Un test in vitro pour étudier la migration plaquettaire à l’aide de câbles avidine-biotine fonctionnalisés par RGD

Les plaquettes sont cruciales pour prévenir la perte de sang après une lésion des vaisseaux, combattre les infections et maintenir l’intégrité vasculaire pendant l’inflammation. Alors que les bouchons hémostatiques nécessitent l’activation et l’agrégation collectives des plaquettes, leur rôle dans la protection des vaisseaux sanguins enflammés est joué au niveau de la cellule unique. Dans ce contexte, des études récentes ont montré que les plaquettes peuvent migrer de manière autonome, un processus dépendant de la mécanodétection de leur microenvironnement adhésif.

Cette approche permet un contrôle précis des propriétés adhésives du substrat et sert de test in vitro simple pour étudier les mécanismes sous-jacents à la migration plaquettaire. Les résultats indiquent que les plaquettes migrantes qui se lient aux ligands de l’intégrine peuvent exercer une force capable de perturber la liaison avidine-biotine. Ce test fournit une méthode simple et fiable pour visualiser la migration plaquettaire.

Combiné à l’imagerie de cellules vivantes, il nous aidera à mieux comprendre l’interaction et la régulation des différents composants du cytosquelette dans cette importante fonction plaquettaire. Pour commencer, le couvercle en verre sonicate glisse dans de l’acide nitrique à 20 % pendant une minute, suivi d’une sonication dans de l’isopropanol, de l’éthanol et de l’eau pendant une minute chacun. Traitez les lamelles pré-nettoyées avec du plasma d’oxygène dans un nettoyeur plasma pendant deux minutes, puis assemblez-les avec des lames collantes.

Remplissez maintenant le canal avec 2,5 microlitres de PLL-PEG-biotine diluée dans 97,5 microlitres de PLL-PEG et incubez pendant 30 minutes à température ambiante, puis lavez trois fois avec du PBS. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de neutravidin-FITC et incubez pendant 30 minutes dans l’obscurité à température ambiante, puis lavez trois fois avec du PBS. Enfin, ajoutez 100 microlitres de biotine cyclo-RGD, incubez pendant 30 minutes à température ambiante et lavez trois fois avec du PBS.

Après avoir anesthésié la souris et retiré la peau thoracique, insérez l’aiguille entre la deuxième et la troisième côte du côté gauche du sternum pour prélever du sang du cœur. Mélangez le sang avec un millilitre de tampon Tyrode et centrifugez à 70 g pendant 20 minutes à température ambiante avec le frein éteint, puis prélevez la partie supérieure contenant du plasma riche en plaquettes. Mélangez avec trois millilitres de tampon de Tyrode et ajoutez 100 nanogrammes par millilitre de prostacycline pour empêcher l’activation plaquettaire.

Ensuite, centrifugez à 1200 g pendant cinq minutes à température ambiante. Jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 500 microlitres de tampon Tyrode. Ensuite, à l’aide d’un hémocytomètre, mesurez le nombre de plaquettes.

Pour commencer, prélevez des plaquettes de souris dans les canaux d’enrobage cRGD de la biotine-neutravidine-biotine et enregistrez la migration des plaquettes en direct à l’aide d’un microscope inversé équipé d’un incubateur de stade. Pour compter les nombres d’adhésion ou de migration des plaquettes, cliquez avec le bouton droit de la souris sur le menu déroulant de l’outil de point dans la barre d’outils et sélectionnez l’outil multipoint. Extrayez la distance de migration à partir d’échantillons fixes en mesurant la longueur du chemin de migration imprimé dans le revêtement neutravidin-FITC.

Faites un clic droit sur le menu déroulant de l’outil Ligne droite dans la barre d’outils et sélectionnez l’outil Ligne à main libre. Pour quantifier la forme des plaquettes, sélectionnez Image, Ajuster et Seuil dans la barre d’outils pour générer des masques binaires en segmentant les plaquettes fluorescentes. Sélectionnez des descripteurs de forme dans Analyser et définir les mesures, puis sélectionnez Afficher les résultats à l’aide de l’option Analyser et Analyser les particules.

Les plaquettes ont montré une migration optimale à une concentration de 2,5 % de PLL-PEG-biotine. La migration a été réduite à des densités de ligands plus faibles et plus élevées. Les plaquettes ne se propagent pas suffisamment à une densité de ligand de 1 %, indiquée par une faible surface et un faible périmètre, suggérant une activation insuffisante de l’intégrine.

À une densité de ligands de 2,5 %, les plaquettes se propagent efficacement, perturbant les ligands cRGD et migrant. Une densité élevée de ligands a provoqué la propagation des plaquettes sans polarisation, réduisant la migration due à l’incapacité à casser les ligands cRGD.