Name: Diagnostics basés sur CRISPR au point d’intervention avec réactifs prémélangés et lyophilisés (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-16T12:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Découvrez une méthode de diagnostic CRISPR au point d'intervention utilisant des réactifs lyophilisés prémélangés pour la détection d'agents pathogènes infectieux. Cette approche simplifiée réduit les risques de contamination.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Protocole de diagnostic moléculaire optimisé basé sur CRISPR pour une utilisation sur le lieu d’intervention

<ol><li>Gootenberg, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+detection+with+CRISPR-Cas13a%2FC2c2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2.</a> Science. 356 (6336), 438-442 (2017).</li>
<li>Kaminski, M. M., Abudayyeh, O. O., Gootenberg, J. S., Zhang, F., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based diagnostics.</a> Nat Biomed Eng. 5 (7), 643-656 (2021).</li>
<li>Makarova, K. S., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annotation+and+classification+of+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Annotation and classification of CRISPR-Cas systems.</a> Methods Mol Biol. (1311), 47-75 (2015).</li>
<li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas12a+target+binding+unleashes+indiscriminate+single-stranded+DNase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity.</a> Science. 360 (6387), 436-439 (2018).</li>
<li>Arizti-Sanz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+Cas13-based+assays+for+the+fast+identification+of+SARS-CoV-2+and+its+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Simplified Cas13-based assays for the fast identification of SARS-CoV-2 and its variants.</a> Nat Biomed Eng. 6 (8), 932-943 (2022).</li>
<li>Broughton, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas12-based+detection+of+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2.</a> Nat Biotechnol. 38 (7), 870-874 (2020).</li>
<li>Patchsung, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplexed+Cas13-based+assay+with+point-of-care+attributes+for+simultaneous+COVID-19+diagnosis+and+variant+surveillance%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR+J%22%5BJournal%5D)">A multiplexed Cas13-based assay with point-of-care attributes for simultaneous COVID-19 diagnosis and variant surveillance.</a> CRISPR J. 6 (2), 99-115 (2023).</li>
<li>Patchsung, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+validation+of+a+Cas13-based+assay+for+the+detection+of+SARS-CoV-2+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Clinical validation of a Cas13-based assay for the detection of SARS-CoV-2 RNA.</a> Nat Biomed Eng. 4 (12), 1140-1149 (2020).</li>
<li>Gootenberg, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+and+portable+nucleic+acid+detection+platform+with+Cas13%2C+Cas12a%2C+and+Csm6%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6.</a> Science. 360 (6387), 439-444 (2018).</li>
<li>Lee, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+CRISPR-based+diagnostic+for+field-applicable+detection+of+Plasmodium+species+in+symptomatic+and+asymptomatic+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive CRISPR-based diagnostic for field-applicable detection of Plasmodium species in symptomatic and asymptomatic malaria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (41), 25722-25731 (2020).</li>
<li>Myhrvold, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field-deployable+viral+diagnostics+using+CRISPR-Cas13%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Field-deployable viral diagnostics using CRISPR-Cas13.</a> Science. 360 (6387), 444-448 (2018).</li>
<li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+detection+with+CRISPR%2FCas+system+from+applications+to+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Analyt+Chem%22%5BJournal%5D)">Versatile detection with CRISPR/Cas system from applications to challenges.</a> Trends Analyt Chem. 135, 116150(2021).</li>
<li>Yao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas13a-based+detection+for+bovine+viral+diarrhea+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas13a-based detection for bovine viral diarrhea virus.</a> Front Vet Sci. 8, 603919(2021).</li>
<li>Kellner, M. J., Koob, J. G., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHERLOCK%3A+nucleic+acid+detection+with+CRISPR+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPR nucleases.</a> Nat Protoc. 14 (10), 2986-3012 (2019).</li>
<li>Selvam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RT-LAMP+CRISPR-Cas12%2F13-based+SARS-CoV-2+detection+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostics+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">RT-LAMP CRISPR-Cas12/13-based SARS-CoV-2 detection methods.</a> Diagnostics (Basel). 11 (9), 1646(2021).</li>
<li>Carter, C., Akrami, K., Hall, D., Smith, D., Aronoff-Spencer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyophilized+visually+readable+loop-mediated+isothermal+reverse+transcriptase+nucleic+acid+amplification+test+for+detection+Ebola+Zaire+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Lyophilized visually readable loop-mediated isothermal reverse transcriptase nucleic acid amplification test for detection Ebola Zaire RNA.</a> J Virol Methods. 244, 32-38 (2017).</li>
<li>Bhardwaj, P., Kant, R., Behera, S. P., Dwivedi, G. R., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+diagnostic+with+CRISPR%2FCas%3A+Beyond+nucleic+acid+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Next-generation diagnostic with CRISPR/Cas: Beyond nucleic acid detection.</a> Int J Mol Sci. 23 (11), 6052(2022).</li>
<li>Twistamp. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Twistamp%C2%AE+assay+design+manual%22">Twistamp® assay design manual</a>. , (2023).</li>
<li>Qian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+isothermal+amplification+assay+for+viral+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">An enhanced isothermal amplification assay for viral detection.</a> Nat Commun. 11 (1), 5920(2020).</li>
<li>Ghouneimy, A., Mahas, A., Marsic, T., Aman, R., Mahfouz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+diagnostics%3A+Challenges+and+toward+point-of-care+applications%5BTitle%5D)+AND+%22ACSSynth+Biol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based diagnostics: Challenges and toward point-of-care applications.</a> ACSSynth Biol. 12 (1), 1-16 (2023).</li>
<li>Jones, K. L., Drane, D., Gowans, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+storage+of+DNA-free+RNA+for+use+in+vaccine+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Long-term storage of DNA-free RNA for use in vaccine studies.</a> Biotechniques. 43 (5), 675-681 (2007).</li>
<li>Fang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+strand-displacement+DNA+amplification+by+a+contactless+electrochemical+microsystem+using+interdigitated+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of strand-displacement DNA amplification by a contactless electrochemical microsystem using interdigitated electrodes.</a> Lab Chip. 12 (17), 3190-3196 (2012).</li>
<li>Mok, E., Wee, E., Wang, Y., Trau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+evaluation+of+molecular+enhancers+of+the+isothermal+exponential+amplification+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Comprehensive evaluation of molecular enhancers of the isothermal exponential amplification reaction.</a> Sci Rep. 6 (1), 37837(2016).</li>
<li>Wan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+test+kit+for+visual+loop-mediated+isothermal+amplification+of+Salmonella+in+spiked+ready-to-eat+fruits+and+vegetables%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a test kit for visual loop-mediated isothermal amplification of Salmonella in spiked ready-to-eat fruits and vegetables.</a> J Microbiol Methods. 169, 105830(2020).</li>
<li>Curti, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+lyophilized+CRISPR-Cas12+assay+for+a+ensitive%2C+specific%2C+and+rapid+detection+of+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a lyophilized CRISPR-Cas12 assay for a ensitive, specific, and rapid detection of SARS-CoV-2.</a> Viruses. 13 (3), 420(2021).</li>
<li>Joung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+SARS-CoV-2+with+SHERLOCK+one-pot+testing%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK one-pot testing.</a> N Engl J Med. 383 (15), 1492-1494 (2020).</li>
</ol>

Le diagnostic basé sur CRISPR pour la détection de biomarqueurs d’acides nucléiques a été signalé pour la première fois en 2017 1,2,3,4, et depuis lors, il a fait ses preuves en tant que diagnostic de nouvelle génération avec des tests approuvés par la Food and Drug Administration (FDA), en particulier pour la détection de l’ARN du coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère 2 (SRAS-CoV-2), dans plusieurs pays 5,6,7,8. Au-delà de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19), les technologies se sont avérées efficaces pour détecter divers virus et bactéries 9,10,11,12,13, des mutations et des délétions de maladies génétiques, et peuvent être modifiées pour détecter des biomarqueurs de protéines et de petites molécules 2,12. Les diagnostics basés sur CRISPR combinent souvent des méthodes d’amplification isotherme, telles que l’amplification par polymérase recombinase (RPA) ou l’amplification isotherme médiée par boucle (LAMP)14,15, avec une détection basée sur CRISPR utilisant des enzymes associées à CRISPR (Cas) guidées par ARN avec une activité endonucléase « collatérale » après la reconnaissance de la cible3. La double utilisation de l’amplification isotherme et de la détection basée sur CRISPR confère plusieurs attributs souhaitables aux technologies, en particulier une précision de diagnostic élevée proche de celle de la réaction en chaîne par polymérase (PCR) de référence, et la capacité de multiplexer et de détecter de petites différences de séquence, y compris les polymorphismes mononucléotidiques 1,9.
Cependant, les versions les plus précises des diagnostics basés sur CRISPR contiennent plusieurs composants et étapes et peuvent être compliquées à réaliser avec des non-experts ou sur le lieu d’intervention (POC). Pour relever ce défi d’étendre l’utilisation de diagnostics basés sur CRISPR très précis aux paramètres POC, nous avons développé des protocoles pour préparer des réactions d’amplification isotherme prémélangées, lyophilisées, basées sur la recombinase et des réactions de détection basées sur CRISPR, qui sont faciles à utiliser et à stocker7. Ces protocoles devraient compléter les excellents protocoles existants sur les diagnostics basés sur CRISPR14, qui contiennent des informations supplémentaires sur la production de composants biochimiques nécessaires aux diagnostics basés sur CRISPR7, les directives de conception1 et les formulations utilisant des techniques alternatives d’amplification isotherme 2,14,15,16 et des enzymes Cas 12. En fin de compte, nous espérons que les diagnostics basés sur CRISPR pourront aider à réaliser une détection nucléique rapide, peu coûteuse et sensible dans des environnements où des analyses portables et sans instrument sont nécessaires 1,9,17.
Nous utilisons principalement la combinaison de la détection basée sur la RPA et Cas13 dans nos protocoles. La RPA fonctionne à des températures proches de la température ambiante (37-42 °C) et nécessite donc peu d’énergie et d’équipement. D’autres réactions d’amplification isotherme nécessitent des températures plus élevées (LAMP, 60-65 °C ; amplification par déplacement de brin (SDA), 60 °C ; réaction d’amplification exponentielle (EXPAR), 55 °C ; et amplification dépendante de l’hélicase (HDA), 65 °C)2. La conception des amorces RPA n’est pas non plus complexe, contrairement aux amorces LAMP, et peut être étendue à l’amplification multiplexée 7,9,14. Même si le multiplexage au-delà de deux cibles avec la RPA est difficile dans la pratique, il existe des directives claires sur la façon de concevoir des amorces RPA multiplexées pour minimiser les interférences18.
Bien que la contamination par transfert reste un problème majeur dans le flux de travail en deux étapes, les amplicons générés de RPA sont de petite taille et moins susceptibles de provoquer une contamination par transfert par rapport aux grands amplicons concatémériques de LAMP14. Les amorces RPA peuvent être conçues selon les directives standard14 : elles ont généralement une longueur de 25 à 35 nucléotides avec des températures de fusion de 54 à 67 °C. La taille de l’amplicon doit être inférieure à 200 paires de bases. L’enzyme transcriptase inverse (RT) peut être ajoutée à la RPA pour permettre l’amplification de l’ARN, et dans la transcription inverse-RPA (RT-RPA), une autre enzyme Ribonuclease H (RNase H) est généralement ajoutée en petites quantités pour aider à résoudre l’hybride ARN : ADN résultant et favoriser la réaction d’amplification 5,19. Pour permettre la transcription de T7 pour la détection basée sur Cas13, le promoteur de l’ARN polymérase T7 peut être placé à l’extrémité 5' de l’amorce RPA directe.
Une fois que les amplicons sont générés à partir de la RPA, ils peuvent être détectés avec des enzymes Cas programmées par l’ARNcr. Parmi les diverses enzymes Cas qui peuvent être utilisées pour la détection d’amplicons, nous préférons les variants de Cas13 ciblant l’ARN en raison de leur activité de clivage élevée1 et de leurs préférences de clivage polynucléotidique bien caractérisées 7,9, ce dernier pouvant être utilisé pour la détection multiplexée. La séquence d’ARNcr de Cas13 est conçue pour être complémentaire (complément inverse) au site cible dans l’ARN produit avec des séquences d’espacement et de répétition directe (DR). La séquence d’ARNcr et les amorces RPA ne doivent pas se chevaucher, afin d’éviter la détection indésirable de produits d’amplification hors cible, ce qui augmente le bruit de fond et les faux positifs14.
La détection basée sur le cas repose sur différentes modalités de détection pour surveiller le clivage des molécules d’acide nucléique rapporteures (ARN rapporteurs pour les réactions basées sur Cas13)1,2,14. Les différentes modalités de détection comprennent la colorimétrie, les lectures électrochimiques, la fluorescence, les lectures de séquençage et les bandes de flux latéral2. Nous nous concentrons sur la lecture de la fluorescence à partir d’une variété de fluorophores et de rapporteurs tels que la cyanine 5 (Cy5), la rhodamine X (ROX) et la carboxyfluorescéine (FAM), qui peuvent être efficacement excités à l’aide d’une seule source de lumière LED bleue, et leur fluorescence analysée par un lecteur de microplaques ou un thermocycleur en temps réel 7,14. De plus, la lecture de la fluorescence est facile à configurer et permet une surveillance continue, ce qui permet une quantification en temps réel. La préamplification RPA multiplexée et la détection multiplexée basée sur Cas13 à l’aide d’enzymes Cas peuvent être combinées avec des lectures de fluorescence multicolores pour la détection simultanée de plusieurs cibles génétiques 2,7.
Dans nos protocoles, nous amplifions d’abord de manière isotherme l’ARN avec le RT-RPA en ajoutant l’échantillon d’ARN à la forme lyophilisée du réactif RT-RPA (Figure 1). Au cours de la RT-RPA, le promoteur T7 est ajouté à l’amplicon d’ADN double brin généré. Par la suite, les produits RPA sont transférés vers la détection lyophilisée basée sur Cas13, qui contient également de l’ARN polymérase T7. Cette réaction de détection convertira les amplicons d’ADN en ARN (via l’ARN polymérase T7), qui peut être facilement détecté avec Cas13 programmé par l’ARNcr. Cas13 activé par la cible clivra les molécules rapporteures pour produire un signal de fluorescence détectable 2,7,14. Bien que les protocoles ici concernent la détection par Leptotrichia wadei (LwaCas13a), ils peuvent être étendus à la détection simultanée et multiplexée d’un maximum de quatre cibles à l’aide des enzymes orthogonales Cas13 et Cas12 7,9. Les réactions de détection basées sur la RPA et le Cas peuvent également être combinées dans un seul tube, bien qu’avec une perte de sensibilité14.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66703/66703fig01v2.jpg"> Figure 1 : Flux de travail de détection basé sur CRISPR. Le flux de travail illustre la détection de deux gènes cibles. Tout d’abord, les régions d’intérêt au sein de la cible d’ADN sont amplifiées de manière isotherme avec la RPA ; la réaction peut être réalisée par transcription inverse (RT-RPA) lors de la détection de cibles d’ARN. Par la suite, la transcription T7 convertit les amplicons d’ADNdb en ARN, qui sont à leur tour reconnus par des complexes Cas13-crRNA capables de déclencher une activité RNase collatérale lors de la liaison à la cible. Le clivage des rapporteurs de fluorescence éteints produit des signaux de fluorescence qui peuvent être surveillés à l’aide d’un lecteur de microplaques, visualisés par un transilluminateur LED ou utilisés avec un thermocycleur en temps réel. Abréviations : CRISPR = répétitions palindromiques courtes groupées et régulièrement espacées ; RT = transcription inverse ; RPA = amplification par polymérase recombinase ; Cas = protéine associée à CRISPR ; LED = diode électroluminescente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66703/66703fig01largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Les principales caractéristiques des protocoles présentés ici sont les formulations de prémélange pour la lyophilisation. Le prémélange simplifie l’utilisation de la réaction et améliore la reproductibilité, mais de nombreux composants de la détection basée sur la RPA et Cas, en particulier la transcription inverse et certains cofacteurs labiles tels que l’ATP, ne sont pas stables en solution. Par conséquent, nous formulons les solutions prémélangées de manière à ce qu’elles puissent être lyophilisées pour un stockage à long terme et un transport et un déploiement faciles 1,9,20. Des réactifs prémélangés et lyophilisés contribuent également à améliorer la sensibilité de détection, car un volume d’échantillon plus élevé (et donc un apport d’ADN/ARN plus élevé) peut être ajouté pour reconstituer la réaction10. Dans nos formulations, nous utilisons principalement le tréhalose21 comme cryoprotecteur dans les réactions de détection lyophilisées basées sur la RPA et le cas7. En plus de la préservation des réactifs, le tréhalose favorise également les réactions en augmentant la stabilisation enzymatique 16,22,23,24 et en diminuant les températures de fusion de l’ADNdb 23. L’exploration d’autres stabilisants 5,7,21,25,26 au-delà du tréhalose pourrait produire des formulations encore plus optimales pour différents scénarios d’utilisation.

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Betaine solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0300-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Eau traitée au DEPC</td><td>Invitrogen</td><td>AM9915G</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Merck</td><td>3870-25GM</td><td></td></tr><tr><td>EpiScript reverse transcriptase</td><td>Lucigen</td><td>ERT12925K</td><td></td></tr><tr><td>Gly-Gly-Gly& nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SIA-50239-1G</td><td></td></tr><tr><td>LwaCas13a</td><td>Production en interne</td><td></td> Nom de la <td>souche :Leptotrichia wadei, Abréviation : Lwa, Nom de la protéine : LwaCas13a</td></tr><tr><td>Solution de chlorure de magnésium, 1M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028-10X1ML</td><td></td></tr><tr><td>NxGenT7 ARN polymérase</td><td>Lucigen</td><td>30223-2</td><td></td></tr><tr><td>Poly(éthylène glycol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81300-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’acétate de potassium, 5M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95843-100ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Solution de riobnucléotide Mélange</td><td>NEB</td><td>N0466L</td><td></td></tr><tr><td>RNase H</td><td>NEB</td><td>M0297L</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>TCI</td><td>TCI-S0111-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tréhalose Dihydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SIA-90210-50G</td><td></td></tr><tr><td>Solution de chlorhydrate de Trizma, 1M, pH 7,4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2194-100ML</td><td></td></tr><tr><td>TwistAmp Kit de base</td><td>TwistDx</td><td>TABAS03KIT</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BluPAD Dual LED Transilluminateur de lumière bleue/blanche</td><td>Bio-Helix</td><td>BP001CU</td><td></td></tr><tr><td>Bain sec Dual Block</td><td>ELITE</td><td>4-2-EL-02-220</td><td>Modèle : EL-02</td></tr><tr><td>Microplaque de fluorescence lecteur</td><td>Tecan</td><td></td><td>30050303 Modèle : Infinite 200 Pro</td></tr><tr><td>Lyophilisateur</td><td>LABCONCO</td><td>794001030</td><td>FreeZone Triad Lyophilisateur de paillasse</td></tr><tr><td>Microplaque 384-well</td><td>Greiner</td><td>GDE0784076</td><td>F-Bottom, petit volume, Hibase, Med. Reliure, Noir</td></tr><tr><td>Thermocycleur en temps réel (système de PCR en temps réel CFX Connect)</td><td>Bio-Rad</td><td>185-5201</td><td>Modèle : Module</td></tr> <tr><td>optique CFX Connect<Amorce</td> RPA directe ><td></td><td></td><td></td>>oligonucléotide</</tr><tr><td>strongs</td><td>IDT</td><td></td><td>GAAATTAATACGACTCAC TATAGGGAGGTTTCAAAC TTTACTTGCTTTACATAGA</td></tr><tr><td>amorce RPA inverse du gène</td><td>S IDT</td><td></td><td>TCCTAGGTTGAAGA TAACCCACATAATAAG</td></tr><tr><td>amorce RPA directe à gène n</td><td>IDT</td><td></td><td>GAAATTAATACGACTC ACTATAGGAACTTCTC CTGCTAGAATGGCTG</td></tr><tr><td>n-gene reverse RPA</td><td>primer IDT</td><td></td><td>CAGACATTTTGCTCTC AAGCTGGTTCAATC</td></tr><tr><td>LwaCas13a-crRNA pour le gène s</td><td>Synthego</td><td></td><td>GAUUUAGACUACCCCAAAC GAAGGGGACUAAAACGCAGCA CCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG</td></tr><tr><td>LwaCas13a-crRNA pour le gène n</td><td>Synthego</td><td></td><td>GAUUUAGACUACCCCAAAAACG AAGGGGACUAAAACAAAGCA AGCAGCAUCACCGCCAUUGC</td></tr><tr><td>FAM-polyU-IABkFQ reporter</td><td>IDT</td><td></td><td>56-FAM/rUrUrUrUrU/3IABkFQ</td></tr><tr><td>O-hannah_cytb_F Introduction RPA</td><td>IDT</td><td></td><td>GAAATTAATACGACTCACTA TAGGGTACGGATGAACCATA CAAAACCTTCACGCAATCG</td></tr><tr><td>O-hannah_cytb_R Introduction RPA</td><td>IDT</td><td></td><td>AAGATCCATAGTAGATTC CTCGTGCGATGTGGATA</td></tr><tr><td>synT7crRNA13a_ O_hannah&nbsp ;</td><td>IDT</td><td></td><td>GCGCATCCATATTCTTCAT CTGCATTTAGTTTTAGTCC CCTTCGTTTTTGGTA GTCTAAATCCCCTATAGT GAGTCGTATTAATTTC</td></tr></tbody></table>

diagnostics basés sur crispr au point d’intervention avec réactifs prémélangés et lyophilisés

Point-of-care CRISPR-based Diagnostics with Premixed and Freeze-dried Reagents

Nous mettons en évidence la cinétique de la génération du signal de fluorescence FAM à partir de la détection combinée des gènes s et n du SRAS-CoV-2, et comment l’information a été utilisée pour déterminer les conditions optimales pour les formulations de réaction lyophilisées et prémélangées. Dans tous les cas, nous avons inclus des échantillons avec des valeurs de Ct bien en deçà de la limite de détection déterminée (Ct ~31-33), ainsi que ceux avec Ct à la LoD (Ct ~35-37)7, afin de permettre une différenciation des protocoles avec une meilleure sensibilité.
Pour la RT-RPA lyophilisée et prémélangée, nous avons constaté que l’inclusion de KOAc dans la réaction prémélangée affectait négativement la sensibilité de la réaction (Figure 2A). Nous avons donc omis KOAc de la réaction prémélangée et l’avons ajouté avec l’initiateur de la réaction, Mg(OAc)2, une fois l’échantillon d’ARN ajouté. Nous avons également utilisé des tests similaires pour déterminer la concentration optimale d’un tréhalose cryoprotecteur (Figure 2B) et les effets de la triglycine7 dans la réaction RT-RPA lyophilisée (Figure 2C). Par conséquent, des réactions RT-RPA optimisées lyophilisées et prémélangées ont été préparées avec 6% de tréhalose, sans KOAc (mais il a été ajouté plus tard après l’échantillon d’ARN), et complétées par de la triglycine, comme décrit dans la section 1 du protocole.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66703/66703fig02.jpg"> Figure 2 : Optimisation des réactions RT-RPA lyophilisées et prémélangées. La réaction RT-RPA a été préparée à l’aide d’amorces ciblant le gène n du SAR-CoV-2. Le Mg(OAc)2 a été exclu de toutes les réactions prémélangées. Les effets de (A) KOAc, (B) de tréhalose et (C) de triglycine ajoutés aux réactions prémélangées ont été évalués. La surveillance de la réaction via la fluorescence FAM générée a été effectuée à l’aide d’un thermocycleur en temps réel ou d’un lecteur de microplaques à fluorescence. Des données individuelles provenant de mesures en trois exemplaires sont présentées. Abréviations : RT = transcription inverse ; RPA = amplification par polymérase recombinase ; CRISPR = répétitions palindromiques courtes groupées et régulièrement espacées ; Cas = protéine associée à CRISPR ; SAR-CoV-2 = Coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère ; Ct = seuil de cycle ; FAM = carboxyfluorescéine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66703/66703fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Pour les réactions lyophilisées et prémélangées à base de Cas13a, nous avons vérifié l’importance d’avoir le bon cryoprotecteur : soit 6 % de tréhalose, soit 2 % de saccharose19 ont bien fonctionné, tandis qu’une plus faible teneur en saccharose à 1 % ou 5 % p/v PEG20000 n’a pas préservé l’efficacité de la réaction après lyophilisation (Figure 3). Le MgCl2 a été omis de toutes les réactions et a été ajouté à l’étape de réhydratation. La réaction de détection optimale lyophilisée à base de Cas13 a été préparée avec 6 % de tréhalose, comme indiqué dans la section 2 du protocole.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66703/66703fig03.jpg"> Figure 3 : Optimisation des réactions de détection basées sur Cas13 lyophilisées et prémélangées. La réaction de détection a été réalisée à 37 °C à l’aide du produit RPA issu du gène n du SARS-CoV-2. Les tests ont été effectués avant et après la lyophilisation. Le MgCl2 a été exclu de toutes les réactions prémélangées. Les capacités de (A) le tréhalose, (B) le PEG20000 et (C) le saccharose à préserver l’efficacité de la réaction après lyophilisation ont été évaluées. La surveillance de la réaction via la fluorescence FAM générée a été effectuée à l’aide d’un thermocycleur en temps réel. Les données individuelles provenant de mesures en trois exemplaires pour les conditions « après lyophilisation » et d’une répétition des conditions « avant lyophilisation » sont présentées. La figure 3A,B est tirée de Patchsung et al.7. Abréviations : RPA = amplification par polymérase recombinase ; SAR-CoV-2 = coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère ; FAM = carboxyfluorescéine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66703/66703fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Les réactifs lyophilisés et prémélangés pour les réactions à base de RT-RPA et de Cas13 sont stables à -20 °C pendant au moins 8 mois [Figure 4].
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66703/66703fig06.jpg"> Figure 4 : Tests de stabilité de réactifs RPA et CRISPR-Cas13a lyophilisés, prémélangés à -20 °C. Essai de stabilité à (A) 30 jours, (B) 45 jours, (C) 3 mois, (D) 5 mois, (E) 8 mois. Des données individuelles provenant de mesures en trois exemplaires sont présentées. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66703/66703fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
La figure 5 montre la LoD des réactions lyophilisées basées sur la RT-RPA et Cas13 pour la détection des gènes s et n du SARS-CoV-2. La cinétique de la génération de signaux peut être améliorée lors de la détection de deux gènes par rapport à la détection d’un seul gène.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66703/66703fig04.jpg"> Figure 5 : Sensibilité analytique de la détection monogénique par rapport à la détection bigénique. (A) La LoD de la détection lyophilisée monoplexe RT-RPA et Cas, ciblant le gène s du SAR-CoV-2. (B) La LoD de la détection lyophilisée monoplexe RT-RPA et basée sur Cas ciblant le gène n du SAR-CoV-2. (C) La LoD de la RT-RPA multiplexe lyophilisée et la détection double basée sur Cas ciblant les gènes s et n. La LD a été déterminée à l’aide d’ARN du SARS-CoV-2 dilués en série, dont les valeursC t ont été déterminées à l’aide d’un test RT-qPCR ciblant le gène n. Des données individuelles provenant de 3 à 6 mesures répétées sont présentées. Abréviations : LoD = limite de détection ; RT = transcription inverse ; RPA = amplification par polymérase recombinase ; CRISPR = répétitions palindromiques courtes groupées et régulièrement espacées ; Cas = protéine associée à CRISPR ; SAR-CoV-2 = Coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère ; Ct = seuil de cycle ; qPCR = réaction en chaîne par polymérase quantitative. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66703/66703fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Au-delà de la détection du virus, nous présentons un prototype d’outil de génotypage POC basé sur le diagnostic CRISPR, pour aider à identifier les espèces de serpents venimeux endémiques de Thaïlande (Figure 6). L’identification plus rapide et précise des espèces de serpents grâce à des échantillons d’ADN prélevés sur les morsures peut aider à l’administration rapide d’antivenins, améliorant ainsi les chances de survie du patient. Nous avons ciblé des régions du gène du cytochrome b mitochondrial (cytb) de huit espèces de serpents, dont Ophiophagus hannah (cobra royal) (Figure 6A) et montré que la détection de substituts d’ADN synthétique du gène cytb d’O. hannah peut atteindre le niveau de sensibilité attomolaire (Figure 6B,C).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66703/66703fig05.jpg"> Figure 6 : Un prototype de détection basée sur CRISPR pour identifier les espèces de serpents à partir de l’envenimation par morsure de serpent. (A) Conception d’amorces RPA et d’ARNcr LwaCas13a pour la détection du gène cytb d’Ophiophagus hannah. Le promoteur T7 (porte-à-faux T7) a été placé à l’extrémité 5' de l’amorce RPA avant. (B) la cinétique de la génération du signal FAM sur 60 minutes et (C) la fluorescence FAM du point final à partir de la détection médiée par LwaCas13a d’entrées d’ADNdb synthétiques correspondant aux segments du gène cytb d’O. hannah. Différentes concentrations d’entrée (0, 10-9, 10-12, 10-15 et 10-18 M) ont été utilisées. Les données sont moyennes ± écart-type à partir de mesures en trois exemplaires. Abréviations : RPA = amplification par polymérase recombinase ; CRISPR = répétitions palindromiques courtes groupées et régulièrement espacées ; Cas = protéine associée à CRISPR ; FAM = carboxyfluorescéine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66703/66703fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="5">Lyophilisation de réactifs de détection prémélangés CRISPR-Cas13a</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Pas</td>
			<td>Taux de rampe</td>
			<td>Température de l’étagère</td>
			<td rowspan="2">Temps (hh :mm)</td>
			<td>Vide</td>
		</tr><tr><td>(°C/min)</td>
			<td>(°C)</td>
			<td>(mbar)</td>
		</tr><tr><td>Congeler 1</td>
			<td>3</td>
			<td>-30</td>
			<td>de</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Sec 1</td>
			<td>3</td>
			<td>-30</td>
			<td>de</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>Sec 2</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>01:00</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>Sec 3</td>
			<td>3</td>
			<td>20</td>
			<td>∞</td>
			<td>0</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Paramètres du lyophilisateur des réactifs de détection RT-RPA et CRISPR-Cas13a prémélangés. Abréviations : RT = transcription inverse ; RPA = amplification par polymérase recombinase ; CRISPR = répétitions palindromiques courtes groupées et régulièrement espacées ; Cas = protéine associée à CRISPR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">Paramètre</td>
			<td>Réglage</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Température</td>
			<td>37 °C</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Cycle cinétique</td>
			<td>Durée</td>
			<td>02:00 (mm :ss)</td>
		</tr><tr><td>Temps d’intervalle</td>
			<td>02:30 (mm :ss)</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Tremblant</td>
			<td>Durée</td>
			<td>1 seconde</td>
		</tr><tr><td>Mode</td>
			<td>Linéaire</td>
		</tr><tr><td>Amplitude</td>
			<td>1 millimètre</td>
		</tr><tr><td>Intensité de fluorescence</td>
			<td>Longueur d’onde d’excitation</td>
			<td>488 milles marins</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Longueur d’onde d’émission</td>
			<td>520 milles marins</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Mode</td>
			<td>Retour au début</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Position Z</td>
			<td>24470</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Gagner</td>
			<td>71</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Temps d’intégration</td>
			<td>20 μs</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Nombre de clignotements</td>
			<td>25</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 2 : Programme de lecture de microplaques à fluorescence pour la détection des acides nucléiques.

Diagnostics basés sur CRISPR au point d’intervention avec réactifs prémélangés et lyophilisés

Molecular diagnostics by Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-based detection have high diagnostic accuracy and attributes ...

point-care-crispr-based-diagnostics-with-premixed-freeze-dried

Research

Recherche

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

technologie de détection colorimétrique ampliPHOX est présentée comme une alternative peu coûteuse à la détection par fluorescence pour les microarrays. Basé sur la photopolymérisation, ampliPHOX produit des taches polymère solide visible à l'œil nu dans quelques minutes. Les résultats sont ensuite imagé et automatiquement interprété avec un logiciel simple mais puissant.

ampliPHOX détection colorimétrique sur un microréseau d&#39;ADN pour la grippe

Courant multiplexés diagnostic pour détecter Zika, virus de la dengue et chikungunya nécessitent la préparation des échantillons complexes et instrumentation coûteuse et sont difficiles à utiliser dans des environnements peu de ressource. Nous montrons un diagnostic qui utilise l’amplification isotherme avec sondes déplaçable volet spécifique à la cible à détecter et différencier ces virus avec une spécificité et une sensibilité élevée.

L’Amplification isotherme multiplexée selon plate-forme diagnostique pour détecter Zika, Chikungunya et Dengue 1

Nous présentons ici un protocole visant à quantifier avec précision les multiples altérations génétiques d’une région cible en une seule réaction à l’aide de Drop-off ddPCR et une paire de sondes d’hydrolyse.

Seule goutte numérique PCR pour la détection complète et simultanée des Mutations dans les régions de Hotspot

Ce manuscrit décrit une méthode de base CRISPR-Cas9 de groupés régulièrement entrecoupées court palindromique répète (CRISPR) pour une enquête rapide et simple du rôle de plusieurs gènes candidats à la prolifération des cellules de la leucémie myéloïde aiguë (AML) Parallèlement. Cette technique est évolutive et peut être appliquée dans les autres lignées cellulaires cancéreuses ainsi.

Enquête de dépendances génétiques utilisant la concurrence fondée sur les Cas9-CRISPR

Dans ce travail, une méthode de détection rapide, sensible et portable pour Candidatus Liberibacter asiaticus basée sur l’amplification de la polymérase recombinase combinée à CRISPR-Cas12a a été développée.

Détection de Candidatus liberibacter asiaticus déployable sur le terrain à l’aide de l’amplification de la polymérase recombinase combinée à CRISPR-Cas12a

Nous présentons un protocole qui combine l’amplification de la polymérase recombinase avec un système CRISPR/Cas12a pour la détection de traces de virus à ADN et construisons une microscopie portable pour smartphone avec une classification assistée par l’intelligence artificielle pour la détection des virus à ADN au point de service.

Système de détection de virus à ADN basé sur RPA-CRISPR/Cas12a-SPM et Deep Learning

Nous fournissons ici un protocole complet pour normaliser et mettre en œuvre la méthode de détection du virus SARS-CoV-2 dans des échantillons humains par amplification isotherme médiée par boucle de transcription inverse (RT-LAMP). Cette méthode, réalisée en 60 min, pourrait être adaptée à n’importe quel laboratoire ou point de service à faible coût et à l’aide d’équipements peu coûteux.

Détection du virus SARS-CoV-2 par amplification isotherme médiée par boucle de transcription inverse

Ce protocole décrit un test de biomarqueur urinaire synthétique multianalyte médié par CRISPR-Cas qui permet de diagnostiquer le cancer au point d’intervention grâce à l’analyse ex vivo des activités protéases associées à la tumeur.

Test de biomarqueur urinaire synthétique multianalyte médié par CRISPR-Cas pour les diagnostics portables

Pour faciliter la détection rapide et précise d’Acinetobacter baumannii, nous présentons un protocole qui utilise l’amplification par polymérase recombinase (RPA) en conjonction avec l’endonucléase LbaCas12a pour identifier les infections à A. baumannii .

Détection rapide et spécifique des infections à Acinetobacter baumannii à l’aide d’un système d’amplification par polymérase recombinase/système à base de Cas12a

Ici, nous décrivons une procédure simple et rapide pour détecter l’ADN d’agents pathogènes d’abeilles, tels que Lotmaria passim et Nosema ceranae, à l’aide d’une lyse cellulaire prête à l’amplification, d’une amplification par polymérase recombinase et de tests CRISPR/Cas12a.

Détection sur site de l’ADN des parasites trypanosomatidés et de Nosema ceranae par lyse alcaline couplée au système RPA/CRISPR/Cas12a

Découvrez une méthode de diagnostic CRISPR au point d'intervention utilisant des réactifs lyophilisés prémélangés pour la détection d'agents pathogènes infectieux. Cette approche simplifiée réduit les risques de contamination.

Diagnostics basés sur CRISPR au point d’intervention avec réactifs prémélangés et lyophilisés

Explorer plus de vidéos