Name: Un test in vitro pour étudier la migration plaquettaire à l’aide de câbles avidine-biotine fonctionnalisés par RGD (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 43 s
Description: Découvrez un test in vitro pour étudier la migration plaquettaire à l'aide de câbles avidine-biotine fonctionnalisés par RGD. Cette méthode permet de visualiser la migration des plaquettes et de comprendre leur mécanosensibilité.

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<meta charset="utf8"></head><body>Imagerie de la migration plaquettaire unique à l’aide d’un système de revêtement à trois couches

<ol><li>Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+thrombosis--insidious%2C+unpredictable+and+deadly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Arterial thrombosis--insidious, unpredictable and deadly.</a> Nat Med. 17, 1423-1436 (2011).</li>
<li>Kaiser, R., Escaig, R., Nicolai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemostasis+without+clot+formation%3A+how+platelets+guard+the+vasculature+in+inflammation%2C+infection%2C+and+malignancy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hemostasis without clot formation: how platelets guard the vasculature in inflammation, infection, and malignancy.</a> Blood. 142 (17), 1413-1425 (2023).</li>
<li>Gaertner, F., Massberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patrolling+the+vascular+borders%3A+Platelets+in+immunity+to+infection+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Patrolling the vascular borders: Platelets in immunity to infection and cancer.</a> Nat Rev Immunol. 19 (12), 747-760 (2019).</li>
<li>Gaertner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migrating+platelets+are+mechano-scavengers+that+collect+and+bundle+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Migrating platelets are mechano-scavengers that collect and bundle bacteria.</a> Cell. 171 (6), 1368-1382.e23 (2017).</li>
<li>Gros, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+platelets+seal+neutrophil-induced+vascular+breaches+via+GPVI+during+immune-complex-mediated+inflammation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Single platelets seal neutrophil-induced vascular breaches via GPVI during immune-complex-mediated inflammation in mice.</a> Blood. 126 (8), 1017-1026 (2015).</li>
<li>Nicolai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+surveillance+by+haptotactic+blood+platelets+in+inflammation+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Comm%22%5BJournal%5D)">Vascular surveillance by haptotactic blood platelets in inflammation and infection.</a> Nature Comm. 11, 5778(2020).</li>
<li>Kaiser, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensing+via+a+GpIIb%2FSrc%2F14-3-3zeta+axis+critically+regulates+platelet+migration+in+vascular+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mechanosensing via a GpIIb/Src/14-3-3zeta axis critically regulates platelet migration in vascular inflammation.</a> Blood. 141 (24), 2973-2992 (2023).</li>
<li>Sarkar, A., LeVine, D. N., Kuzmina, N., Zhao, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+driven+by+self-generated+integrin+ligand+gradient+on+ligand-labile+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell migration driven by self-generated integrin ligand gradient on ligand-labile surfaces.</a> Curr Biol. 30 (20), 4022-4032 (2020).</li>
<li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins%3A+Bidirectional%2C+allosteric+signaling+machines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrins: Bidirectional, allosteric signaling machines.</a> Cell. 110 (6), 673-687 (2002).</li>
<li>Kechagia, J. Z., Ivaska, J., Roca-Cusachs, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+as+biomechanical+sensors+of+the+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrins as biomechanical sensors of the microenvironment.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 20, 457-473 (2019).</li>
<li>Shattil, S. J., Newman, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins%3A+Dynamic+scaffolds+for+adhesion+and+signaling+in+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Integrins: Dynamic scaffolds for adhesion and signaling in platelets.</a> Blood. 104 (6), 1606-1615 (2004).</li>
<li>Yuan, C., Chen, A., Kolb, P., Moy, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+landscape+of+streptavidin-biotin+complexes+measured+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Energy landscape of streptavidin-biotin complexes measured by atomic force microscopy.</a> Biochemistry. 39 (33), 10219-10223 (2000).</li>
<li>Florin, E. L., Moy, V. T., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+forces+between+individual+ligand-receptor+pairs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adhesion forces between individual ligand-receptor pairs.</a> Science. 264 (5157), 415-417 (1994).</li>
<li>Merkel, R., Nassoy, P., Leung, A., Ritchie, K., Evans, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+landscapes+of+receptor-ligand+bonds+explored+with+dynamic+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Energy landscapes of receptor-ligand bonds explored with dynamic force spectroscopy.</a> Nature. 397, 50-53 (1999).</li>
<li>Jurchenko, C., Chang, Y., Narui, Y., Zhang, Y., Salaita, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-generated+forces+lead+to+streptavidin-biotin+unbinding+in+cellular+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Integrin-generated forces lead to streptavidin-biotin unbinding in cellular adhesions.</a> Biophys J. 106 (7), 1436-1446 (2014).</li>
<li>Fan, S., Lorenz, M., Massberg, S., Gaertner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+migration+and+bacterial+trapping+assay+underflow%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Platelet migration and bacterial trapping assay underflow.</a> Bio-Protocol. 8 (18), e3018(2018).</li>
<li>Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%3A+A+physically+integrated+molecular+process%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell migration: A physically integrated molecular process.</a> Cell. 84 (3), 359-369 (1996).</li>
<li>Palecek, S. P., Loftus, J. C., Ginsberg, M. H., Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-ligand+binding+properties+govern+cell+migration+speed+through+cell-substratum+adhesiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrin-ligand binding properties govern cell migration speed through cell-substratum adhesiveness.</a> Nature. 385, 537(1997).</li>
<li>Zhao, Y., Wetter, N. M., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+integrin+tension+and+cellular+force+at+submicron+resolution+with+an+integrative+tension+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging integrin tension and cellular force at submicron resolution with an integrative tension sensor.</a> J Vis Exp. (146), e59476(2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Adénosine 5&prime ;-diphosphate sel sodique (ADP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 phalloïdine&nbsp ;</td><td>Thermofisher</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>Compteur de sang</td><td>Sysmex</td><td>XN-1000</td><td></td></tr><tr><td>Lame collante 6 canaux sans fond</td><td>IBIDI, lames collantes VI0.4</td><td>80608</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Eppendorf&nbsp ;</td><td>5804</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Zeiss</td><td>LSM880</td><td></td></tr><tr><td>cyclo [Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(Biotin-PEG-PEG)]</td><td>Peptide international</td><td>PCI-3697-PI</td><td></td></tr><tr><td>Tubes FACS</td><td>Corning Brand&nbsp ;</td><td></td><td></td>352052</tr><tr><td>FITC neutravidin conjugué</td><td>Thermofisher</td><td>A2662</td><td></td></tr><tr><td>Formaldéhyde&nbsp ;</td><td>Thermofisher</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>HEPES solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à contraste de phase et épifluorescent</td><td>Olympus</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>Nettoyeur plasma</td><td>Diener</td><td>116531</td><td></td></tr><tr><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-biotine(50 %)</td><td>Susos</td><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-biotine (50 %)</td><td></td></tr><tr><td>Poly(L-lysine)- copolymère greffé-poly(éthylène glycol)</td><td>Susos</td><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)</td><td></td></tr><tr><td>Sel de sodium de prostaglandine I2 (PGI2)</td><td>Abcam</td><td>ab120912</td><td></td></tr><tr><td>Sonicateur</td><td>BANDELIN</td><td>SONNOREX RK514M</td><td></td></tr><tr><td>Ttriton X-100 20 % v/v</td><td>Cayman Chemical&nbsp ;</td><td></td><td></td>600217</tr><tr><td>U46619</td><td>Enzo Sciences de la vie</td><td>BML-PG023-0001)</td><td></td></tr></tbody></table>

un test in vitro pour étudier la migration plaquettaire à l’aide de câbles avidine-biotine fonctionnalisés par rgd

An In Vitro Assay to Study Platelet Migration Using RGD-Functionalized Avidin-Biotin Tethers

Les plaquettes activées adhèrent et se propagent facilement sur des lames enrobées de PLL-PEG-biotine-neutravidine-FITC-biotine-cRGD (figure 1C et figure 2A ; 0 min et 5 min) et se polarisent ensuite en formant un lamellipodium sur le bord d’attaque (figure 2A ; 10 min). Au cours de ce processus, le pseudonoyau (zone sombre au centre des plaquettes) s’est déplacé du centre vers l’arrière des plaquettes (Figure 2A). Les plaquettes polarisées commencent alors à migrer sans directionnalité évidente (Figure 2A ; 15 min et 20 min et Figure 2B). Nous avons observé que les plaquettes migrant sur les revêtements PLL-PEG-biotine-neutravidine-FITC-biotine-cRGD peuvent rompre la liaison neutravidine-FITC-biotine-PLL-PEG, comme en témoigne la réduction de l’intensité de fluorescence le long de la voie de migration (Figure 1C et Figure 2A,B). De plus, le complexe perturbé neutravidine-FITC-biotine-cRGD s’accumule à la surface des plaquettes (Figure 2A,B). Ce phénomène est similaire aux résultats précédents où les plaquettes migratrices ont retiré le fibrinogène du substrat et l’ont accumulé dans leur système canaliculaire ouvert (OCS)4.
Pour étudier comment la densité des ligands influence la migration plaquettaire, la densité cRGD a été ajustée en faisant varier le rapport entre PLL-PEG-biotine et PLL-PEG dans la première couche de revêtement. Ces données révèlent que les plaquettes de souris atteignent une migration optimale à une concentration de 2,5 % de biotine PLL-PEG. La migration est réduite à des concentrations plus faibles (1 %) et plus élevées (10 %) de PLL-PEG-biotine (figures 3A, B). Ces changements de comportement migratoire dépendant du substrat s’accompagnent d’altérations de la morphologie plaquettaire (Figure 3C). À de faibles densités de ligands (1 %), les plaquettes ne se propagent pas adéquatement, comme en témoigne une faible projection de la surface et du périmètre plaquettaires (Figure 3C). Cela suggère une activation insuffisante de l’intégrine et une signalisation de l’extérieur vers l’intérieur7. Par conséquent, les plaquettes sont incapables d’exercer des forces sur les ligands cRGD, ne parviennent pas à remodeler le substrat et ne migrent pas (Figure 3A,B).
À une densité de ligands intermédiaire (2,5 %), il y a une augmentation significative de la surface et du périmètre des plaquettes (Figure 3C). Les plaquettes se propagent efficacement, perturbant mécaniquement les ligands labiles de la cRGD, et migrent (Figure 3A,B). Cependant, à des densités de ligands élevées (10 %), bien que l’étalement augmente, les plaquettes ne se polarisent pas, ce qui est indiqué par un rapport d’aspect réduit (Figure 3C). Dans ces conditions, les plaquettes restent attachées au substrat collant et ne migrent pas car elles ne peuvent pas rompre les ligands labiles cRGD (Figure 3A,B).
Ces résultats démontrent que la migration plaquettaire dépend de manière critique des propriétés adhésives du substrat. Les plaquettes ne peuvent migrer que lorsqu’elles s’engagent suffisamment avec les ligands adhésifs et génèrent simultanément des forces de traction suffisamment fortes pour surmonter la tolérance à la tension du substrat adhésif 4,6,7,8.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66757/66757fig01.jpg"> 
Figure 1 : Procédure d’enrobage et imagerie en direct de l’interaction plaquettes-substrat. (A) Photographie de la chambre assemblée. B) Principe du protocole. À gauche : Schéma du revêtement. Les lamelles de recouvrement en verre traité au plasma ont été recouvertes de trois couches. La première couche est le mélange de PLL-PEG et de PLL-PEG-biotine (le squelette PLL-PEG est inerte aux cellules et empêche la liaison non spécifique). La deuxième couche est constituée de neutravidine-FITC, et la troisième couche est de biotine-cRGD. Neutravidin-FITC fait le lien entre la PLL-PEG-biotine et la biotine-cRGD. Les plaquettes se lient à la biotine-cRGD via les intégrines dans la membrane plasmique. À droite : Illustration de la déliaison de la biotine-avidine par les intégrines plaquettaires. Les plaquettes exercent des forces sur le substrat par l’engagement de l’intégrine-cRGD et rompent soit la liaison supérieure cRGD-biotine - neutravidine-FITC - soit la liaison inférieure neutravidine-FITC - PLL-PEG-biotine. La rupture de la liaison inférieure entre la neutravidine-FITC et la biotine-PLL-PEG entraîne une réduction du signal fluorescent, tandis que la rupture de la liaison supérieure entre la biotine-cRGD et la neutravidine-FITC ne le fait pas. (C) Séries chronologiques montrant la migration plaquettaire et l’épuisement des ligands labiles cRGD. Les zones de fluorescence réduite indiquent les voies de migration des plaquettes (voir également la figure 2A), et les zones de fluorescence accrue indiquent l’accumulation de FTIC-neutravidine-biotine-cRGD sur les plaquettes en migration. Barre d’échelle : 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66757/66757fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66757/66757fig02.jpg"> 
Figure 2 : Imagerie par immunofluorescence de la migration plaquettaire codée par le substrat remodelé. (A) Séquence vidéo représentative de la migration plaquettaire unique. À gauche : Images en contraste de phase de plaquettes en migration. Les plaquettes se polarisent en formant un lamellipodium sur le bord d’attaque et migrent par la suite. À droite : La neutravidine-FITC a été retirée du substrat, laissant l’empreinte de la migration plaquettaire. La rupture cRGD-biotine-neutravidine-FITC s’accumule au centre des plaquettes en migration. (B) Images représentatives de la migration plaquettaire sur des revêtements ligands labiles cRGD-biotine-avidine. Supérieur : Les plaquettes colorées à la phalloïdine (Alexa FluorTM 594) présentaient une formation de lamellipodiums importants et une forme polarisée rappelant les plaquettes migratrices. Les plaquettes en migration rompent la liaison cRGD-biotine-neutravidine-FITC, générant des voies de migration sur le substrat indiquées par un signal FITC réduit. Bas : image recadrée avec un grossissement plus grand. (C) Les traces de migration ont été tracées manuellement aux Fidji avec des lignes jaunes. Barres d’échelle : 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66757/66757fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66757/66757fig03.jpg"> 
Figure 3 : Le rapport entre la PLL-PEG-biotine et la PLL-PEG détermine la migration et la forme des plaquettes. (A) Images représentatives des plaquettes sur des revêtements PLL-PEG-biotine à 1 %, 2,5 % et 10 %, barre d’échelle : 5 μm. (B) Quantification de l’adhésion plaquettaire, de l’efficacité de la migration et de la distance de migration, n = 4 expériences indépendantes ; Moyenne/ET ; ANOVA/Tukey à un facteur ; **p &lt; 0,01 ; p &lt; 0,001 ; p &lt; 0,0001, ns : non significatif (C) Quantification des descripteurs de forme plaquettaire (aire, périmètre, circularité et rapport d’aspect), n = 4 expériences indépendantes ; Moyenne/Min-Max ; ANOVA/Tukey à un facteur ; **p &lt; 0,01 ; p &lt; 0,001 ; p &lt; 0,0001, ns : non significatif. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66757/66757fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Un test in vitro pour étudier la migration plaquettaire à l’aide de câbles avidine-biotine fonctionnalisés par RGD

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