Name: Utilisation d’organoïdes intestinaux humains pour comprendre l’épithélium de l’intestin grêle au niveau transcriptionnel d’une seule cellule (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-28T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Découvrez l'analyse transcriptomique à cellule unique d'organoïdes intestinaux humains. Cette méthode révèle l'hétérogénéité cellulaire de l'épithélium intestinal et permet d'identifier des biomarqueurs pour les maladies intestinales.

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Les auteurs reconnaissent les subventions U19 AI157984, U01 DK103168, U19 AI144297, P30 DK56338, P01 AI057788, U19 AI116497 et l’avis d’accord de coopération de la NASA / TRISH NNX16AO69A.

Intégration de la transcriptomique unicellulaire avec les organoïdes intestinaux humains

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Blutt, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+microphysiological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal microphysiological systems.</a> Exp Biol Med. 242 (16), 1633-1642 (2017).</li>
<li>VanDussen, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+enhanced+human+gastrointestinal+epithelial+culture+system+to+facilitate+patient-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays.</a> Gut. 64 (6), 911-920 (2015).</li>
<li>Elmentaite, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+of+the+human+intestinal+tract+mapped+across+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cells of the human intestinal tract mapped across space and time.</a> Nature. 597 (7875), 250-255 (2021).</li>
<li>Hickey, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+the+human+intestine+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Organization of the human intestine at single-cell resolution.</a> Nature. 619 (7970), 572-584 (2023).</li>
<li>Burclaff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proximal-to-distal+survey+of+healthy+adult+human+small+intestine+and+colon+epithelium+by+single-cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">A proximal-to-distal survey of healthy adult human small intestine and colon epithelium by single-cell transcriptomics.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 13 (5), 1554-1589 (2022).</li>
<li>Triana, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+reveals+immune+response+of+intestinal+cell+types+to+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics reveals immune response of intestinal cell types to viral infection.</a> Mol Syst Biol. 17 (7), e9833(2021).</li>
<li>Triana, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analyses+reveal+SARS-CoV-2+interference+with+intrinsic+immune+response+in+the+human+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-cell analyses reveal SARS-CoV-2 interference with intrinsic immune response in the human gut.</a> Mol Syst Biol. 17 (4), e10232(2021).</li>
<li>Fujii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+intestinal+organoids+maintain+self-renewal+capacity+and+cellular+diversity+in+niche-inspired+culture+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2021).</li>
<li>Beumer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+gradient+along+the+intestinal+villus+axis+controls+zonated+enterocyte+and+goblet+cell+states%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">BMP gradient along the intestinal villus axis controls zonated enterocyte and goblet cell states.</a> Cell Rep. 38 (9), 110438(2022).</li>
<li>Beumer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mRNA+and+secretome+atlas+of+human+enteroendocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution mRNA and secretome atlas of human enteroendocrine cells.</a> Cell. 182 (4), 1062-1064 (2020).</li>
<li>Busslinger, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gastrointestinal+epithelia+of+the+esophagus%2C+stomach%2C+and+duodenum+resolved+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution.</a> Cell Rep. 34 (10), 108819(2021).</li>
<li>Luecken, M. D., Theis, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+best+practices+in+single-cell+RNA-seq+analysis%3A+a+tutorial%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Current best practices in single-cell RNA-seq analysis: a tutorial.</a> Mol Syst Biol. 15 (6), e8746(2019).</li>
<li>Heumos, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practices+for+single-cell+analysis+across+modalities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Best practices for single-cell analysis across modalities.</a> Nat Rev Genet. 24 (8), 550-572 (2023).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

À l’aide de plateformes de génomique unicellulaire, des systèmes biologiques complexes, tels que les cultures HIO dérivées de tissus qui modélisent l’épithélium intestinal, peuvent être décomposés pour produire des contributions cellulaires individuelles à la réponse biologique globale 4,5,6. L’hétérogénéité cellulaire et les populations cellulaires rares peuvent également être identifiées et interrogées. L’entrée cellulaire doit être optimisée pour maximiser la sortie à l’aide de plates-formes basées sur la transcriptomique d’une seule cellule. Nous décrivons ici des protocoles qui produiront des suspensions de cellules uniques hautement viables et de bonne qualité, ce qui augmentera la probabilité d’obtenir des données transcriptomiques de haute qualité en aval. La connaissance du protocole est de la plus haute importance, et il est recommandé d’effectuer plusieurs exercices avant de procéder à la préparation de la bibliothèque. La réalisation reproductible de suspensions unicellulaires viables est suggérée avant d’utiliser les cellules pour la préparation de la banque. La rapidité avec laquelle le protocole est mis en œuvre est de la plus haute importance, car la vitesse est directement proportionnelle aux résultats de viabilité. Sur cette base, il est conseillé de limiter le nombre d’échantillons manipulés en même temps. Il est recommandé d’interagir avec l’entité qui préparera les bibliothèques avant de lancer ces protocoles pour obtenir de l’aide au dépannage.
La viabilité de HIO influence directement la banque d’ADN envoyée pour le séquençage. La viabilité cellulaire du HIO dépend de plusieurs étapes de la préparation de la suspension de cellule unique, notamment la dissociation, la centrifugation, les tampons, le pipetage et la précision du comptage. L’objectif de la préparation des DOI pour la plateforme est d’établir un équilibre entre le maintien de la viabilité cellulaire et la qualité des échantillons. Pour obtenir des données de haute qualité, il est essentiel de minimiser les agrégats cellulaires, les cellules mortes, les acides nucléiques non cellulaires et les inhibiteurs biochimiques de la transcription inverse. Les cellules mourantes augmentent le bruit des acides nucléiques et contribuent à l’agglutination des cellules, entraînant des défaillances des données et des plateformes 7,8,9,10,11,12. Le filtrage avec une taille de filtre appropriée peut aider à supprimer les agrégats volumineux et à améliorer la qualité des données.
Plusieurs facteurs doivent être pris en compte pour réduire au minimum la mort cellulaire des HIO lors de la préparation de suspensions de cellules individuelles. Il est nécessaire d’obtenir au moins 80 % de cellules viables, et >90 % de viabilité est encore plus souhaitable. Les échantillons contenant un grand nombre de cellules non viables peuvent être améliorés à l’aide de stratégies visant à éliminer les cellules mortes, telles que les microbilles sur colonne, bien que celles-ci nécessitent davantage de cellules initiales et de plus grands volumes d’échantillons en raison de la perte lors de la manipulation. Les HIO sont particulièrement sensibles aux tampons et subiront la mort cellulaire s’ils sont laissés trop longtemps à RT dans certains tampons. Les milieux organoïdes entraînent le moins de perte cellulaire et de formation d’agrégats. Le pipetage peut également affecter la viabilité des HIO pendant la dissociation. Les pointes à alésage régulier peuvent cisailler les organoïdes, aidant à se dissocier en suspensions unicellulaires ; cependant, un pipetage trop rapide avec une pointe d’alésage régulière peut endommager les cellules HIO en raison des forces de cisaillement. Le pipetage lent avec des pointes à large diamètre minimise le stress sur les cellules HIO et améliore considérablement le nombre de cellules viables en aval. La centrifugation, le lavage et la remise en suspension sont d’autres facteurs qui peuvent influencer la qualité des suspensions de cellules uniques HIO. La centrifugation à godet oscillant permet d’obtenir une granulation plus douce des cellules HIO, ce qui permet de réduire le nombre de cellules mortes tout en minimisant la perte de cellules. Enfin, la précision du comptage pour déterminer la concentration est essentielle pour garantir que le maximum de cellules atteignent la plate-forme de synthèse de la banque. L’attention portée à ces détails permettra de réduire au minimum le stress exercé sur les cellules HIO pendant le processus d’isolement et d’assurer la plus grande probabilité de retour des données après le traitement.
Bien que la transcriptomique sur cellule unique soit un outil puissant pour disséquer les profils biologiques et les réponses au niveau4, 5 et 6 de la cellule unique, plusieurs limites doivent être prises en compte lors de l’application de la technologie à l’analyse des cultures d’organoïdes intestinaux humains. Tout d’abord, il peut y avoir des variations transcriptionnelles importantes en raison de la variabilité technique introduite lors de la préparation de la banque et du séquençage ou en raison d’effets de lot résultant de la préparation des échantillons. De plus, le séquençage peut entraîner un biais de couverture lorsque la profondeur de séquençage est inégale entre les gènes ou les cellules. Cela pose des défis lors de la détection de gènes faiblement exprimés ou de l’identification de populations de cellules rares. Deuxièmement, l’identification des types cellulaires peut être difficile en raison de l’hétérogénéité cellulaire et transcriptionnelle des cultures d’organoïdes et d’un profil cellulaire moins différencié par rapport à l’épithélium intestinal natif. Le couplage des réponses transcriptionnelles aux phénotypes fonctionnels est également un défi et nécessite une validation supplémentaire à l’aide d’autres approches ou essais. Troisièmement, cette approche n’inclut pas la prise en compte du contexte spatial ou de la dynamique temporelle des cellules. La procédure de dissociation supprime la possibilité de déduire des interactions cellule-cellule à partir des données transcriptionnelles. Il ne fournit qu’un seul instantané dans le temps de l’état cellulaire plutôt qu’un continuum biologique. Enfin, les approches transcriptionnelles sur cellule unique peuvent être coûteuses et nécessiter des outils informatiques spécialisés et une expertise en bioinformatique. Cependant, cette approche reste un outil de pointe dominant pour comprendre l’hétérogénéité cellulaire et identifier de nouveaux types de cellules.

L’épithélium de l’intestin grêle comporte deux zones distinctes : la crypte qui abrite les cellules souches intestinales (CSI) et les villosités, qui sont composées de cellules différenciées des lignées sécrétoires et absorbantes. À cette complexité s’ajoute la spécificité régionale de l’épithélium qui offre des propriétés fonctionnelles uniques entre les régions de l’intestin grêle. Des travaux pionniers ont permis d’établir des conditions de culture dans lesquelles la crypte de l’intestin grêle humain et les zones villosités peuvent être générées ex vivo à partir de tissus chirurgicaux ou de biopsies tissulaires1. Ces cultures comblent le fossé entre les études animales et les essais cliniques et révèlent la biologie cellulaire, la biochimie et la physiologie du tractus gastro-intestinal jusqu’alors inconnues. Les HIO se propagent sous forme de structures sphériques 3D à l’aide d’un milieu avec des facteurs de croissance qui favorisent la viabilité des cellules souches et des matrices de soutien extracellulaires. Ces conditions se traduisent par un modèle HIO semblable à une crypte qui se compose principalement de progéniteurs et de cellules souches. L’élimination des facteurs de croissance favorise la différenciation de l’ISC (modèle de type villosité) et la production de cellules épithéliales intestinales matures (caliciforme, entéroendocrine, touffe, entérocytes) dans des proportions appropriées, ainsi que la prolifération et la différenciation cellulaires, la polarisation, l’intégrité de la barrière, les caractéristiques spécifiques régionales et les réponses physiologiquesappropriées2. Les cultures HIO sont génétiquement stables et peuvent être propagées indéfiniment dans leur état de crypte. L’accès facile à la surface apicale de ces cultures est fourni par des conditions de culture qui permettent la croissance dans un format monocouche3. Les DOI permettent également d’inclure dans les analyses biologiques des considérations relatives à la variabilité individuelle de l’hôte, comme la génétique, l’âge, le sexe, l’origine ethnique et le statut pathologique. Les outils d’évaluation analytique et fonctionnelle sont identiques à ceux utilisés dans les approches centrées sur les lignées cellulaires transformées et comprennent une variété de techniques moléculaires telles que la cytométrie en flux, la microscopie, la transcriptomique, la protéomique et la métabolomique.
La transcriptomique unicellulaire révolutionne notre compréhension de la biologie et de la physiologie de l’intestin grêle en fournissant un aperçu des contributions individuelles de chaque type de cellule à un processus biologique. Des travaux pionniers utilisant cette technologie ont fourni un paysage des types de cellules présentes dans l’intestin humain natif 4,5,6. Les plateformes de profilage transcriptionnel unicellulaire permettent d’explorer le paysage transcriptionnel des cellules individuelles, permettant à l’hétérogénéité cellulaire d’être à l’avant-garde de l’exploration scientifique. Dans certaines plateformes de profilage transcriptionnel unicellulaire, le partitionnement microfluidique et le codage à barres sont utilisés pour générer des banques d’ADNc à partir d’ARNm cellulaires polyadénylés obtenus à partir d’un maximum de 10 000 cellules par échantillon. Sur cette plate-forme, des gouttelettes contenant des cellules uniques, des oligonucléotides à code-barres, des réactifs de transcription inverse et de l’huile forment une vésicule réactionnelle qui fait que tous les ADNc d’une seule cellule ont le même code-barres. Les ADNc à code-barres peuvent ensuite être séquencés efficacement à l’aide du séquençage de nouvelle génération. Les données générées peuvent être traitées à l’aide de logiciels et d’outils de visualisation, qui convertissent les séquences de code-barres en cartes de visualisation et en profils transcriptionnels unicellulaires. Les populations cellulaires peuvent être identifiées à l’aide de bases de données publiques sur l’épithélium 4,5,6 de l’intestin grêle humain. Bien que de nombreuses études aient utilisé cette plateforme pour interroger les organoïdes intestinaux murins au niveau de la cellule unique, l’analyse des réponses transcriptionnelles des HIO sur cellule unique a pris du retard par rapport à 7,8,9,10,11,12.
Nous présentons ici un guide étape par étape pour isoler des cellules viables à partir d’OHI de l’intestin grêle afin de les traiter sur des plateformes de profilage transcriptionnel unicellulaire (Figure 1). Nous fournissons des directives de culture et de différenciation ainsi que des composants de milieux qui ont été optimisés pour la différenciation épithéliale. Nous décrivons des méthodes de récupération cellulaire pour trois formats de culture différents : les cultures tridimensionnelles (3D) et monocouches, sur plastique ou sur des inserts de culture cellulaire à membrane. Nous fournissons des échantillons de données de regroupement obtenus à l’aide d’un logiciel open source pour dériver des gènes exprimés de manière différentielle dans chaque grappe.

<table><tbody><tr><td>[Leu15]-Gastrin I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9145</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>0,05 % Trypsine-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>0,4 % Bleu trypan</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Corning</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS Ca- Mg-Corning</td><td></td> <td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>24 mm Transwell</td><td>Costar</td><td>3412</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de culture tissulaire de surface Nunclon delta 24 puits</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>40 & micro ; crépine à cellules m</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro ; m Flowmi passoire à pointes</td><td>SP Bel-Art Labware</td><td>H13680-0040</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro ; m Flowmi tip strainer</td><td>SP Bel-Art Labware</td><td>H13680-0070</td><td></td></tr><tr><td>96 well plate</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>StemCell Technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>1X</td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Single Cell 3' GEM, Bibliothèque & Kit de perles de gel v3.1</td><td>10x Genomics</td><td>PN-1000128</td><td></td></tr><tr><td>Collagène IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5533-5MG</td><td>33 &micro ; g/mL</td></tr> de <tr><td>solution de récupération des cellules Corning&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>354253</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (Mg2-, Ca2-)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-136</td><td>1X</td></tr><tr><td>GlutaMAX-I</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>Invitrogen</td><td>15630-080</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>L-WRN média conditionné</td><td>ATCC</td><td>CRL-3276</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, GFR, sans phénol</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>souris EGF recombinant</td><td>Invitrogen</td><td>PMG8043</td><td>50 ng/mL</td></tr><tr><td>supplément de N2</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>1X</td></tr><tr><td>N-Acétylcystéine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td>500 &micro ; </td></tr><tr><td>M Nicotinamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7067</td><td>10 & micro ; M</td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Corning</td><td>3413</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Technologies des cellules souches</td><td>72308</td><td>10 & micro ; L</td></tr></tbody></table>

utilisation d’organoïdes intestinaux humains pour comprendre l’épithélium de l’intestin grêle au niveau transcriptionnel d’une seule cellule

Using Human Intestinal Organoids to Understand the Small Intestine Epithelium at the Single Cell Transcriptional Level

La transcriptomique sur cellule unique a révolutionné notre compréhension de la biologie cellulaire du corps humain. Des cultures d’organoïdes de l’intestin grêle humain à la pointe de la technologie fournissent des systèmes modèles ex vivo qui comblent le fossé entre les modèles animaux et les études cliniques. L’application de la transcriptomique sur cellule unique à des modèles d’organoïdes intestinaux humains (HIO) révèle la biologie cellulaire, la biochimie et la physiologie du tractus gastro-intestinal jusqu’alors inconnues. Les plateformes avancées de transcriptomique de cellules uniques utilisent le partitionnement microfluidique et le codage à barres pour générer des banques d’ADNc. Ces ADNc à code-barres peuvent être facilement séquencés par des plateformes de séquençage de nouvelle génération et utilisés par divers outils de visualisation pour générer des cartes. Ici, nous décrivons des méthodes de culture et de différenciation des HIO de l’intestin grêle humain dans différents formats et des procédures pour isoler des cellules viables à partir de ces formats qui conviennent à une utilisation dans des plateformes de profilage transcriptionnel unicellulaire. Ces protocoles et procédures facilitent l’utilisation des HIO de l’intestin grêle afin d’obtenir une meilleure compréhension de la réponse cellulaire de l’épithélium intestinal humain au niveau transcriptionnel dans le contexte d’une variété d’environnements différents.

Des suspensions unicellulaires ont été regroupées à partir de 2 à 3 puits d’insert de culture cellulaire membranaire, de monocouche et de HIO 3D pour assurer un rendement cellulaire suffisant et réduire les variations d’un puits à l’autre. Des banques de cellules uniques ont été préparées à l’aide de réactifs spécifiques à la plateforme de profilage transcriptionnel de cellule unique. et séquencé avec des lectures d’extrémité appariées sur une plate-forme de séquençage de nouvelle génération, 30 000 lectures/cellule. Les lectures ont été cartographiées, comptées et analysées à l’aide d’outils analytiques pour la génomique unicellulaire. Les cellules de faible qualité avec plus de 20 % de lecture mitochondriale, ou moins de 200 gènes comptés, ont été exclues de l’analyse. Pour évaluer la qualité des cellules, nous avons tracé le nombre de gènes, les UMI et le pourcentage de lectures mitochondriales par cellule (Figure 3) ; les cellules de haute qualité contiennent environ 3500 gènes, 15 000 UMI et 10% de lectures mitochondriales. Suite au filtrage, nous avons obtenu 4000 à 9500 cellules uniques selon le format de croissance HIO. Le clustering non supervisé et la réduction de la dimension UMAP ont permis d’identifier des clusters distincts représentant les types de cellules attendus, y compris les entérocytes absorbants et les cellules sécrétoires (Figure 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66749/66749fig01.jpg"> Figure 1 : Aperçu des étapes du protocole. Schémas décrivant les principales étapes de l’installation de différents formats d’OIH dans le flux de travail de données sur une seule cellule. Cette image a été créée à l’aide de Biorender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66749/66749fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66749/66749fig02.jpg"> Figure 2 : Images en fond clair. Les HIO prêts à être traités ont été imagés à l’aide d’un microscope à fond clair à un grossissement de 5X. À gauche, organoïdes 3D ; au milieu, plaque à 96 puits ; C’est vrai, Transwell. Barres d’échelle = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66749/66749fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66749/66749fig03.jpg"> Figure 3 : Contrôle de la qualité des données. Exemples de mesures de cellules uniques analysées isolées à partir de HIO jéjunaux cultivés en monocouches sur des plaques à 96 puits. Les graphiques en violon montrent le nombre de gènes (nFeature_RNA), les UMI (nCount_RNA) et le pourcentage de lectures mitochondriales (percent.mt) par cellule. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66749/66749fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66749/66749fig04.jpg"> Figure 4 : PUAM de cellules uniques analysées. (A) Un total de 9952 cellules uniques ont été isolées à partir de HIO jéjunaux différenciés cultivés dans des plaques à 96 puits. (B) Au total, 5623 cellules uniques ont été isolées à partir d’OHI jéjunaux différenciés cultivés sur des inserts de culture cellulaire membranaire. (C) Un total de 4402 cellules uniques ont été isolées à partir de HIO 3D iléaux différenciés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66749/66749fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Milieu de croissance WRNE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Milieu de différenciation</td>
		</tr><tr><td>Composant</td>
			<td>Volume</td>
			<td>Concentration finale</td>
			<td>Milieu WRNE sans milieu conditionné L-WRN, nicotinamide et SB202190</td>
		</tr><tr><td>*Y-27632 (5 mM) en option</td>
			<td>200 μL</td>
			<td>10 μM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>A 83-01 (500 μM)</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>500 nM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>DMEM/F12 avancé</td>
			<td>45 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>B27</td>
			<td>2 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>EGF (50 μg/mL)</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>50 ng/mL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Gastrine (10 μM)</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>10 nM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>GlutaMax (100X)</td>
			<td>1 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>HEPES 1 M</td>
			<td>1 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>L-WRN Con- Média</td>
			<td>50 ml</td>
			<td>~50 %</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>N2</td>
			<td>1 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>N-acétylcystéine (500 mM)</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>500 μM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Nicotinamide 1 M</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>10 millions d’euros</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>SB202190 (10 mM)</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>10 μM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Total Volume</td>
			<td>100 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>CMGF- Moyen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>DMEM/F12 avancé</td>
			<td>500 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Glutamax</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>100 fois</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>1 M Hepes</td>
			<td>5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Composition des différents supports utilisés.

Le protocole combine la technologie des organoïdes intestinaux humains avec l’analyse transcriptomique d’une seule cellule pour fournir des informations significatives sur la biologie intestinale jusqu’alors inexplorée.

Utilisation d’organoïdes intestinaux humains pour comprendre l’épithélium de l’intestin grêle au niveau transcriptionnel d’une seule cellule

Single cell transcriptomics has revolutionized our understanding of the cell biology of the human body. State-of-the-art human small intestinal organoid ...

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Biology

Biologie

Nous décrivons une méthode pour établir des entéroïdes humains à partir de cryptes intestinales grêles et des colonoïdes à partir de cryptes du côlon prélevés à partir de tissus chirurgicaux et de biopsies. Dans cet article méthodologique, nous présentons les modalités de culture qui sont essentielles à la croissance et au maintien réussis des entéroïdes et des colonoïdes humains.

Mise en place d&#39;épithéliales humaines Enteroids et Colonoids de tout le tissu et la biopsie

Dans ce protocole vidéo, nous expliquons étape par étape la transduction lentivirale dans les organoïdes de l’épithélium intestinal primaire et le traitement et l’analyse en aval de ces cultures par RT-PCR quantitative, ARN-microarray et immunohistochimie.

Un protocole pour Lentiviral transduction et analyse aval de intestinale organoïdes

Ce protocole décrit la mesure de la perméabilité de la barrière épithéliale dans en temps réel suite à un traitement pharmacologique en humain organoïdes intestinale à l’aide de la microscopie fluorescente et microscopie des cellules en direct.

Mesure en temps réel de la perméabilité de la barrière épithéliale dans organoïdes intestinale humaine

Ce protocole permet de différencier les cellules pluripotentes humaines en organoïdes intestinaux. Le protocole imite le développement humain normal en différenciant les cellules en une population d’endoderme définitif, d’endoderme de l’intestin postérieur, puis d’épithélium intestinal. Cela rend le protocole adapté à la fois à l’étude du développement intestinal et aux applications de modélisation des maladies.

Génération d’organoïdes intestinaux dérivés de hiPSC pour des applications de modélisation du développement et des maladies

Ici, nous décrivons la préparation de monocouches épithéliales intestinales dérivées d’organoïdes humains pour étudier la fonction de barrière intestinale, la perméabilité et le transport. Comme les organoïdes représentent la réponse originale du tissu épithélial aux stimuli externes, ces modèles combinent les avantages de l’extensibilité des lignées cellulaires et la pertinence et la complexité des tissus primaires.

Monocouche épithéliale dérivée d’organoïdes : un modèle in vitro cliniquement pertinent pour la fonction de barrière intestinale

Les organoïdes intestinaux dérivés de la biopsie et les technologies d’organes sur puce sont combinés dans une plate-forme microphysiologique pour récapituler la fonctionnalité intestinale spécifique à la région.

Combinaison d’organoïdes humains et de la technologie Organ-on-a-Chip pour modéliser des fonctionnalités spécifiques à la région intestinale

Nous présentons ici un protocole permettant de générer des organoïdes intestinaux de rat et de les utiliser dans plusieurs applications en aval. Les rats sont souvent un modèle préclinique privilégié, et le système organoïde intestinal robuste répond au besoin d’un système in vitro pour accompagner les études in vivo .

Génération et manipulation d’organoïdes intestinaux de rat

Cette étude décrit un protocole pour générer des monocouches 2D d’organoïdes porcins dérivés de l’intestin grêle et du gros intestin. La croissance de ces monocouches est marquée par l’augmentation des valeurs TEER, indiquant une intégrité épithéliale robuste. De plus, ces monocouches présentent des réponses sécrétoires physiologiques dans les expériences en chambre d’Ussing après l’application de forskoline.

Organoïdes intestinaux porcins bidimensionnels reflétant les propriétés physiologiques de l’intestin natif

Les organoïdes intestinaux humains doivent être innervés pour mieux récapituler la structure et la fonction de l’intestin humain natif. Ici, nous présentons une méthode pour incorporer un système nerveux entérique dans ces constructions.

Innervation des organoïdes intestinaux humains

Méthode pour la mesure de la cinétique de fusion virale au niveau particule unique

Découvrez l'analyse transcriptomique à cellule unique d'organoïdes intestinaux humains. Cette méthode révèle l'hétérogénéité cellulaire de l'épithélium intestinal et permet d'identifier des biomarqueurs pour les maladies intestinales.

Utilisation d’organoïdes intestinaux humains pour comprendre l’épithélium de l’intestin grêle au niveau transcriptionnel d’une seule cellule (Vidéo) | JoVE Journal

Utilisation d’organoïdes intestinaux humains pour comprendre l’épithélium de l’intestin grêle au niveau transcriptionnel d’une seule cellule

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