Name: Co-culture de systèmes in vitro pour reproduire le cycle cancer-immunité (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Découvrez un protocole de co-culture in vitro simple et fiable pour surveiller chaque étape du cycle cancer-immunité. Cette méthode permet d'étudier les interactions entre cellules cancéreuses et immunitaires.

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Surveillance du cycle cancer-immunité basée sur la cytométrie en flux 

<ol><li>Chen, D. S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncology+meets+immunology%3A+the+cancer-immunity+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle.</a> Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).</li>
<li>Mellman, I., Chen, D. S., Powles, T., Turley, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cancer-immunity+cycle%3A+Indication%2C+genotype%2C+and+immunotype%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The cancer-immunity cycle: Indication, genotype, and immunotype.</a> Immunity. 56 (10), 2188-2205 (2023).</li>
<li>Galassi, C., Musella, M., Manduca, N., Maccafeo, E., Sistigu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+privilege+of+cancer+stem+cells%3A+A+key+to+understanding+tumor+immune+escape+and+therapy+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The immune privilege of cancer stem cells: A key to understanding tumor immune escape and therapy failure.</a> Cells. 10 (9), 2361(2021).</li>
<li>Dunn, G. P., Old, L. J., Schreiber, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three+Es+of+cancer+immunoediting%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The three Es of cancer immunoediting.</a> Annu Rev Immunol. 22, 329-360 (2004).</li>
<li>Musella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+IFNs+promote+cancer+cell+stemness+by+triggering+the+epigenetic+regulator+KDM1B%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immun%22%5BJournal%5D)">Type I IFNs promote cancer cell stemness by triggering the epigenetic regulator KDM1B.</a> Nat Immun. 23 (9), 1379-1392 (2022).</li>
<li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leveraging+immune+resistance+archetypes+in+solid+cancer+to+inform+next-generation+anticancer+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Leveraging immune resistance archetypes in solid cancer to inform next-generation anticancer therapies.</a> J Immunother Cancer. 11 (6), e006533(2023).</li>
<li>Sharma, P., Hu-Lieskovan, S., Wargo, J. A., Ribas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary%2C+adaptive%2C+and+acquired+resistance+to+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Primary, adaptive, and acquired resistance to cancer immunotherapy.</a> Cell. 168 (4), 707-723 (2017).</li>
<li>Musella, M., Manduca, N., Maccafeo, E., Ruggiero, E., Sistigu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+evaluation+of+cancer+cell+immunogenicity+and+antigen-specific+T-cell+cytotoxicity+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro evaluation of cancer cell immunogenicity and antigen-specific T-cell cytotoxicity by flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 2748, 13-28 (2024).</li>
<li>Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full+spectrum+flow+cytometry+as+a+powerful+technology+for+cancer+immunotherapy+research%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research.</a> Front Mol Biosci. 7, 612801(2020).</li>
<li>Danova, M., Torchio, M., Comolli, G., Sbrana, A., Antonuzzo, A., Mazzini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+automated+cytometry+in+the+new+era+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">The role of automated cytometry in the new era of cancer immunotherapy.</a> Mol Clin Oncol. 9 (4), 355-361 (2018).</li>
<li>Laskowski, T. J., Hazen, A. L., Collazo, R. S., Haviland, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rigor+and+reproducibility+of+cytometry+practices+for+immuno-oncology%3A+A+multifaceted+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Rigor and reproducibility of cytometry practices for immuno-oncology: A multifaceted challenge.</a> Cytometry A. 97 (2), 116-125 (2020).</li>
<li>Manduca, N., Maccafeo, E., De Maria, R., Sistigu, A., Musella, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cancer+models%3A+One+step+closer+to+in+vitro+human+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">3D cancer models: One step closer to in vitro human studies.</a> Front Immunol. 14, 1175503(2023).</li>
<li>De Ninno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+co-culture+models+for+dissecting+the+immune+response+in+in+vitro+tumor+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Microfluidic co-culture models for dissecting the immune response in in vitro tumor microenvironments.</a> JoVE. (170), e61895(2021).</li>
<li>Mattei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncoimmunology+meets+organs-on-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Oncoimmunology meets organs-on-chip.</a> Front Mol Biosci. 8, 627454(2021).</li>
<li>Businaro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross+talk+between+cancer+and+immune+cells%3A+exploring+complex+dynamics+in+a+microfluidic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Cross talk between cancer and immune cells: exploring complex dynamics in a microfluidic environment.</a> Lab Chip. 13 (2), 229-239 (2013).</li>
<li>Vacchelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy-induced+antitumor+immunity+requires+formyl+peptide+receptor+1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy-induced antitumor immunity requires formyl peptide receptor 1.</a> Science. 350 (6263), 972-978 (2015).</li>
<li>Maulana, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocompetent+cancer-on-chip+models+to+assess+immuno-oncology+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Immunocompetent cancer-on-chip models to assess immuno-oncology therapy.</a> Adv Drug Deliv Rev. 173, 281-305 (2021).</li>
<li>Lorenzi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+IFNs+control+antigen+retention+and+survival+of+CD8%CE%B1%28%2B%29+dendritic+cells+after+uptake+of+tumor+apoptotic+cells+leading+to+cross-priming%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immun%22%5BJournal%5D)">Type I IFNs control antigen retention and survival of CD8α(+) dendritic cells after uptake of tumor apoptotic cells leading to cross-priming.</a> J Immun. 186 (9), 5142-5150 (2011).</li>
<li>Musella, M., Manic, G., Galassi, C., Vitale, I., Sistigu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytofluorometric+assessment+of+dendritic+cell-mediated+uptake+of+cancer+cell+apoptotic+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Cytofluorometric assessment of dendritic cell-mediated uptake of cancer cell apoptotic bodies.</a> Methods Enzymol. 632, 39-54 (2020).</li>
<li>Lucarini, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+Type+I+Interferons+and+5-Aza-2%27-Deoxycitidine+to+improve+antitumor+response+against+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Combining Type I Interferons and 5-Aza-2'-Deoxycitidine to improve antitumor response against melanoma.</a> J Invest Dermatol. 137 (1), 159-169 (2017).</li>
<li>Gutiérrez-Martínez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-presentation+of+cell-associated+antigens+by+MHC+Class+I+in+dendritic+cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cross-presentation of cell-associated antigens by MHC Class I in dendritic cell subsets.</a> Front Immunol. 6, 363(2015).</li>
<li>Joffre, O. P., Segura, E., Savina, A., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-presentation+by+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cross-presentation by dendritic cells.</a> Nat Rev Immunol. 12 (8), 557-569 (2012).</li>
<li>Hegde, P. S., Karanikas, V., Evers, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+where%2C+the+when%2C+and+the+how+of+immune+monitoring+for+cancer+immunotherapies+in+the+era+of+checkpoint+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The where, the when, and the how of immune monitoring for cancer immunotherapies in the era of checkpoint inhibition.</a> Clin Cancer Res. 22 (8), 1865-1874 (2016).</li>
<li>Lee, R. Y., Ng, C. W., Rajapakse, M. P., Ang, N., Yeong, J. P. S., Lau, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+and+challenge+of+spatial+omics+in+dissecting+tumour+microenvironment+and+the+role+of+AI%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">The promise and challenge of spatial omics in dissecting tumour microenvironment and the role of AI.</a> Front Oncol. 13, 1172314(2023).</li>
<li>Lewis, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+omics+and+multiplexed+imaging+to+explore+cancer+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Spatial omics and multiplexed imaging to explore cancer biology.</a> Nat Methods. 18 (9), 997-1012 (2021).</li>
<li>Wu, Y., Cheng, Y., Wang, X., Fan, J., Gao, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+omics%3A+Navigating+to+the+golden+era+of+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Spatial omics: Navigating to the golden era of cancer research.</a> Clin Transl Med. 12 (1), 696(2022).</li>
<li>Vandereyken, K., Sifrim, A., Thienpont, B., Voet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+and+applications+for+single-cell+and+spatial+multi-omics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Methods and applications for single-cell and spatial multi-omics.</a> Nat Rev Genet. 24 (8), 494-515 (2023).</li>
<li>Cheung, M., Campbell, J. J., Whitby, L., Thomas, R. J., Braybrook, J., Petzing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+trends+in+flow+cytometry+automated+data+analysis+software%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Current trends in flow cytometry automated data analysis software.</a> Cytometry A. 99 (10), 1007-1021 (2021).</li>
<li>Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillère, R., Smyth, M. J., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+in+oncoimmunology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mouse models in oncoimmunology.</a> Nat Rev Cancer. 16 (12), 759-773 (2016).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Le suivi de la réponse immunitaire anticancéreuse est de la plus haute importance pour élucider et comprendre les interactions moléculaires et cellulaires complexes qui agissent dans le TME et soutiennent une lutte constante pour la suprématie23. Nous détaillons ici un protocole simple assisté par mFC et ToC pour le suivi et la caractérisation des étapes constituant le cycle cancer-immunité. Avec des variations mineures, ce protocole, basé sur des lignées cellulaires murines et des cellules immunitaires dérivées de souris, peut être adapté à la fois aux lignées de cancer immortalisées et même primaires et aux cellules immunitaires dérivées du sang périphérique humain. De plus, en combinant l’inhibition génétique ou pharmacologique de voies spécifiques et leurs contrôles appropriés, ce protocole permet d’identifier des biomarqueurs régulant l’immunosurveillance et, par conséquent, la réponse aux thérapies immunogènes et immunitaires.
La mFC permet l’analyse à haut débit de divers paramètres immunitaires et combine la capacité d’analyser des millions de cellules en peu de temps avec la possibilité d’identifier des événements rares, d’évaluer la prolifération et la mort cellulaires, de détecter plusieurs paramètres à la fois dans un petit volume d’échantillons et d’effectuer des analyses moléculaires et fonctionnelles en aval.. Ces caractéristiques, associées au faible coût, ont favorisé l’accessibilité du mFC et sa large utilisation dans les laboratoires de recherche et cliniques. Néanmoins, certaines limites importantes subsistent. Tout d’abord, l’analyse mFC nécessite une dissociation tissulaire pour obtenir des suspensions unicellulaires lors de la préparation de l’échantillon, détruisant ainsi l’information spatiale du tissu tumoral. L’avènement des technologies spatiales au cours de la dernière décennie, y compris la transcriptomique spatiale à haut plex, la protéomique et l’épigénomique, a élargi notre capacité à profiler le TME en analysant la position des cellules cancéreuses, immunitaires et stromales et leurs interactions mutuelles24. Deuxièmement, mFC permet de détecter jusqu’à seize paramètres (environ) à la fois et ne couvre donc pas tous les marqueurs d’identification, de maturation et d’état d’activation des cellules dans un seul échantillon. Encore une fois, les technologies de pointe ci-dessus permettent de détecter jusqu’à une centaine de paramètres simultanément à une résolution unicellulaire et même subcellulaire, comme même avant 25,26,27. Troisièmement, le suivi immunitaire des études longitudinales et comparatives nécessite des protocoles reproductibles et la standardisation de chaque étape du flux de travail, y compris l’acquisition et l’analyse des données. Les contrôles manuels conventionnels peuvent être subjectifs, et la maintenance des instruments et les contrôles de qualité peuvent varier, ce qui affecte l’exploration et l’interprétation des données. L’acquisition automatisée et les plug-ins mettant en œuvre l’analyse des données permettent de minimiser la variabilité des données28.
Les ToC attirent énormément l’attention dans la recherche sur le cancer en raison de leur capacité à reproduire fidèlement plusieurs caractéristiques de l’EUT et à remplacer, au moins dans certains contextes expérimentaux, les tumeurs in vivo 12. Tout en fournissant un modèle tout à fait réaliste de l’architecture tumorale-tissulaire, de la complexité multicellulaire et de l’interaction dynamique entre les composants cellulaires de l’EUT, les ToC ne sont toujours pas en mesure de remplacer complètement les études animales en termes de réflexion sur la complexité des réponses immunitaires systémiques, en particulier l’ensemble des mécanismes responsables de l’émergence d’étapes limitant le taux pour chacune des étapes du cycle cancer-immunité12, 29. Aéroport de Lyna Au-delà de cet aspect, le domaine de l’onco-immunologie continuera de bénéficier de l’utilisation des ToC, car les cycles et la vitesse de l’innovation scientifique les rapprochent de plus en plus des modèles in vivo12.
En conclusion, le protocole décrit ici sert d’outil d’analyse et de découverte puissant et simple pour démêler les complexités dynamiques du TME. De plus, les caractéristiques liées au temps et au coût de ce protocole permettent sa faisabilité à grande échelle. Le défi à venir est de le normaliser pour une utilisation clinique afin de mieux informer et guider les décisions thérapeutiques pour les patients atteints de cancer.

Au cours des dernières décennies, l’immunothérapie a été à l’avant-garde des options de pointe pour le traitement du cancer. L’exploitation du système immunitaire à des fins antitumorales a fourni une puissante preuve de concept au profit des patients pour diverses hémopathies malignes et solides avec des pronostics historiquement mauvais. Comme l’immunothérapie offre une opportunité pour des cancers autrement difficiles à traiter, elle connaît un rythme de progrès étonnamment rapide. De tels progrès peuvent être, au moins en partie, attribués à la compréhension affinée de l’interaction entre les cellules cancéreuses et les cellules immunitaires. Cette interaction ressemble à un « moteur » que le système immunitaire déclenche pour détruire les cellules cancéreuses, ce qu’on appelle le cycle cancer-immunité. Cette réponse immunitaire anticancéreuse progresse à trois niveaux principaux : la reconnaissance, le traitement et la réaction. Tout d’abord, dans la phase de reconnaissance, les antigènes tumoraux (Ag) produits lors de la formation de la tumeur sont libérés par les cellules cancéreuses mourantes dans le microenvironnement tumoral (TME, étape 1) et englouties par les cellules dendritiques infiltrant la tumeur (DC, étape 2). Ensuite, dans la phase de traitement, les DC présentent les épitopes des Ags tumoraux capturés à travers les molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH), expriment à leur surface des niveaux plus élevés de molécules costimulatrices (étape 3) et se déplacent vers les ganglions lymphatiques draineurs de tumeurs (dLN) pour présenter leur cargaison aux lymphocytes T CD8 naïfs (CD8N, étape 4). Toutes ces étapes convergent dans le processus final de réaction au cours duquel les lymphocytes T CD8 (CD8C-P) spécifiques de l’Ag tumoral sont activés, deviennent des lymphocytes T CD8 effecteurs (CD8E) et subissent une expansion clonale (étape 5). Les cellulesE CD8 quittent ensuite les dLN et se dirigent vers le TME par le sang (étape 6) où elles reconnaissent et se lient spécifiquement aux cellules cancéreuses par l’interaction entre leur récepteur des cellules T (TCR) et leurs Ags tumoraux apparentés, libèrent des molécules cytotoxiques [c’est-à-dire l’interféron (IFN)-γ, les perforines et les granzymes (Grzs)] et tuent les cellules cancéreuses (étape 7)1, 2. Aéroport La destruction des cellules cancéreuses conduit à la libération d’autres Ags tumoraux pour alimenter le cycle cancer-immunité. En fait, à travers toutes ces étapes, le système immunitaire détruit et rejette les cellules cancéreuses beaucoup plus souvent qu’on ne le suppose. Cependant, chez les patients atteints de cancer, au moins une de ces étapes ne fonctionne pas correctement. Nous et d’autres avons montré que les cellules cancéreuses cherchent à bloquer la réponse immunitaire en évoluant vers des variantes plus agressives et immunitairement privilégiées 3,4,5 ou en entravant l’efficacité des cellules T 6,7.
La recherche sur le cancer et le développement de médicaments anticancéreux reposent tous deux sur des modèles expérimentaux qui permettent d’étudier la relation entre le cancer et les cellules immunitaires, ce que l’on appelle l’onco-immunologie. Voici des modèles in vitro rapides, fiables, reproductibles et peu coûteux qui reproduisent de manière exhaustive chaque étape du cycle d’onco-immunologie et offrent une vue rapide et claire des ensembles de caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles de l’immunosurveillance et éventuellement de l’immunoédition.
La cytométrie en flux multiparamétrique (mFC) est l’un des outils d’analyse unicellulaire les plus performants dans la recherche fondamentale sur le cancer, le diagnostic et la recherche translationnelle dans les essais cliniques sur le cancer. Comme il permet de capturer simultanément plus de caractéristiques dans chaque cellule, mFC a gagné sa place de plate-forme d’analyse de référence en onco-immunologie. Il associe une sensibilité et une spécificité élevées à la possibilité de mesurer rapidement et de manière reproductible plusieurs modèles d’expression protéique et propriétés fonctionnelles à partir d’une seule cellule à partir de suspensions cellulaires hétérogènes et même hétérotypiques, comme celles du TME 8,9,10. Étant donné que les profils d’expression phénotypiques et fonctionnels sont sensibles au facteur temps, il est essentiel d’accorder une attention particulière à la conception de l’expérience, à la sélection de panels, de témoins et d’anticorps titrés appropriés, ainsi qu’à l’utilisation appropriée du traitement des échantillons et de l’instrumentation pour assurer la fiabilité, la comparabilité et la reproductibilité des résultats et pour interpréter avec confiance le résultat de l’expérience11.
Les dispositifs microfluidiques de tumeur sur puce (ToCs) modélisent le TME en permettant des biomimétiques à l’échelle microscopique in vitro de la dynamique et des interactions des cellules cancéreuses et immunitaires 12,13,14,15. Plus précisément, les ToC sont des dispositifs de culture cellulaire microfluidique multicanaux capables d’héberger divers types de cellules organisés en cultures bidimensionnelles (2D) ou tridimensionnelles (3D) et capables de modéliser avec une grande fidélité et de contrôler avec une grande précision, des unités structurelles et fonctionnelles clés telles que les interactions cellulaires hétérotypiques et les flux de gradients chimiques qui se produisent physiologiquement dans le TME12, 13, 14 et 15. En particulier, la chimioattraction et les trajectoires immunitaires, ainsi que l’interaction des cellules immunitaires avec les cellules cancéreuses, peuvent être surveillées en temps réel et quantifiées par microscopie time-lapse et analyse de suivi automatisée 5,12,13,14,15,16. De plus, les ToC offrent la possibilité d’analyser et de manipuler les processus cruciaux régulant l’apparition et la progression du cancer et la réponse au traitement17.
Dans cet article, les mFC et les ToC sont combinés pour étudier tous les niveaux de la réponse immunitaire anticancéreuse passant par la phagocytose médiée par DC des Ags cancéreux (étapes 1-3), l’amorçage croisé des lymphocytes T (étape 4), l’activation et l’expansion clonale (la dernière au moyen de la technologie de cycloaddition catalysée par la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EdU) et Cu(I), une méthodologie très sensible et précise, étape 5), la désignation des cellules CD8E vers l’EUT (étape 6) et, enfin, la destruction des cellules cancéreuses médiée par les cellules CD8E (étape 7, figure 1).
Ce travail contribue à l’effort visant à établir des protocoles standard simples, rapides et fiables pour étudier le cycle cancer-immunité. L’amélioration et l’intégration des modèles mFC et ToC dans la recherche sur le cancer, la dynamique des EUT et la réponse au traitement présentent un grand potentiel, car ces modèles offrent une fidélité biologique ainsi qu’un contrôle expérimental. Par conséquent, ce protocole aide à recréer, de manière progressive, le cycle cancer-immunité en permettant de caractériser, de surveiller et de manœuvrer en temps opportun les rôles des acteurs cellulaires individuels et leurs interactions réciproques sur l’immunosurveillance naturelle et acquise. En fin de compte, cela permettra d’affiner, de réduire et de remplacer les études sur les animaux tout en fournissant des informations essentielles pour déjouer les tumeurs et guider les soins cliniques. Enfin, les avantages et les limites de la mFC et de la ToC sont discutés de manière critique et comparés aux technologies de pointe (par exemple, les analyses spatiales à haute résolution cellulaire et même subcellulaire) pour faire avancer la recherche et la thérapie en onco-immunologie.

<table><tbody><tr><td>Microtubes de 1,5 ml&nbsp ;</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>100 kV litographie par faisceau d’électrons</td><td>Vistec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mm boîtes de Pétri</td><td>Greiner Bio One</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>Plaques 12 puits</td><td>Euroclone</td><td>&nbsp ; ET3012</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de 15 et 50 mL</td><td>Corning&nbsp ;</td><td>352096 ; 352070</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu ; crépine à cellules M&nbsp ;</td><td>Corning&nbsp ;</td><td></td><td></td>CLS431750</tr><tr><td>tubes en polystyrène de 5 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>120180</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu ; crépine à cellules M&nbsp ;</td><td>Corning&nbsp ;</td><td></td><td></td>CLS431751</tr><tr><td>flacon de culture cellulaire de 75 cm2</td><td>Euroclone</td><td>&nbsp ; ET7076</td><td></td></tr><tr><td>Lingettes</td><td></td><td></td><td></td>adsorbantes</tr><tr><td>Feuille</td><td></td><td></td><td></td>d’aluminium</tr><tr><td>anti-souris CD107a (LAMP-1) Anticorps</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-111-319</td><td></td></tr><tr><td>anti-souris CD25 (7D4) Anticorps&nbsp ;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-118-678</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-souris CD3 (17A2)</td><td>BioLegend</td><td>100206</td><td></td></tr><tr><td>Aptes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440140</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Plus Kit de fixation/perméabilisation avec BD GolgiPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>555028</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de transport de protéines BD GolgiPlug (contenant de la Brefeldin A)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>555029</tr><tr><td>Inhibiteur du transport de la protéine BD GolgiStop (contenant du monensin)</td><td>BD Biosciences</td><td>554724</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>US Biological, Salem</td><td>A1312</td><td></td></tr><tr><td>CD11c Anticorps monoclonal (N418)</td><td>eBioscience</td><td>12-0114-81</td><td></td></tr><tr><td>CD137 (4-1BB) Anticorps monoclonal (17B5)</td><td>eBioscience</td><td>17-1371-82</td><td></td></tr><tr><td>CD3 Anticorps monoclonal (17A2)</td><td>eBioscience</td><td>25-0032-82</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal CD44 (IM7)</td><td>eBioscience</td><td>11-0441-82</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal CD45 (30-F11)</td><td>Invitrogen</td><td>MCD4528</td><td></td></tr><tr><td>CD69 Anticorps monoclonal (H1.2F3)</td><td>eBioscience</td><td>48-0691-82</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal CD8a (53-6.7)</td><td>eBioscience</td><td>11-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>CD8a Anticorps monoclonal (53-6.7)</td><td>eBioscience</td><td>17-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>CD95 (APO-1/Fas) Anticorps monoclonal (15A7)</td><td>eBioscience</td><td>53-0951-82</td><td></td></tr><tr><td>Lames de comptage cellulaire</td><td>Kova International</td><td>87144E</td><td></td></tr><tr><td>Masques à quartz de chrome</td><td>MB W& A, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Kit de dosage de cytométrie en flux</td><td>Invitrogen</td><td>C10635</td><td></td></tr><tr><td>Cytomètre en flux CytoFLEX</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit d’élimination des cellules mortes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr> Solution <tr><td>saline tamponnée au phosphate (D-PBS)</td><td>EuroClone</td><td>ECB4053L</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>EuroClone</td><td>ECS0180L</td><td></td></tr><tr><td>Flowjo v10.0.7</td><td>Flowjo, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal Granzyme B (NGZB)</td><td>eBioscience</td><td>12-8898-82</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>plaque chauffante</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubateur de culture cellulaire humifié (37&deg ;, 5 % CO2)</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Machine à glace</td><td>Brema Machines</td><td></td><td></td>à glace</tr><tr><td>IFN gamma Anticorps monoclonal (XMG1.2)</td><td>eBioscience</td><td>11-7311-82</td><td></td></tr><tr><td>Illustrator CC 2015</td><td>Adobe Systems Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institute of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incucyte 2022A Logiciel</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incucyte Cytotox Dye pour le comptage des cellules mortes</td><td>Sartorius</td><td>4632</td><td></td></tr><tr><td>Incucyte SX5 Live-Cell Analysis System&nbsp ;</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JuLi Smart Fluorescent Live Cell Imaging Microscope</td><td>Bulldog Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laboratory bench Réfrigérateur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de laboratoire (4&deg ; C)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Armoire de sécurité de laboratoire (Classe II)</td><td>Angelantoni</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine 200 mM</td><td>EuroClone</td><td>ECB3004D</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Aqua Kit de teinture à cellules mortes</td><td>Invitrogen</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Kit de teinture à cellules mortes dans le proche infrarouge fixable</td><td>Invitrogen</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>Colonnes MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201; 130-042-401&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Séparateurs MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-10 ; 130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MCA205 lignée cellulaire de fibrosarcome de souris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SCC173</td><td></td></tr><tr><td>Animalerie microbiologiquement contrôlée équipée d’une cabine</td><td></td><td></td><td></td>de sécurité de classe II</tr><tr><td>MicroCL 21R Microcentrifugeuse</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002552</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel&nbsp ;</td><td>Microsoft, Redmond</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Souris : C57BL/6J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Naive CD8a+ T Cell Isolation Kit, souris</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-543</td><td></td></tr><tr><td>Nikon ECLIPSE Ts2</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements BR 5.30.0064-BIT</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liographie optique</td><td>EVG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline G sel de sodium et sulfate de streptomycine</td><td>EuroClone</td><td>ECB3001D/1</td><td></td></tr><tr><td>Aide à la pipette</td><td>Drummond Scientific Co., Broomall, PA</td><td>&nbsp ; 4-000-201</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PKH67 Kits de liaison de cellules fluorescentes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PKH67GL-1KT</td><td>Kit de lamelles</td></tr><tr><td>en plastique</td><td>IBIDI</td><td>10812</td><td></td></tr><tr><td>Iodure de propidium</td><td>Thermo Scientific</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Système de gravure ionique réactive</td><td>Oxfordlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640)</td><td>Pipettes</td> sérologiques <td>EuroClone ECB9006L</td><td></td></tr><tr><td>(2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL)</td><td>Corning- Millipore-Sigma ; St. Louis, MO</td><td>CLS4486 ; CLS4487 ; CLS4488 ; </td><td></td>CLS4489</tr><tr><td>Série de centrifugeuses SL 16</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004031</td><td></td></tr><tr><td>Scalpels stériles, pinces chirurgicales, ciseaux et pinces</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pointes stériles (1&ndash ; 10 &mu ; L, 20&ndash ; 200 &mu ; L, 1000 &mu ; L)</td><td>EuroClone Spa, Milan, Italie</td><td>ECTD00010 ; ECTD00020 ; ECTD00200 ; </td><td></td>ECTD01005</tr><tr><td>SU-8 série 3000</td><td>MicroChem corp, Newton, (MA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suite de poinçons de biopsie cutanée</td><td>Kai Medical, Tedpella</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dowsil, Dow Corning</td><td>101697</td><td></td></tr><tr><td>TCR bêta Anticorps monoclonal (H57-597)</td><td>eBioscience</td><td>12-5961-82</td><td></td></tr><tr><td>Bain</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>thermostatique</td><td></td><td></td><td></td>Minuterie</tr><tr><td>TMCS&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>92360</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0.4 %)</td><td>Thermo Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA w/ Phenol Red</td><td>EuroClone</td><td>ECM0920</td><td></td></tr><tr><td>Dessiccateur</td><td></td><td></td><td></td> sous vide</tr></tbody></table>

co-culture de systèmes in vitro pour reproduire le cycle cancer-immunité

Co-Culture In Vitro Systems to Reproduce the Cancer-Immunity Cycle

La recherche fondamentale sur le cancer et le développement de thérapies efficaces contre les attaques reposent toutes deux sur des études expérimentales détaillant les interactions entre le cancer et les cellules immunitaires, ce que l’on appelle le cycle cancer-immunité. Des systèmes de co-culture in vitro combinés à la cytométrie en flux multiparamétrique (mFC) et aux dispositifs microfluidiques (ToC) de tumeur sur puce permettent une surveillance et une caractérisation simples, rapides et fiables de chaque étape du cycle cancer-immunité et permettent d’identifier les mécanismes responsables de faire pencher la balance entre l’immunosurveillance du cancer et l’immunoévasion. Une compréhension approfondie des interactions dynamiques entre le cancer et les cellules immunitaires fournit des informations essentielles pour déjouer les tumeurs et accélérera le rythme de la personnalisation et de l’optimisation thérapeutiques chez les patients. Plus précisément, nous détaillons ici un protocole simple assisté par mFC et ToC pour démêler les complexités dynamiques de chaque étape du cycle cancer-immunité dans les lignées cellulaires cancéreuses murines et les cellules immunitaires dérivées de souris, et nous nous concentrons sur l’immunosurveillance. Compte tenu des caractéristiques liées au temps et à l’argent de ce protocole, il est certainement réalisable à grande échelle. De plus, avec des variations mineures, ce protocole peut être à la fois adapté aux lignées cellulaires cancéreuses humaines et aux cellules immunitaires dérivées du sang périphérique humain et combiné à une inhibition génétique et/ou pharmacologique de voies spécifiques afin d’identifier des biomarqueurs de la réponse immunitaire.

La capacité des CD CD11c+, le sous-ensemble de phagocytes largement connu spécialisé pour la présentation croisée21,22 et déclenché, comme le montre la figure 2A, à engloutir les corps apoptotiques à partir de cellules cancéreuses MCA205 irradiées par UV qui étaient précédemment marquées avec le lieur de cellules fluorescentes PKH67 a été évaluée par mFC. Comme prévu, les CD CD11c+ ont capturé efficacement les cellules MCA205 apoptotiques in vitro à 37 °C mais pas à 4 °C (Figure 2B, étapes 1 à 3 du cycle cancer-immunité). Pour caractériser davantage la maturation des DC après l’absorption de l’Ag tumoral, l’expression de surface des molécules de ligand de costimulation et de point de contrôle immunitaire a été vérifiée et comparée dans les DC avant et après phagocytose (DCN et DCPHAGO, respectivement). Les cellules DCPHAGO ont montré des niveaux significativement accrus de CD86 et de CMH-II, ainsi que des niveaux réduits de PDL1 (Figure 2C, étape 4 du cycle cancer-immunité). De plus, l’expansion clonale des lymphocytes T CD8 une fois amorcée par DCPHAGO (CD8C-P) a été évaluée en évaluant l’incorporation de l’analogue de la thymidine EdU (étape 5 du cycle cancer-immunité). En contrôlant correctement les lymphocytes T CD3+CD8+ vivants (Figure 3A), il a été constaté que ~20% descellules CD8 C-P, représentant les clones exprimant la molécule CD95 et portant des TCR spécifiques de l’Ag tumoral (Figure supplémentaire 1), ont subi une prolifération par rapport aux cellules T CD8 naïves (CD8N, Figure 3B). En utilisant des modèles ToC (Figure 3C), on a évalué la capacité desCD8 C-P à détecter et à réagir à la chimioattraction par les alarmines libérées par les cellules cancéreuses, reflétant ainsi le retour des lymphocytes T CD8 spécifiques de la tumeur vers le TME (étape 6 du cycle cancer-immunité). Plus précisément, les ToC ont été utilisés pour permettre et suivre l’attraction et l’interaction chimiques et physiques entre les cellules immunitaires non adhérentes, se déplaçant de la chambre immunitaire à la chambre tumorale et les cellules cancéreuses adhérentes reposant dans la chambre tumorale. Des microphotographies prises à différents moments post-co-culture ont montré une migration progressive de CD8C-P vers les cellules cancéreuses en croisant des microcanaux (Figure 3C). Il est intéressant de noter que les cellules immunitaires en approche pouvaient interagir de manière stable et efficace avec les cellules cancéreuses à 24 h, 48 h et 72 h (figure 3D). Enfin, il a été analysé la réponse de CD8C-P logé au TME et restimulé par des Ags cancéreux (CD8E) en évaluant, par mFC, les niveaux d’expression de surface des marqueurs d’activation CD69 précoces (Figure supplémentaire 2A) et CD44 tardifs, CD25 (Figure 4A), ainsi que l’expression membranaire des marqueurs de réactivité tumorale CD137 (Figure 4B) et CD107a (Figure supplémentaire 2B) par rapport aux CD8N et CD8C-P (étape 7 du cycle cancer-immunité). Nous avons également évalué la production intracellulaire des molécules cytotoxiques Grz-B (Figure 5A) et IFN-γ (Figure 5B). Il est intéressant de noter que tous ces niveaux de marqueurs ont augmenté progressivement et significativement et ont atteint un pic d’expression à 72 h de co-culture, reflétant ainsi une activation tardive et efficace. En conséquence, des cellules MCA205 apparentées co-cultivées ont subi des niveaux significatifs de mort médiée par CD8E, comme l’ont révélé un système d’analyse de cellules vivantes et des analyses mFC (Figure 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig01.jpg"> Figure 1 : Vue d’ensemble du protocole expérimental d’étude du cycle cancer-immunité. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig02.jpg"> Figure 2 : Absorption et présentation de l’Ag par les cellules cancéreuses médiées par les DC. (A) Stratégie de déclenchement pour l’analyse des mFC DC. Au cours de l’acquisition du mFC et de l’analyse des données, les échantillons ont été séquentiellement contrôlés (1) pour la morphologie en traçant FSC-A et SSC-A ; (2) pour les singlets en traçant FSC-A et FSC-H ; et (3) pour la viabilité en traçant le proche infrarouge et le SSC-A. Les cellules viables ont finalement été analysées pour le marqueur de surface spécifique CD11c. (B) Analyse mFC de la capacité des DC CD11c+ à engloutir des corps apoptotiques à partir de cellules cancéreuses MCA205 marquées PKH67 et irradiées par UV à 37 °C et 4 °C (étapes 1 à 3 du cycle cancer-immunité). Tracés biparamétriques représentatifs et histogramme montrant le pourcentage de cellules CD11c+PKH67+ (moyenne ± s.e.m. avec un point de données individuel, une expérience représentative sur trois est présentée). (C) analyse mFC des molécules de surface du ligand du costimulateur et du point de contrôle immunitaire sur les DC avant et après phagocytose (DCN et DCPHAGO, respectivement ; étape 4 du cycle cancer-immunité). Les histogrammes représentent le pourcentage (moyenne ± s.e.m. et points de données individuels, n = 3 expériences indépendantes) des cellules CD11c+CD86+, CD11c+MHC-II+ et CD11c+PDL1+. (B) Test t de Student bilatéral non apparié avec correction de Welch comparé à 4 °C. (C) Test t de Student bilatéral non apparié comparé à DCN.Veuillez <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig02large.jpg" target="_blank">cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig03.jpg"> Figure 3 : Prolifération et trafic des lymphocytes T CD8 vers les cellules cancéreuses après amorçage croisé. (A) Stratégie de contrôle pour l’analyse des lymphocytes T CD3+CD8+. Au cours de l’acquisition du mFC et de l’analyse des données, les échantillons ont été séquentiellement contrôlés (1) pour la morphologie en traçant FSC-A et SSC-A ; (2) pour les singlets en traçant FSC-A et FSC-H ; et (3) pour la viabilité en traçant Aqua et SSC-A. Les cellules viables ont finalement été analysées pour la coloration EdU de prolifération spécifique. (B) analyse mFC de l’expansion clonale des lymphocytes T CD8 au moyen de la technologie EdU (étape 5 du cycle cancer-immunité). Les histogrammes monoparamétriques représentent le pourcentage (moyenne ± s.e.m. avec un point de données individuel, une expérience représentative sur trois est présentée) de lymphocytes T CD8 naïfs EdU+ et croisés proliférants (CD8N et CD8C-P, respectivement). (C, D) Modèle microfluidique ToC des lymphocytes T CD8 renvoyant vers le TME (étape 6 du cycle cancer-immunité). (C) Planimétrie schématique d’un TdC. Les deux chambres de culture latérales, abritant des cellules immunitaires et cancéreuses, sont reliées par des canaux de l’ordre du micron (largeur = 12 μm, longueur = 10 μm, hauteur = 10 μm). Les compartiments de culture cellulaire mesurent 1 mm de large, 8 mm de long et 100 μm de haut. Les microphotographies générées lors des enregistrements en accéléré représentent la migration de CD8C-P vers les cellules cancéreuses à différents points temporels (de 0 à 72 h ; barre d’échelle, 100 μm). (D) Des graphiques représentant les trajectoires desCD8 C-P individuels (n = 100 cellules par condition) vers les cellules cancéreuses cibles (points noirs) dans les 24 à 72 h sont présentés (barre d’échelle, 10 μm). (A) Test t de Student bilatéral non apparié avec correction de Welch par rapport au CD8N. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig04.jpg"> Figure 4 : Réactivité tumorale des lymphocytes T CD8 après restimulation avec des cellules cancéreuses vivantes. (A) Analyse mFC des niveaux d’expression de surface des marqueurs d’activation CD44, CD25 sur les lymphocytes T CD8 restimulés par des Ags cancéreux (CD8E) (étape 7 du cycle cancer-immunité) jusqu’à 72 h. Graphiques biparamétriques représentatifs et histogramme montrant le pourcentage de lymphocytes T CD44+CD25+ CD8 dans CD8N, CD8C-P, CD8E à 48 h et 72 h (moyenne ± s.e.m. et points de données individuels, n = 3 expériences indépendantes). (B) analyse mFC de l’expression membranaire du marqueur de réactivité tumorale CD137 sur CD8E. Tracés biparamétriques représentatifs et histogramme montrant le pourcentage de lymphocytes T CD137+ CD8 dans CD8N, CD8C-P, CD8E à 48 h et 72 h (moyenne ± s.e.m. et points de données individuels, une expérience représentative sur trois est présentée). (A,B) Test ANOVA unidirectionnel ordinaire suivi d’une correction de Bonferroni par rapport à CD8N. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig05.jpg"> Figure 5 : Production de cellules T CD8 de Grz-B et d’IFN-γ. (A) Analyse mFC des niveaux d’expression intracellulaire de Grz-B sur CD8E (étape 7 du cycle cancer-immunité). Graphiques d’histogrammes représentatifs montrant les cellules T CD8 Grz-B+ MFI dans CD8N, CD8C-P, CD8E à 48 h et 72 h (moyenne ± s.e.m. et points de données individuels, n = 3 expériences indépendantes). (B) Analyse mFC de l’IFN-γ intracellulaire sur CD8E. Graphiques d’histogrammes représentatifs montrant le pourcentage de lymphocytes T CD γ+ IFN-+ CD8 dans CD8N, CD8C-P, CD8E à 48 h et 72 h (moyenne ± s.e.m. et points de données individuels, n = 3 expériences indépendantes). (A,B). Test ANOVA unidirectionnel ordinaire suivi d’une correction de Bonferroni par rapport à CD8N. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig06.jpg"> Figure 6 : Tueur tumorale médiée par les lymphocytes T CD8. (A) Analyse mFC de la mort des cellules CD45- induite par CD8E après 72 h de co-culture (étape 7 du cycle cancer-immunité). Les histogrammes représentent le pourcentage (moyenne ± s.e.m. et points de données individuels, n = 3 expériences indépendantes) de cellules PI+CD45− mourantes. (B) Analyse sur cellules vivantes de la mort cellulaire cancéreuse médiée par CD8E. Des images représentatives et un graphique montrant l’incorporation de Cytotox Red par des cellules cancéreuses mourantes et mortes (une expérience représentative sur trois est présentée). (A) Test t de Student bilatéral non apparié comparé aux cellules cancéreuses seules (CTR). (B) Test de Mann-Whitney bilatéral comparé au CTR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Figure supplémentaire 1 : Les diagrammes d’histogrammes représentent l’IMF de CD95+TCR-β+ CD8N et CD8C-P. Test t de Student bilatéral non apparié comparé à CD8N. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/Suppl.%20Figure%201_revised.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire 2 : Activation des lymphocytes T CD8. (A) Analyse mFC des niveaux d’expression de surface du marqueur d’activation précoce de CD69 sur CD8E (étape 7 du cycle cancer-immunité). Tracés biparamétriques représentatifs et histogramme montrant le pourcentage de lymphocytes T CD69+ CD8 dans CD8N, CD8C-P, CD8E à 48 h et 72 h (moyenne ± s.e.m. et points de données individuels, une expérience sur trois). (B) analyse mFC de l’expression membranaire de la protéine associée lysosomale CD107a sur CD8E. Tracés biparamétriques représentatifs et histogramme montrant le pourcentage de lymphocytes T CD107a+ CD8 dans CD8N, CD8C-P, CD8E à 48 h et 72 h (moyenne ± s.e.m. et points de données individuels, une expérience représentative sur trois est présentée). (A,B). Test ANOVA unidirectionnel ordinaire suivi d’une correction de Bonferroni par rapport à CD8N. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/Suppl.%20Figure%202_revised%20.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Tableau supplémentaire 1 : Mélanges d’anticorps étape 3.3.2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Ici, nous détaillons un protocole simple, rapide et fiable assisté par cytométrie en flux multiparamétrique et tumeur sur puce pour surveiller et caractériser les étapes constituant le cycle cancer-immunité. En effet, une compréhension approfondie des interactions entre le cancer et les cellules immunitaires fournit des informations essentielles pour déjouer les tumeurs et guider les soins cliniques.

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Surveillance de l’invasion des cellules cancéreuses et de la cytotoxicité des lymphocytes T dans la culture 3D

À l’ère de l’immunothérapie et du profilage génomique unicellulaire, la biologie du cancer nécessite de nouveaux outils in vitro et informatiques pour étudier l’interface tumorale-immunitaire dans un contexte spatio-temporel approprié. Nous décrivons des protocoles pour exploiter les co-cultures microfluidiques immunitaires contre les tumeurs dans des contextes 2D et 3D, compatibles avec la surveillance dynamique et multiparamétrique des fonctions cellulaires.

Modèles de co-culture microfluidique pour disséquer la réponse immunitaire dans des microenvironnements tumoraux in vitro

Le présent protocole décrit un flux de travail expérimental qui permet l’analyse ex vivo de la stimulation des lymphocytes T humains dans un système de co-culture allogénique avec des cellules tumorales prétraitées.

Analyse de l’activité des lymphocytes T humains dans un cadre de co-culture allogénique de cellules tumorales prétraitées

Le protocole décrit une méthode de création d’un modèle d’organoïde de cancer colorectal (CRC) dérivé d’un patient co-cultivé avec des lymphocytes infiltrant la tumeur (TIL) afin d’étudier leurs interactions et leur potentiel thérapeutique. Ce modèle fournit une plate-forme préclinique pour explorer les réponses immunitaires dans le microenvironnement tumoral et pour prédire l’efficacité de la thérapie basée sur le TIL pour le traitement personnalisé du CCR.

Mise en place d’un système de co-culture d’organoïdes de tumeurs colorectales dérivées de patients et de lymphocytes infiltrant la tumeur (TIL)

Ce protocole décrit la reprogrammation in vivo de cellules cancéreuses de souris en cellules dendritiques de type 1 dans le microenvironnement tumoral par l’expression forcée des facteurs de transcription PU.1, IRF8 et BATF3.

Reprogrammation in vivo de cellules tumorales en cellules dendritiques conventionnelles de type 1

Découvrez un protocole de co-culture in vitro simple et fiable pour surveiller chaque étape du cycle cancer-immunité. Cette méthode permet d'étudier les interactions entre cellules cancéreuses et immunitaires.

Co-culture de systèmes in vitro pour reproduire le cycle cancer-immunité

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