection basée sur CRISPR pour identifier le matériel génétique des maladies infectieuses. L'approche vise à améliorer la sensibilité et la précision tout en abordant des défis tels que les risques de contamination.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Diagnostic des maladies infectieuses
- Techniques d'amplification des acides nucléiques
- Technologie CRISPR
Contexte
- Les tests de point-of-care sont cruciaux pour le diagnostic rapide des maladies infectieuses.
- L'amplification isothermique permet une détection efficace des acides nucléiques.
- La technologie CRISPR offre une haute sensibilité pour l'identification du matériel génétique.
- Les risques de contamination peuvent conduire à de faux résultats dans les analyses sensibles.
Objectif de l'étude
- Développer une procédure simplifiée pour les réactions basées sur CRISPR.
- Améliorer la précision de la détection des petites variations génétiques.
- Atténuer les risques de contamination dans les contextes de point-of-care.
Méthodes utilisées
- Préparation de réactifs prémélangés et lyophilisés pour l'amplification isothermique.
- Mise en œuvre de méthodes de détection basées sur CRISPR.
- Évaluation de la sensibilité et de la spécificité dans la détection des biomarqueurs d'acides nucléiques.
- Optimisation des conditions de réaction pour réduire les risques de contamination.
Résultats principaux
- La méthode développée a démontré une haute sensibilité pour la détection des marqueurs génétiques.
- Les risques de contamination ont été considérablement réduits grâce à la simplification des procédures.
- Les résultats étaient comparables aux méthodes PCR traditionnelles.
- L'approche est adaptée aux applications de point-of-care.
Conclusions
- Cette étude présente une méthode viable pour la détection rapide des agents pathogènes des maladies infectieuses.
- Les tests basés sur CRISPR peuvent être efficacement simplifiés pour un usage pratique.
- Les travaux futurs pourraient se concentrer sur l'amélioration de la robustesse des tests.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Premixed and freeze-dried CRISPR-based diagnostic reagents enable rapid, accurate detection of infectious disease genetic markers at the point of care, addressing operational bottlenecks in decentralized testing. This approach reduces manual handling complexity and contamination risk, supporting scalable deployment in resource-limited and field settings. The method enhances predictive confidence for early intervention and informs therapeutic decision-making in real time.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid interrogation of pathogen genetic markers for target validation in infectious disease research.
- Supports biological de-risking by providing high-sensitivity detection of single nucleotide polymorphisms.
- Facilitates portfolio triage by distinguishing between closely related pathogen strains.
Screening & Assay Development
- Delivers ready-to-use, validated reagent systems for streamlined assay development workflows.
- Improves assay reproducibility and standardization through premixed, lyophilized formats.
- Enables scalable screening of clinical or environmental samples with minimal instrumentation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling detection of disease-relevant nucleic acid signatures.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by providing robust, field-deployable diagnostics.
- Reduces risk in advancing diagnostic candidates by demonstrating stability and efficiency of reagents.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates from early discovery through translational research, supporting workflows from target identification to preclinical validation of diagnostic platforms.
- Discovery Biology: Provides high-confidence detection of genetic targets for hypothesis testing and mechanistic studies.
- Screening: Offers standardized, quantitative outputs for comparing sample conditions and assay performance.
- Analytics: Enables sensitive fluorescence-based readouts for robust data analysis and decision support.
- Translational Research: Bridges laboratory and field applications, supporting biomarker-driven diagnostic development.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable reagent platform adaptable to diverse pathogen targets and sample types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in pathogen detection.
- Operational Value: Simplifies workflows, enhances reproducibility, and supports cold-chain independent logistics.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions for diagnostic candidates and reduces late-stage risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of diagnostic assets for emerging and endemic diseases.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid amplification and CRISPR-based assay design.
- Needs access to lyophilization equipment and fluorescence microplate readers for full workflow execution.
- Demands cross-team standardization of reagent preparation and handling protocols.
- Adaptable to various sample types but may require optimization for specific pathogens.
- Stability and efficiency validated for at least eight months at -20°C, supporting extended deployment.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:19
Preparation of Lyophilized Reverse Transcriptase‐Recombinase Polymerase Amplification (RT‐RPA) Reactions
5:02
Preparation of Lyophilized CRISPR‐Cas13a Premixed Detection Reagents for Nucleic Acid Biomarkers Detection
7:45
RT‐RPA Nucleic Acid Amplification and CRISPR‐Cas13 Nucleic Acid Detection
