Name: L’imagerie par feuillet de lumière révèle la structure cardiaque du cœur des rongeurs (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Découvrez l'imagerie par feuillet de lumière pour explorer les structures myocardiques du cœur de rongeur intact à résolution isotrope. Cette méthode non invasive révèle la trabéculation ventriculaire et les changements liés au remodelage cardiaque.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous exprimons notre gratitude au groupe du Dr Eric Olson du UT Southwestern Medical Center pour avoir généreusement partagé les modèles animaux. Nous apprécions tous les commentaires constructifs fournis par les membres de D-incubator à UT Dallas. Ce travail a été soutenu par le programme NIH R00HL148493 (Y.D.), R01HL162635 (Y.D.) et UT Dallas STARS (Y.D.).

Microscopie à feuillet de lumière et nettoyage des tissus pour une imagerie cardiaque complète

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Les progrès de l’imagerie, du calcul et des méthodes d’élimination des tissus ont fourni une occasion sans précédent d’étudier en profondeur la structure et la fonction cardiaques. Cela présente un grand potentiel pour approfondir notre compréhension de la morphogenèse et de la pathogenèse cardiaques à l’aide d’un modèle de cœur de rongeur intact. Contrairement aux études in vivo du cœur de poisson-zèbre utilisant une approche similaire 40,41,42,43, l’intégration de techniques LSM avancées et de méthodes de nettoyage des tissus nous permet de surmonter les défis entre la résolution spatiale et la profondeur de pénétration lors de l’imagerie du modèle de rongeur 9,44. Les techniques de nettoyage des tissus rendent les cœurs optiquement transparents en éliminant les lipides et autres éléments de diffusion de la lumière, ce qui permet une pénétration plus profonde de l’imagerie45. Lorsqu’il est couplé à la LSM, nous sommes capables d’imager le myocarde. Cette combinaison améliore la profondeur de l’imagerie et permet d’observer la microstructure myocardique complexe. Bien que de nombreuses méthodes de nettoyage aient été mises au point18, nous avons adapté l’iDISCO20 pour rendre rapidement le cœur intact transparent par rapport à d’autres méthodes de nettoyage des tissus15, ce qui le rend facilement disponible pour l’imagerie de l’autofluorescence du myocarde. Pour un marquage par fluorescence spécifique, les protocoles originaux iDISCO et Adipo-Clear46 peuvent être combinés avec l’immunocoloration dans ce système d’imagerie personnalisé, malgré l’incubation plus longue. Pendant ce temps, les méthodes qui préservent la fluorescence endogène et nécessitent un temps de traitement plus court sont préférées pour l’étude proposée. Contrairement à d’autres méthodes, cette plateforme offre les avantages suivants. Tout d’abord, nous utilisons un protocole iDISCO adapté pour le nettoyage des tissus, permettant un rendu rapide du cœur transparent en moins d'1 semaine tout en conservant l’autofluorescence du myocarde. Deuxièmement, nous intégrons des méthodes de calcul telles que l’assemblage d’images et la déconvolution multi-vues dans ce système établi de feuille de lumière pour l’imagerie cardiaque. Enfin, nous concevons et synchronisons le système ASLM pour améliorer la résolution axiale sur un grand champ de vision, permettant une imagerie multi-échelle et une analyse de la compaction et de la trabéculation du myocarde à une résolution quasi isotrope.
Pour capturer des images cardiaques du modèle de rongeur, nous avons fourni quatre approches basées sur le LSM : i) la méthode conventionnelle à des fins de dépistage19, ii) l’assemblage d’images, iii) la déconvolution multi-vues et iv) le balayage ASLM. Compte tenu de la variation de la taille du cœur entre les différents modèles, nous avons cherché à aborder le compromis fondamental entre la résolution spatiale, la vitesse d’acquisition et le champ de vision. Alors que l’assemblage d’images permet d’obtenir un grand FOV avec une résolution spatiale compromise, sa combinaison avec la déconvolution multivue ou ASLM offre une résolution quasi isotrope sur l’ensemble du FOV étendu pour couvrir l’ensemble du cœur de la souris adulte. De plus, l’intégration de ces méthodes améliore la qualité de l’image et le contraste dans les tissus profonds, permettant une reconstruction numérique complète des modèles 3D de microstructures telles que la trabéculation myocardique et le compactage à l’intérieur des ventricules. Cependant, le déluge d’ensembles de données, les coûts de traitement de calcul élevés, la nécessité d’un recalage précis des images et le potentiel d’artefacts dans la déconvolution multivue et l’assemblage d’images entravent leurs vastes applications. Bien que l’ASLM soit une alternative émergente, la complexité de la synchronisation du système, les stratégies de balayage laser et la dépendance à la transparence des tissus posent des défis qui peuvent affecter la robustesse du système et augmenter le risque de photolésions cardiaques.
Collectivement, cette méthodologie, y compris l’imagerie LSM et le nettoyage des tissus, fournit un point de départ pour explorer la structure cardiaque des nouveau-nés aux adultes. Il a le potentiel de localiser la distribution des lignées cardiaques spécialisées et leurs fonctions au cours du développement cardiaque47. Avec le développement de l’analyse computationnelle adaptée aux applications cardiaques 6,48,49,50,51,52,53 , ce cadre peut être étendu pour étudier les processus de remodelage cardiaque, en particulier en réponse à l’infarctus du myocarde. En fin de compte, cette stratégie holistique a le potentiel de démêler le mécanisme sous-jacent de la morphogenèse cardiaque et de faire progresser le développement d’interventions thérapeutiques.

L’insuffisance cardiaque reste la principale cause de mortalité dans le monde, principalement en raison du manque de capacité de régénération des cardiomyocytes matures1. L’architecture complexe du cœur joue un rôle crucial dans sa fonction et donne un aperçu des processus de développement. Une compréhension approfondie de la structure cardiaque est essentielle pour élucider les processus fondamentaux de la morphogenèse et du remodelage cardiaques en réponse à l’infarctus du myocarde. Des progrès récents ont démontré que les souris néonatales peuvent restaurer la fonction cardiaque après une blessure, alors que les souris adultes n’ont pas une telle capacité de régénération2. Cela établit une base pour l’étude des indices associés aux anomalies structurelles et fonctionnelles dans les modèles murins. Les méthodes d’imagerie traditionnelles, telles que la microscopie confocale, présentent des limites techniques, notamment une profondeur de pénétration limitée, un schéma de balayage ponctuel lent et des dommages photographiques dus à une exposition prolongée à la lumière laser. Ceux-ci entravent l’imagerie tridimensionnelle (3D) complète du cœur intact. Dans ce contexte, la microscopie à feuillet de lumière (LSM) apparaît comme une solution puissante, offrant les avantages d’une imagerie à grande vitesse, d’une réduction des dommages photographiques et de capacités exceptionnelles de sectionnement optique 3,4,5. Les caractéristiques uniques de la LSM en font une méthode prometteuse pour surmonter les limites des techniques conventionnelles, fournissant des informations sans précédent sur les processus de développement et de remodelage cardiaques 6,7,8.
Dans ce protocole, nous introduisons une stratégie d’imagerie qui combine une LSM avancée avec des approches de clarification tissulaire adaptées9, permettant l’imagerie de cœurs de souris entiers sans avoir besoin d’un marquage spécifique et d’une section mécanique. Nous proposons en outre que l’imagerie LSM conventionnelle puisse être améliorée par des techniques de déconvolutionmultivue 10 ou de microscopie à feuillet de lumière à balayage axial (ASLM) 11,12,13,14,15 pour améliorer la résolution axiale. De plus, l’intégration de l’assemblage d’images avec l’une ou l’autre de ces méthodes peut surmonter efficacement le compromis entre la résolution spatiale et le champ de vision (FOV), faisant ainsi progresser l’imagerie des cœurs de souris adultes. L’incorporation de nombreuses approches de nettoyage des tissus, y compris les méthodes hydrophobes, hydrophiles et à base d’hydrogel, permet une pénétration plus profonde de la lumière pour capturer la morphologie de l’ensemble du cœur 16,17,18,19.
Bien que plusieurs méthodes de clarification soient compatibles avec les systèmes LSM actuels, l’objectif est de minimiser la diffusion des photons et d’améliorer la pénétration de la lumière dans les tissus, comme le cœur, en remplaçant les lipides par un milieu qui correspond étroitement à son indice de réfraction. iDISCO a été choisi comme représentant20,21 et adapté à l’imagerie par autofluorescence dans ce protocole en raison de son traitement rapide et de sa grande transparence (Figure 1A). Collectivement, l’intégration de l’approche LSM avancée avec des techniques de nettoyage des tissus offre un cadre prometteur pour démêler l’anatomie cardiaque complexe dans les cœurs de rongeurs, avec un potentiel important pour faire progresser notre compréhension de la morphogenèse et de la pathogenèse cardiaques.

<table><tbody><tr><td>Agarose <forte>1 % </forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose à faible point de fusion</td><td>Thermo Fisher</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>Eau désionisée</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td><forte>Produits chimiques pour l’élimination des tissus&nbsp ; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5-Amino-1,3,3-triméthylcyclohexaneméthylamine, mélange de cis et trans</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>118184</td><td></td></tr><tr><td>D.E.R.&trade ; 332</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31185</td><td></td></tr><tr><td>D.E.R.&trade ; 736</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31191</td><td></td></tr><tr><td>Éther dibenzylique (DBE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33630</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorométhane (DCM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997</td><td></td></tr><tr><td>Perles fluorescentes</td><td>Spherotech</td><td>FP-0556-2</td><td></td></tr><tr><td>Peroxyde d’hydrogène (H2O2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216736</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>439193</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA)</td><td>Thermo Fisher</td><td>47392</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79383</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Logiciels et algorithmes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amira</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2021.2</td><td></td></tr><tr><td>BigStitcher</td><td>H&ouml ; rl et al.22</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji-ImageJ</td><td>Schindelin et al.20</td><td>1.54f</td><td></td></tr><tr><td>HCImage Live</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>4.6.1.2</td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments Corporation</td><td>2017 SP1</td><td></td></tr><tr><td>Composants clés du système de feuille de lumière personnalisé</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,63 - 6,3X Zoom boîtier</td><td>Olympus</td><td>MVX-ZB10&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Objectif d’éclairage 10X Objectif</td> de détection <td>Nikon</td><td>MRH00105</td><td></td></tr><tr><td>1X</td><td>Olympus</td><td>MV PLAPO 1X/0.25&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>473nm DPSS Laser</td><td>Laserglow Technologies</td><td>LRS-0473-PFM-00100-05</td><td></td></tr><tr><td>532nm DPSS laser Laserglow</td><td>Technologies</td><td>LRS-0532-PFM-00100-05</td><td></td></tr><tr><td>589&thinsp ; nm DPSS laser</td><td>Laserglow Technologies</td><td>LRS-0589-GFF-00100-05</td><td></td></tr><tr><td>Connecteur BNC</td><td>National Instrument</td><td>BNC-2110</td><td></td></tr><tr><td>Lentille cylindrique</td><td>Thorlabs</td><td>ACY254-050-A</td><td></td></tr><tr><td>Contrôleur de moteur DC, 4 axes</td><td>Physik Instrumente</td><td>C-884.4DC</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ETL Optotune</td><td>EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C</td><td></td></tr><tr><td>Câble ETL</td><td>Optotune</td><td>CAB-6-300</td><td></td></tr><tr><td>ETL Pilote d’objectif</td><td>Optotune</td><td>EL-E-4i</td><td></td></tr><tr><td>Filtre</td><td>Chroma</td><td>ET525/30</td><td></td></tr><tr><td>Filtre</td><td>Chroma</td><td>ET585-40</td><td></td></tr><tr><td>Filtre</td><td>Chroma</td><td>ET645-75</td><td></td></tr><tr><td>Roue à filtres&nbsp ;</td><td>Shutter Instrument</td><td>LAMBDA 10-B</td><td></td></tr><tr><td>Platine de translation motorisée</td><td>Physik Instrumente</td><td>L-406.20DG10</td><td></td></tr><tr><td>Platine de translation motorisée</td><td>Physik Instrumente</td><td>L-406.40DG10</td><td></td></tr><tr><td>Platine de translation motorisée</td><td>Physik Instrumente</td><td>M-403.4PD</td><td></td></tr><tr><td>E/S multifonctions NI</td><td>National Instrument</td><td>PCIe-6363</td><td></td></tr><tr><td>Caméra sCMOS</td><td>Hamamatsu</td><td>C13440-20CU</td><td></td></tr><tr><td>Moteur pas à pas</td><td>Pololu</td><td>1474</td><td></td></tr><tr><td>Objectif tube</td><td>Olympus</td><td>MVX-TLU</td><td></td></tr></tbody></table>

l’imagerie par feuillet de lumière révèle la structure cardiaque du cœur des rongeurs

Light-Sheet Imaging to Reveal Cardiac Structure in Rodent Hearts

La microscopie à feuillet de lumière (LSM) joue un rôle central dans la compréhension de la structure tridimensionnelle complexe (3D) du cœur, fournissant des informations cruciales sur la physiologie cardiaque fondamentale et les réponses pathologiques. Nous nous penchons ici sur le développement et la mise en œuvre de la technique LSM pour élucider la micro-architecture du cœur dans des modèles murins. La méthodologie intègre un système LSM personnalisé avec des techniques de nettoyage des tissus, atténuant la diffusion de la lumière dans les tissus cardiaques pour l’imagerie volumétrique. La combinaison d’un LSM conventionnel avec des approches d’assemblage d’images et de déconvolution multivues permet de capturer l’ensemble du cœur. Pour résoudre le compromis inhérent entre la résolution axiale et le champ de vision (FOV), nous introduisons une méthode de microscopie à feuillet de lumière à balayage axial (ASLM) pour minimiser la lumière floue et éclairer uniformément le cœur dans le sens de la propagation. Entre-temps, les méthodes de nettoyage des tissus telles que iDISCO améliorent la pénétration de la lumière, facilitant la visualisation des structures profondes et assurant un examen complet du myocarde dans l’ensemble du cœur. La combinaison du LSM proposé et des méthodes de nettoyage des tissus présente une plate-forme prometteuse pour les chercheurs dans la résolution des structures cardiaques dans les cœurs de rongeurs, avec un grand potentiel pour la compréhension de la morphogenèse et du remodelage cardiaques.

Il a été démontré que la LSM favorise les études cardiaques 31,32,33,34,35,36,37 en raison du risque minimal de photodommages, de la haute résolution spatiale et du sectionnement optique par rapport à d’autres méthodes d’imagerie optique telles que les techniques de balayage en fond clair et en point 6,8,38,39,40 . Ainsi, pour mieux comprendre l’architecture myocardique 3D, nous avons établi le protocole basé sur des approches primaires comprenant le dégagement iDISCO adapté, l’assemblage d’images, la déconvolution multivue et l’ASLM. Bien que nous ayons présenté les résultats à l’aide de modèles murins, il est important de noter que les rats et autres modèles de rongeurs conviennent également aux méthodes proposées. Le protocole de clarification tissulaire adapté permet de rendre transparent le cœur de souris P1 en 4 jours et le cœur de souris de 8 semaines transparent en 7 jours (Figure 1B). Cette étape sert de point de départ pour minimiser l’absorption et la diffusion des photons dans le cœur intact. La déconvolution multivue permet d’améliorer la résolution axiale en fusionnant des images de plusieurs perspectives en un seul modèle. Après avoir enregistré séquentiellement des images à partir de 6 vues du même cœur, la méthode de déconvolution multivues atteint une résolution quasi isotrope avec une diagonale de 4,68 μm et une axiale de 5,06 μm, après 15 h de calcul (Figure 8A). Pour éviter la complexité informatique, nous avons personnalisé un ASLM basé sur ETL pour imager des cœurs de souris néonatales à adultes. Cette méthode nous permet de balayer le myocarde avec un faisceau laser étroitement focalisé, minimisant ainsi le flou de fond et améliorant le contraste de l’image par rapport aux méthodes LSM conventionnelles (Figure 8B). Avec la conception actuelle de l’ASLM, les résolutions latérales et axiales moyennes du système atteignent respectivement 2,18 μm et 2,88 μm, ce qui permet une exploration approfondie de la trabéculation myocardique dans les ventricules. De plus, l’assemblage d’images peut être utilisé indépendamment ou en combinaison avec la déconvolution multivue ou l’ASLM pour étendre le champ de vision pour des échantillons de plus grande taille. L’intégration de l’assemblance avec l’ASLM nous permet de couvrir l’ensemble du cœur de souris âgée de 8 semaines avec une résolution uniforme (Figure 8C), offrant une solution efficace pour étudier la section transversale de l’ensemble du cœur.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66707/66707fig01.jpg"> Figure 1 : Processus d’élimination des tissus. (A) La méthode hydrophobe implique la déshydratation des tissus, l’extraction des lipides et l’adaptation de l’indice de réfraction en utilisant de l’éther dibenzylique (DBE) comme solvant organique. (B) Immerger le cœur dans un mélange de solution de formaldéhyde à 4 % (PFA) et le déshydrater avec un gradient de mélanges de méthanol et d’eau déminéralisée (DI). Blanchir le cœur avec 5% de H2O2 dans du méthanol à 4 °C. Délipidez le cœur avec une solution de dichlorométhane (DCM) et de méthanol jusqu’à ce que l’échantillon coule au fond du tube. Enfin, incubez le cœur dans DBE afin d’obtenir l’indice de réfraction souhaité. Lignes de quadrillage 5 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66707/66707fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66707/66707fig02.jpg"> Figure 2 : Schéma de la microscopie à feuillet de lumière à balayage axial. (A) Chambre imprimée en 3D personnalisée, (B) aimant de chambre, (C) support de pince et (D) système ASLM. Abréviations : CL : lentille cylindrique ; ETL : lentille électronique accordable ; IL : lentille d’éclairage ; DL : lentille de détection ; FW : roue à filtres ; TL : lentille tubulaire. Cette figure a été modifiée de la Réf16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66707/66707fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66707/66707fig03.jpg"> Figure 3 : Assemblage d’images et déconvolution multivue. (A-B) L’assemblage d’images est utilisé pour couvrir l’intégralité du cœur de la souris, chaque tuile ayant un chevauchement de 10 % du champ de vision avec les tuiles adjacentes. (C) Modèle de mouvement du cœur de la souris pour l’assemblage d’images. (D) Des billes fluorescentes sont fixées à l’extrémité du tube de verre pour faciliter l’enregistrement de l’image, tandis que le cœur est positionné à l’intérieur du tube de verre contenant le DBE, permettant l’imagerie simultanée du cœur de la souris et des billes fluorescentes. (E) La déconvolution multivue implique l’acquisition d’images à partir de six perspectives distinctes, chacune rassemblant des images provenant de directions uniques. (F) Données brutes du cœur et des perles de la souris P1 à différents angles de 0°, 60°, 120°, 180°, 240° et 300°. Barres d’échelle : 500 μm. Ce chiffre a été modifié au lieu de16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66707/66707fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66707/66707fig04.jpg"> Figure 4 : Schéma fonctionnel du système ASLM. Utilisation de la carte DAQ pour la synchronisation des caméras ETL et sCMOS. Le boîtier du pilote ETL a été ouvert pour le soudage des fils de signal et de terre sur le circuit imprimé. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66707/66707fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66707/66707fig05.jpg"> Figure 5 : Panneau de configuration LabView. Panneau de configuration LabVIEW pour générer des déclencheurs afin de synchroniser l’ETL et les pixels activés de la caméra sCMOS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66707/66707fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66707/66707fig06.jpg"> Figure 6 : Synchronisation de la mise au point de la feuille de lumière avec les pixels activés. (A) L’identification des points de départ et d’arrivée de la plage de balayage de la feuille de lumière est réalisée en configurant la tension appropriée pour le déclencheur ETL. (B) Le résultat synchrone des billes fluorescentes est évident le long de la diagonale de l’image. (C-F) La résolution spatiale non uniforme sur l’ensemble du FOV provient du fonctionnement asynchrone de l’ETL avec la caméra sCMOS. L’ETL lance le balayage (C) plus tard ou (D) plus tôt que le pixel activé. (E-F) La zone focale n’est pas parallèle à la diagonale de l’image, ce qui indique une incompatibilité entre les vitesses de balayage et d’activation. L’ETL scanne (E) plus rapidement ou (F) plus lentement que le balayage des pixels actifs dans le sCMOS. Barre d’échelle : 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66707/66707fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66707/66707fig07.jpg"> Figure 7 : Dépannage de l’ASLM. (A) La feuille de lumière est placée exactement à la distance focale de la lentille de détection. L’ETL balaie le foyer de la feuille de lumière le long de la direction de propagation tout en se synchronisant avec le pixel activé du capteur sCMOS. (B) Vue XY des billes fluorescentes lorsque l’ETL est correctement aligné et synchronisé. (C-D) Résultats de billes fluorescentes sur le plan focal et floues dans les images en coupe, indiquant le désalignement entre le balayage ETL et la propagation laser. Barres d’échelle : 200 μm et 10 μm dans l’encart. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66707/66707fig07large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66707/66707fig08.jpg"> Figure 8 : Imagerie par feuillet lumineux de cœurs de souris. (A) Image volumique du cœur de souris P1 à déconvolution multivue mettant en évidence la trabéculation dans la cavité ventriculaire. (B) Images en coupe transversale du cœur d’une souris âgée de 8 semaines générées par LSM conventionnelle (à gauche) et ASLM (à droite). Les images sont présentées sous forme de données brutes. (C) Combinaison de l’assemblage d’images et de l’ASLM pour l’imagerie d’un cœur de souris âgé de 8 semaines, comprenant 12 tuiles disposées en 3 tuiles horizontalement et 4 tuiles verticalement. Barre d’échelle : 500 μm. Abréviations : VG : ventricule gauche, LA : oreillette gauche, RV : ventricule droit et PR : oreillette droite. Cette figure a été modifiée de la Réf16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66707/66707fig08large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3">Procédure</td>
			<td>Temps (cœur de souris P1)</td>
			<td>Time (cœur de souris de 8 semaines)</td>
			<td>Température</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Fixe en 4% de PFA</td>
			<td>Nuit</td>
			<td>Nuit</td>
			<td>4°C</td>
			<td rowspan="5">Préparation des échantillons</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Laver avec 1x PBS</td>
			<td>Durée : 30 minutes</td>
			<td>Durée : 30 minutes</td>
			<td>RT</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Laver avec 1x PBS</td>
			<td>Durée : 30 minutes</td>
			<td>Durée : 30 minutes</td>
			<td>RT</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Laver avec 1x PBS</td>
			<td>Durée : 30 minutes</td>
			<td>Durée : 30 minutes</td>
			<td>RT</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Encastrer avec du gel d’agarose</td>
			<td>1 h</td>
			<td>2 h</td>
			<td>RT</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Incuber dans de l’eau 20 % méthanol/80 % DI</td>
			<td>1 h</td>
			<td>2 h</td>
			<td>RT</td>
			<td rowspan="6">Déshydratation</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Incuber dans 40 % d’eau méthanol/60 % d’eau DI</td>
			<td>1 h</td>
			<td>2 h</td>
			<td>RT</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Incuber dans 60 % d’eau méthanol/40 % d’eau DI</td>
			<td>1 h</td>
			<td>2 h</td>
			<td>RT</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Incuber dans 80 % d’eau méthanol/20 % DI</td>
			<td>1 h</td>
			<td>2 h</td>
			<td>RT</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Incuber dans 100% méthanol</td>
			<td>1 h</td>
			<td>2 h</td>
			<td>RT</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Incuber dans du méthanol frais à 100 %</td>
			<td>1 h</td>
			<td>2 h</td>
			<td>RT</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Incuber dans du méthanol frais à 100 %</td>
			<td>Durée : 10 minutes</td>
			<td>Durée : 10 minutes</td>
			<td>4°C</td>
			<td rowspan="3">Dépigmentation</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Eau de Javel à 5% H2O2/méthanol</td>
			<td>Nuit</td>
			<td>Nuit</td>
			<td>4°C</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Incuber dans 100% méthanol</td>
			<td>1 h</td>
			<td>1 h</td>
			<td>RT</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Délipidat avec 66 % de DCM/33 % de méthanol sur l’agitateur</td>
			<td>3 h</td>
			<td>3 h</td>
			<td>RT</td>
			<td>Délipidation</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Incuber en DBE sur le shaker</td>
			<td>2 jours</td>
			<td>5 jours</td>
			<td>RT</td>
			<td>Correspondance des instances réservées</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Étapes personnalisées de nettoyage des tissus pour l’imagerie par autofluorescence.

Le protocole utilise la microscopie à feuillet de lumière avancée ainsi que des méthodes de nettoyage tissulaire adaptées pour étudier les structures cardiaques complexes dans les cœurs de rongeurs, ce qui présente un grand potentiel pour la compréhension de la morphogenèse et du remodelage cardiaques.

L’imagerie par feuillet de lumière révèle la structure cardiaque du cœur des rongeurs

Light-sheet microscopy (LSM) plays a pivotal role in comprehending the intricate three-dimensional (3D) structure of the heart, providing crucial insights ...

Notre recherche vise à personnaliser un système d’imagerie à feuillet de lumière pour étudier les structures myocardiques du cœur intact d’un rongeur au niveau cellulaire. Nous avons développé un flux de travail pour explorer le myocarde intact avec une résolution isotrope au niveau du micron du cœur de rongeur néonatal à adulte. Notre étude comble une lacune dans l’étude des microstructures myocardiques complexes, telles que la trabéculation, à l’intérieur des ventricules intacts, avec une haute résolution spatiale.Cette stratégie d’imagerie fournit un point d’entrée pour évaluer la microstructure sans tranchage physique, ce qui permet de mieux comprendre le développement et le remodelage cardiaques. Nous nous concentrerons sur l’exploration des changements structurels du myocarde en réponse aux lésions cardiaques et au remodelage.

light-sheet-imaging-to-reveal-cardiac-structure-in-rodent-hearts

Research

Recherche

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Cet article décrit une technique de haute résolution spatiale et temporelle optiquement l'image mouvement d'action potentielle sur la surface de coeurs de rats perfusés de Langendorff en utilisant un colorant potentiométrique (di-8-ANEPPS).

Cartographie optique des coeurs de rats perfusés de Langendorff

Ici, nous décrivons la préparation de tranches ventriculaires viables à partir de souris adultes et leur utilisation pour des enregistrements de potentiel d'action des électrodes pointues. Ces préparations multicellulaires fournissent une structure tissulaire similaire in vivo , ce qui en fait un modèle précieux pour les études électrophysiologiques et pharmacologiques in vitro .

Tranches de coeur ventriculaire à courte aiguille murine pour études électrophysiologiques

Cette étude utilise une technique de microscopie (LSFM) de fluorescence lumière-feuille recto-verso illumination combinée avec compensation optique pour étudier le coeur murin.

Microscopie de Fluorescence lumière-feuille pour l’étude du coeur murin

Nous décrivons des outils optimisés pour étudier le cœur du poisson-zèbre in vivo avec la microscopie à fluorescence à feuille de lumière. Plus précisément, nous suggérons des lignées transgéniques cardiaques brillantes et présentons de nouvelles techniques d’intégration et d’immobilisation douces qui évitent les malformations développementales et cardiaques. Un éventuel pipeline d’acquisition et d’analyse de données adapté à l’imagerie cardiaque est également fourni.

Microscopie à feuille de lumière de la dynamique cardiaque rapide chez les embryons de poisson zèbre

Nous rapportons une méthode de reconstruction mésoscopique de l’ensemble du cœur de souris en combinant de nouvelles avancées dans la transformation tissulaire et la coloration avec le développement d’un microscope à feuille de lumière à balayage axial.

Imagerie optique mésoscopique du cœur entier de souris

Nous présentons ici un protocole d’imagerie expérimentale pour la quantification de la fonction cardiaque et de la morphologie à l’aide de la tomographie par émission de positons à haute résolution / tomodensitométrie pour les petits animaux. Les souris et les rats sont pris en compte, discutant des différentes exigences des agents de contraste par tomodensitométrie pour les deux espèces.

Tomographie cardiaque à émission de positons à haute résolution/tomodensitométrie pour petits animaux

Ce protocole utilise l’imagerie par feuille de lumière pour étudier la fonction contractile cardiaque chez les larves de poisson-zèbre et mieux comprendre la mécanique cardiaque grâce au suivi cellulaire et à l’analyse interactive.

Imagerie 4D de la contraction cardiaque du poisson-zèbre

Optique résolution microscopie photoacoustique (OR-PAM) est une technologie émergente capable d'imagerie d'absorption optique des...

Tridimensionnelle optique résolution microscopie photoacoustique

Ce manuscrit décrit la création de tissus cardiaques modifiés définis à l’aide de l’expression de marqueurs de surface et du tri cellulaire. Les tissus définis peuvent ensuite être utilisés dans un bioréacteur multi-tissus pour étudier les mécanismes de la thérapie cellulaire cardiaque afin de fournir un système modèle fonctionnel, mais contrôlé, du cœur humain.

Construction des Défini humaines Engineered cardiaques Tissues pour étudier les mécanismes de la thérapie cellulaire cardiaque

Cette méthode décrit l’utilisation de la microtomodensitométrie quantique (MicroCT) pour évaluer la morphologie, la fonction, la perfusion, le métabolisme et la viabilité cardiaques avec un agent de contraste iodé chez des souris atteintes d’ischémie myocardique induite expérimentalement. La technique peut être appliquée pour l’imagerie longitudinale in vivo non destructive à haut débit de divers modèles animaux de maladies cardiaques humaines.

In Vivo évaluation quantitative de la structure du myocarde, Fonction, perfusion et la viabilité utilisant la tomographie cardiaque Micro-calculées

Découvrez l'imagerie par feuillet de lumière pour explorer les structures myocardiques du cœur de rongeur intact à résolution isotrope. Cette méthode non invasive révèle la trabéculation ventriculaire et les changements liés au remodelage cardiaque.

L’imagerie par feuillet de lumière révèle la structure cardiaque du cœur des rongeurs

Explorer plus de vidéos