Name: Quantification de la mort cellulaire induite par les cytokines dans les organoïdes du côlon humain à l’aide de la microscopie à fluorescence en direct (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-02T13:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Découvrez la quantification de la mort cellulaire induite par les cytokines dans les organoïdes du côlon humain à l'aide de la microscopie à fluorescence en direct. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes de mort cellulaire dans les conditions inflammatoires.

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Les auteurs tiennent à remercier les patients pour leur consentement éclairé et leur participation à l’étude de recherche, ainsi que le personnel clinique pour leur excellente aide. La figure 1A a été créée avec BioRender.com. Ce travail a été soutenu par des subventions de la Science Foundation Ireland, à savoir une bourse de développement de carrière (CDA) à K.N. (SFI-13/CDA/2171), une subvention de centre de recherche (SFI-12/RC/2273) et une bourse de centre de recherche (SFI-14/SP/2710) à APC Microbiome Ireland. P.F. a également reçu un financement de SFI/20/RP/9007.

Quantification de la mort cellulaire dans les colonoïdes humains en réponse à des perturbagènes cytotoxiques

<ol><li>Patankar, J. V., Becker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+in+the+gut+epithelium+and+implications+for+chronic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Cell death in the gut epithelium and implications for chronic inflammation.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 17 (9), 543-556 (2020).</li>
<li>Zeissig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+epithelial+apoptosis+and+barrier+repair+in+active+Crohn%27s+disease+by+tumour+necrosis+factor+alpha+antibody+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Downregulation of epithelial apoptosis and barrier repair in active Crohn's disease by tumour necrosis factor alpha antibody treatment.</a> Gut. 53 (9), 1295-1302 (2004).</li>
<li>Bartee, E., Mcfadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+synergy%3A+An+underappreciated+contributor+to+innate+anti-viral+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Cytokine synergy: An underappreciated contributor to innate anti-viral immunity.</a> Cytokine. 63 (3), 237-240 (2013).</li>
<li>Fish, S. M., Proujansky, R., Reenstra, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+effects+of+interferon+%CE%B3+and+tumour+necrosis+factor+%CE%B1+on+T84+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Synergistic effects of interferon γ and tumour necrosis factor α on T84 cell function.</a> Gut. 45 (2), 191-198 (1999).</li>
<li>Wakisaka, Y., Sugimoto, S., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+medicine+for+Inflammatory+Bowel+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Organoid medicine for Inflammatory Bowel Disease.</a> Stem Cells. 40 (2), 123-132 (2022).</li>
<li>Flood, P., Hanrahan, N., Nally, K., Melgar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+intestinal+organoids%3A+Modeling+gastrointestinal+physiology+and+immunopathology+-+current+applications+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human intestinal organoids: Modeling gastrointestinal physiology and immunopathology - current applications and limitations.</a> Eur J Immunol. 54 (2), e2250248(2024).</li>
<li>Matsuzawa-Ishimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intestinal+organoid-based+platform+that+recreates+susceptibility+to+t-cell-mediated+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">An intestinal organoid-based platform that recreates susceptibility to t-cell-mediated tissue injury.</a> Blood. 135 (26), 2388-2401 (2020).</li>
<li>Lee, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+responses+to+IL-17+in+adult+stem+cell-derived+human+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Crohns+Colitis%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial responses to IL-17 in adult stem cell-derived human intestinal organoids.</a> J Crohns Colitis. 16 (12), 1911-1923 (2022).</li>
<li>Woznicki, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-%CE%B1+synergises+with+IFN-%CE%B3+to+induce+caspase-8-JAK1%2F2-STAT1-dependent+death+of+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">TNF-α synergises with IFN-γ to induce caspase-8-JAK1/2-STAT1-dependent death of intestinal epithelial cells.</a> Cell Death Dis. 12 (10), 864(2021).</li>
<li>Flood, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sensor-associated+type+I+interferon+signaling+is+increased+in+ulcerative+colitis+and+induces+jak-dependent+inflammatory+cell+death+in+colonic+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">DNA sensor-associated type I interferon signaling is increased in ulcerative colitis and induces jak-dependent inflammatory cell death in colonic organoids.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 323 (5), G439-G460 (2022).</li>
<li>Grabinger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culture+of+intestinal+crypt+organoids+as+a+model+system+for+assessing+cell+death+induction+in+intestinal+epithelial+cells+and+enteropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culture of intestinal crypt organoids as a model system for assessing cell death induction in intestinal epithelial cells and enteropathy.</a> Cell Death Dis. 5 (5), e1228(2014).</li>
<li>Bode, K. J., Mueller, S., Schweinlin, M., Metzger, M., Brunner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast+and+simple+fluorometric+method+to+detect+cell+death+in+3D+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A fast and simple fluorometric method to detect cell death in 3D intestinal organoids.</a> Biotechniques. 67 (1), 23-28 (2019).</li>
<li>Mertens, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-repurposing+screen+on+patient-derived+organoids+identifies+therapy-induced+vulnerability+in+KRAS-mutant+colon+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Drug-repurposing screen on patient-derived organoids identifies therapy-induced vulnerability in KRAS-mutant colon cancer.</a> Cell Rep. 42 (4), 112324(2023).</li>
<li>Vandussen, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+enhanced+human+gastrointestinal+epithelial+culture+system+to+facilitate+patient-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays.</a> Gut. 64 (6), 911-920 (2015).</li>
<li>Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+and+genetic+modification+of+gastrointestinal+stem+cells+in+spheroid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture.</a> Nat Protoc. 8 (12), 2471-2482 (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Woznicki, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+BCL-G+regulates+secretion+of+inflammatory+chemokines+but+is+dispensable+for+induction+of+apoptosis+by+IFN-%CE%B3+and+TNF-%CE%B1+in+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Human BCL-G regulates secretion of inflammatory chemokines but is dispensable for induction of apoptosis by IFN-γ and TNF-α in intestinal epithelial cells.</a> Cell Death Dis. 11 (1), 68(2020).</li>
<li>Edgar, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture-associated+DNA+methylation+changes+impact+on+cellular+function+of+human+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Culture-associated DNA methylation changes impact on cellular function of human intestinal organoids.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 14 (6), 1295-1310 (2022).</li>
<li>Mubaid, F., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Less+is+more%3A+Longer+exposure+times+with+low+light+intensity+is+less+photo-toxic%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Today%22%5BJournal%5D)">Less is more: Longer exposure times with low light intensity is less photo-toxic.</a> Microscopy Today. 25 (6), 26-35 (2017).</li>
<li>Ziegler, U., Groscurth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+features+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22News+Physiol+Sci%22%5BJournal%5D)">Morphological features of cell death.</a> News Physiol Sci. 19 (3), 124-128 (2004).</li>
<li>Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+changes+during+programmed+cell+deaths%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane changes during programmed cell deaths.</a> Cell Res. 28 (1), 9-21 (2018).</li>
<li>Tamura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+anticancer+agents+using+patient-derived+tumor+organoids+characteristically+similar+to+source+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Rep%22%5BJournal%5D)">Evaluation of anticancer agents using patient-derived tumor organoids characteristically similar to source tissues.</a> Oncol Rep. 40 (2), 635-646 (2018).</li>
<li>Karki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergism+of+TNF-%CE%B1+IFN-%CE%B3+triggers+inflammatory+cell+death%2C+tissue+damage%2C+and+mortality+in+SARS-CoV-2+infection+and+cytokine+shock+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Synergism of TNF-α IFN-γ triggers inflammatory cell death, tissue damage, and mortality in SARS-CoV-2 infection and cytokine shock syndromes.</a> Cell. 184 (1), 149-168 (2021).</li>
<li>Geary, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+synergy%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Understanding synergy.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 304 (3), E237-E253 (2013).</li>
<li>Duarte, D., Vale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+synergism+in+drug+combinations+and+reference+models+for+future+orientations+in+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Res+Pharmacol+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Evaluation of synergism in drug combinations and reference models for future orientations in oncology.</a> Curr Res Pharmacol Drug Discov. 3, 100110(2022).</li>
<li>Wong, F. C., Woo, C. C., Hsu, A., Tan, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anti-cancer+activities+of+Vernonia+amygdalina+extract+in+human+breast+cancer+cell+lines+are+mediated+through+caspase-dependent+and+p53-independent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The anti-cancer activities of Vernonia amygdalina extract in human breast cancer cell lines are mediated through caspase-dependent and p53-independent pathways.</a> PLoS One. 8 (10), e78021(2013).</li>
<li>Ryall, K. A., Tan, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+biology+approaches+for+advancing+the+discovery+of+effective+drug+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cheminform%22%5BJournal%5D)">Systems biology approaches for advancing the discovery of effective drug combinations.</a> J Cheminform. 7, 7(2015).</li>
<li>Sukho, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cell+seeding+density+and+inflammatory+cytokines+on+adipose+tissue-derived+stem+cells%3A+An+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev+Rep%22%5BJournal%5D)">Effect of cell seeding density and inflammatory cytokines on adipose tissue-derived stem cells: An in vitro study.</a> Stem Cell Rev Rep. 13 (2), 267-277 (2017).</li>
<li>Vaughan-Jackson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Density+dependent+regulation+of+inflammatory+responses+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Density dependent regulation of inflammatory responses in macrophages.</a> Front Immunol. 13, 895488(2022).</li>
<li>Lumibao, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+extracellular+matrix+on+the+precision+medicine+utility+of+pancreatic+cancer+patient-derived+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">The impact of extracellular matrix on the precision medicine utility of pancreatic cancer patient-derived organoids.</a> bioRxiv. , 10.1101/2023.01.26.525757 (2023).</li>
<li>Lee, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-%CE%B1+induces+LGR5%2B+stem+cell+dysfunction+in+patients+with+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">TNF-α induces LGR5+ stem cell dysfunction in patients with Crohn's disease.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 13 (3), 789-808 (2022).</li>
</ol>

K.N. recevait des fonds de recherche d’AbbVie Inc. pendant la période où les travaux étaient terminés. Ce financement s’inscrivait dans le cadre d’une subvention de centre de recherche (SFI-14/SP/2710) accordée à APC Microbiome Ireland.

Plusieurs méthodes ont été développées pour les analyses quantitatives de la mort cellulaire dans les organoïdes intestinaux. L’examen de la perturbation de la morphologie des organoïdes intestinaux par la microscopie optique est une approche simple pour quantifier les effets des substances cytotoxiques11. Cependant, les changements morphologiques ne sont pas une mesure directe de la mort cellulaire, et la méthode n’est que semi-quantitative. Une autre méthode consiste à évaluer l’activité métabolique des organoïdes à l’aide d’un test MTT ou ATP10,11. Il est important de noter que ces tests ne peuvent déterminer que les changements dans la viabilité cellulaire et doivent être validés par un test de mort cellulaire. D’autres essais fluorométriques de mort cellulaire utilisant des colorants de liaison à l’ADN ont été signalés12,13. Une approche sans imagerie à l’aide d’un lecteur de microplaques fluorescent est possible et permet d’obtenir un débit élevé12. Cependant, cette méthode mesure le signal moyen d’un puits entier, ce qui la rend inadaptée à des populations hétérogènes. Il nécessite également l’utilisation d’un lecteur de microplaques avec réglage de la hauteur Z. Les techniques basées sur l’imagerie fluorescente peuvent être utilisées pour l’analyse d’organoïdes uniques et la capture de données cellulaires/subcellulaires et morphologiques. Les systèmes d’imagerie confocale à haut contenu (HCI) automatisés peuvent générer de grandes quantités de données à un débit élevé13. Malheureusement, l’IHM confocale nécessite un équipement spécialisé, utilise des protocoles complexes, nécessite généralement un logiciel d’analyse d’images commercial et est coûteuse.
Notre protocole d’analyse quantitative de la mort des cellules coloïdes à plusieurs moments est simple, simple et peu coûteux. Cependant, par rapport aux systèmes automatisés d’IHM et de lecteurs de plaques, cela prend du temps et a un débit réduit. Une autre limitation de notre méthode est l’utilisation de la microscopie à champ large par opposition à la microscopie confocale. La microscopie confocale est plus adaptée à l’imagerie d’échantillons 3D épais tels que les organoïdes, car elle réduit les signaux flous et peut acquérir des sections optiques en série (Z-stacks). Cependant, l’imagerie confocale nécessite généralement des temps d’acquisition plus longs et des lasers de haute intensité qui augmentent la phototoxicité/photoblanchiment. Il est essentiel de noter que les colorants fluorescents pour la mort cellulaire comme SYTOX Green ne conviennent que pour mesurer les formes de mort cellulaire où il y a perte d’intégrité de la membrane cellulaire telles que la nécrose, la nécrose secondaire associée à l’apoptose tardive, la nécroptose et la pyroptose21. Il existe certaines formes de mort cellulaire régulée où la membrane cellulaire reste imperméable au moins pendant les premières phases de la mort cellulaire, comme l’apoptose dépendante de la caspase. Cependant, ce protocole pourrait être facilement modifié pour intégrer également l’imagerie d’un rapporteur fluorescent d’activité 3/7 de caspase22. Cela fournirait des données supplémentaires pour aider à caractériser la modalité spécifique de mort cellulaire.
Nous avons utilisé notre protocole pour démontrer l’interaction synergique cytotoxique entre les cytokines IFN-γ et TNF-α (Figure 2C), que nous avons précédemment rapportée dans des organoïdes dérivés de patients atteints de la MC 9,10. La pertinence physiologique de cette forme de synergie a également été démontrée dans des modèles murins de lymphohistiocytose hémophagocytaire et de septicémie23. Plusieurs modèles et approches mathématiques de référence ont été mis en œuvre pour quantifier la synergie entre combinaisons d’agents biologiques24,25. Ils diffèrent en termes de complexité, de nombre de facteurs qu’ils prennent en compte et de seuil pour considérer qu’une interaction est synergique24,25. Certains modèles nécessitent une connaissance préalable des agents biologiques testés, font certaines hypothèses sur l’activité des agents et peuvent nécessiter des courbes dose-réponse complètes pour chaque traitement unique et combiné25. La méthode que nous avons choisie pour mesurer la synergie est une modification du modèle du coefficient d’interaction médicamenteuse (CDI), qui a déjà été utilisé pour mesurer les effets inhibiteurs des combinaisons de médicaments de chimiothérapie sur la prolifération des lignées cellulaires cancéreuses26. Le CDI est un modèle d’indépendance Bliss ; lors du calcul de l’effet combiné prédit de deux perturbagènes, l’indépendance de Bliss suppose qu’ils ciblent des voies distinctes et ont des mécanismes d’action indépendants27. Pour qu’une interaction entre perturbagènes soit synergique, l’effet combiné réel doit être supérieur à l’effet prédit. Ce modèle convient à notre dispositif expérimental, car l’IFN-γ et le TNF-α sont connus pour avoir des récepteurs et des composants de signalisation en aval différents. De plus, l’indépendance de Bliss permet de calculer un coefficient d’interaction pour quantifier la synergie et ne nécessite pas d’ensembles de données dose-réponse.
Il y a quelques facteurs clés qui doivent être pris en compte pour garantir des résultats optimaux pour ce protocole. Il est important que les colonoïdes se propagent à une densité élevée (figure 1Bi), qu’ils aient un diamètre d’environ 25 à 50 m et qu’ils prolifèrent activement avant de tenter d’ensemencer des cellules. L’utilisation de cultures sous-optimales de colonoïdes pour les essais peut entraîner un nombre insuffisant de cellules, une faible récupération des colonoïdes et des expériences incohérentes. Pour des résultats reproductibles, il est également important d’ensemencer la densité des colonoïdes de manière cohérente entre les expériences. Il a déjà été démontré que la réponse in vitro aux cytokines inflammatoires peut être influencée par la densité d’ensemencement cellulaire28,29. Un autre problème courant est la formation de bulles d’air dans le dôme BME, ce qui peut affecter l’imagerie. Cela peut être évité en utilisant la technique de pipetage inverse. Cette technique permet également un semis plus régulier.
De plus, si vous imagez plusieurs points temporels, préparez une condition de toxicité maximale pour chaque point temporel. Triton-X 100, un tensioactif non ionique, est couramment utilisé comme témoin positif (condition de toxicité maximale) pour les tests de cytotoxicité. L’ajout de Triton-X 100 lyse et tue les coloïdes, permettant au colorant fluorescent de la mort cellulaire de pénétrer dans les cellules. L’utilisation d’une condition de toxicité maximale à partir d’un point temporel antérieur entraînera une normalisation inexacte et incohérente des données en raison de la décroissance du signal fluorescent au fil du temps.
Un dernier point à considérer est le choix de l’EMB utilisé pour l’élevage de colonoïdes. Il existe plusieurs producteurs commerciaux de BME ; cependant, pour notre protocole, nous n’avons testé que la marque incluse dans la table des matériaux. Une étude récente utilisant des organoïdes de cancer du pancréas dérivés de patients a révélé que la source commerciale de l’EBM modifiait les taux de prolifération cellulaire, mais n’avait aucun effet significatif sur la réponse aux médicaments de chimiothérapie oul’expression des gènes. En gardant cela à l’esprit, nous nous attendons à ce que la tendance des résultats soit similaire entre les marques BME pour notre protocole, mais nous recommandons d’utiliser la même marque de manière cohérente.
Nous avons démontré comment ce protocole peut être utilisé pour l’analyse de la mort cellulaire induite par l’IFN-γ et le TNF-α à l’aide de coloïdes dérivés de patients atteints de la maladie de Crohn. Les organoïdes intestinaux dérivés de patients sont un outil puissant pour étudier la MC car ils conservent de nombreuses caractéristiques de la maladie, y compris une sensibilité accrue aux effets cytotoxiques du TNF-α31. Cependant, le protocole pourrait être facilement modifié pour étudier les effets cytotoxiques de perturbagènes autres que les cytokines ou des états pathologiques autres que les MICI, tels que le cancer colorectal (nous avons testé avec succès le protocole en utilisant des coloïdes non MICI). Nous pensons que cette méthode est utile pour tout domaine de recherche concerné par les mécanismes de mort cellulaire, la fonction de la barrière épithéliale ou l’immunologie de la muqueuse intestinale.

L’épithélium intestinal crée une barrière physique semi-perméable entre le contenu de la lumière intestinale et les tissus sous-jacents. Pour maintenir efficacement cette barrière, les cellules épithéliales intestinales (CEI) subissent un renouvellement cellulaire extrêmement élevé, avec un cycle continu de mort et de régénération cellulaires. Cependant, au cours de troubles inflammatoires, tels que les maladies inflammatoires de l’intestin (MICI), des niveaux plus élevés de mort cellulaire aberrante se produisent1. Cela peut favoriser une rupture de la fonction barrière et l’activation du système immunitaire, déclenchant une inflammation supplémentaire. Dans la maladie de Crohn (MC), une forme de MICI, il a été démontré que la signalisation des cytokines contribue à l’augmentation des niveaux de décès IEC2. En étudiant comment la signalisation des cytokines induit la mort cellulaire des CEI, on espère que de meilleurs traitements pourront être développés pour les patients atteints de MICI et d’autres troubles inflammatoires intestinaux1.
Dans la recherche en biologie et dans la découverte de cibles médicamenteuses, la synergie est généralement comprise comme se produisant lorsqu’un système biologique traité avec des combinaisons de stimuli individuels montre une réponse à la combinaison qui est supérieure aux effets additifs combinés des stimuli uniques seuls. Les interactions synergiques entre les cytokines ont été bien documentées dans l’entraînement des réponses antivirales innées3. Les cytokines sont également connues pour induire la mort cellulaire de manière synergique, y compris dans les CEI4. Cependant, le rôle que joue la signalisation synergique des cytokines cytotoxiques dans les troubles inflammatoires intestinaux tels que les MICI est sous-étudié.
Les organoïdes intestinaux humains sont des microtissus 3D produits in vitro qui sont générés à partir de cellules souches épithéliales intestinales. Les organoïdes intestinaux peuvent être cultivés à partir de biopsies de la muqueuse intestinale obtenues chez des patients atteints de MICI et conservent de nombreuses caractéristiques de la maladie 5,6. Les organoïdes se sont avérés être un système modèle idéal pour étudier la cytotoxicité des cytokines dans le contexte de l’inflammation intestinale 7,8. Auparavant, notre groupe a caractérisé les effets tueurs synergiques des cytokines IFN-γ et TNF-α pertinentes pour les MICI dans les organoïdes du côlon (coloïdes) dérivés de patients atteints de la MC9,10. Cependant, les mécanismes exacts impliqués dans la médiation de cette forme de mort cellulaire synergique restent insaisissables. Il existe également potentiellement de nombreuses autres interactions cytotoxiques non caractérisées qui sont pertinentes pour les troubles inflammatoires intestinaux.
Plusieurs protocoles sont disponibles pour étudier la mort cellulaire dans les organoïdes intestinaux 10,11,12,13 ; Cependant, ils ont chacun des inconvénients. Certaines de ces techniques ne mesurent que la viabilité cellulaire et ne mesurent pas directement la mort cellulaire, sont incapables d’évaluer les réponses d’un seul organoïde ou nécessitent un équipement coûteux et des protocoles complexes. Des méthodologies robustes et simples sont nécessaires pour quantifier la mort des cellules organoïdes et les interactions perturbagènes dans les organoïdes intestinaux. Le protocole que nous présentons est une approche simple et peu coûteuse pour mesurer les réponses d’un seul organoïde aux cytokines cytotoxiques, mais peut être utilisé pour tout type de stimulus ou de perturbation. Nous montrons également comment utiliser le modèle de synergie d’indépendance de Bliss pour calculer un coefficient d’interaction perturbagène (CPI) qui décrit les interactions cytocytotoxiques.

<table><tbody><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>Amphotéricine B Solution</td><td>Sigma-Merck</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>Sigma-Merck</td><td>SML0788</td><td></td></tr><tr><td>BioRender</td><td>Science Suite Inc.</td><td>N/A</td><td>Logiciel d’illustration scientifique</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma-Merck</td><td>A2058</td><td>Essentiellement sans IgG, faible teneur en endotoxine</td></tr><tr><td>B27 Supplément</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Sigma-Merck</td><td>SML1046</td><td></td></tr><tr><td>Costar Plaques à puits multiples transparentes traitées TC à 48 puits, emballées individuellement, stériles</td><td>Corning</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de membrane basale Cultrex, type 2, Pathclear</td><td>R& D Systems</td><td>3532-010-02</td><td>Extrait de membrane basale</td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde</td><td>Sigma-Merck</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime ; s Phosphate salin tamponné</td><td>Sigma-Merck</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL Microscope numérique à fluorescence inversée</td><td>Invitrogen</td><td>AMF4300</td><td>Microscope numérique à épifluorescence inversée</td></tr><tr><td>EVOS 40x Objectif, fluorite, LWD, contraste de phase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMEP4683</td><td>Objectif à fluorescence 40x à longue distance de travail</td></tr><tr><td>Fidji/ImageJ (version Windows)</td><td>Logiciel open source</td><td>N/A</td><td>Logiciel d’analyse d’images</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Sigma-Merck</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Solution de gentamicine</td><td>Sigma-Merck</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de dissociation cellulaire douce</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>100-0485</td><td>Réactif de dissociation cellulaire sans enzyme</td></tr><tr><td>GlutaMAX-1</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>Supplément de dipeptide de L-alanyl-L-glutamine</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5 (version Windows)</td><td>Dotmatics</td><td>N/A</td><td>Logiciel de graphiques et de statistiques</td></tr><tr><td>de données Greiner 15 mL Tube à centrifuger en polypropylène, stérile avec fond conique & Bouchon à vis</td><td>Cruinn</td><td>188261CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>EGF recombinant humain (sans animaux)</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>N-Acétylcystéine</td><td>Sigma-Merck</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma-Merck</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Normocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-nr-05</td><td>Large gamme réactif antimicrobien</td></tr><tr><td>Nunc Edge 96-Well, traité Nunclon Delta, microplaque à fond plat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15543115</td><td></td></tr><tr><td>supplément N2</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human IFN-gamma Protein</td><td>R& D Systems</td><td>285-IF</td> Resuspension dans une protéine TNF-alpha humaine <td>recombinante 0,1 % PBS/BSA filtrée</td></tr> stérile <tr><td></td><td> D Systems</td><td>210-TA</td><td>Resuspension dans un SB202190 filtrant stérile à 0,1 % PBS/BSA</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Merck</td><td>S7067</td><td></td></tr><tr><td>Snap Cap Tubes de microcentrifugation à faible rétention</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>3451</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Teinture d’acide nucléique vert - 5 mM Solution dans du DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>S7020</td><td>Colorant fluorescent de mort cellulaire, protéger de la lumière</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Merck</td><td>93420</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue solution</td><td>Sigma-Merck</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Tryple Express</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td>Réactif de dissociation enzymatique</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-10071</td><td>Inhibiteur de ROCK-I et ROCK-II</td></tr></tbody></table>

quantification de la mort cellulaire induite par les cytokines dans les organoïdes du côlon humain à l’aide de la microscopie à fluorescence en direct

Quantification of Cytokine-Induced Cell Death in Human Colonic Organoids Using Live Fluorescence Microscopy

La mort des cellules épithéliales intestinales (IEC) est accrue chez les patients atteints de maladies inflammatoires de l’intestin (MICI) telles que la colite ulcéreuse (CU) et la maladie de Crohn (MC). Cela peut contribuer à des défauts de la fonction de la barrière intestinale, à l’exacerbation de l’inflammation et à l’immunopathogenèse de la maladie. Les cytokines et les ligands des récepteurs de mort sont en partie responsables de cette augmentation de la mort par IEC. Les cytokines pertinentes pour les MICI, telles que le TNF-α et l’IFN-γ, sont cytotoxiques pour les CEI à la fois indépendamment et en combinaison. Ce protocole décrit un test simple et pratique pour quantifier la cytotoxicité induite par les cytokines dans les organoïdes du côlon dérivés de patients atteints de la maladie de Crohn à l’aide d’un colorant fluorescent de mort cellulaire (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), d’une microscopie à fluorescence en direct et d’un logiciel d’analyse d’images open source. Nous montrons également comment utiliser le modèle mathématique d’indépendance de Bliss pour calculer un coefficient d’interaction perturbagène (CPI) basé sur la cytotoxicité des organoïdes. L’IPC peut être utilisé pour déterminer si les interactions entre les combinaisons de cytokines ou d’autres types de perturbagènes sont antagonistes, additives ou synergiques. Ce protocole peut être mis en œuvre pour étudier l’activité cytotoxique des cytokines et d’autres perturbagènes à l’aide d’organoïdes du côlon dérivés de patients.

À l’aide de ce protocole, nous avons démontré comment les coloïdes de patients atteints de la MC peuvent être utilisés pour étudier les effets cytotoxiques des cytokines IFN-γ et TNF-α pertinentes pour les MICI sur l’épithélium primaire. Nous avons utilisé un colorant fluorescent de mort cellulaire disponible dans le commerce (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), qui ne peut pénétrer que dans les cellules dont la membrane cellulaire est compromise où il est ensuite activé en se liant aux acides nucléiques. Nous avons co-traité des coloïdes avec des cytokines et le colorant fluorescent de mort cellulaire et effectué une imagerie de cellules vivantes à 8 h et 24 h avec un microscope à épifluorescence inversée. Les images représentatives de transmission/superposition fluorescente à 8 h indiquent que seuls les colonoïdes traités à l’IFN-γ + au TNF-α sont positifs pour le signal fluorescent ; cependant, il n’y a qu’un petit nombre de cellules fluorescentes (figure 2A). Le reflux cellulaire, un indicateur morphologique de la mort cellulaire20, peut également être observé dans l’état IFN-γ + TNF-α. À 24 h, les colonoïdes traités avec IFN-γ + TNF-α présentent de grandes régions positives pour le signal fluorescent (figure 2A). Il y a aussi une rupture claire dans la morphologie du coloïde - la lumière centrale n’est plus visible et la barrière épithéliale a été complètement perturbée.
Pour quantifier le signal de mort cellulaire du colorant, nous avons utilisé un logiciel d’analyse d’images open source pour calculer l’intensité fluorescente de chaque coloïde. Nous avons ensuite normalisé les données en exprimant la moyenne de chaque condition en pourcentage du traitement de toxicité maximale. À 8 h, la mort cellulaire homéostatique ou de fond dans les coloïdes témoins de la BSA était relativement faible (7,7 % de la toxicité maximale) (figure 2B). Il n’y a pas eu de changements statistiquement significatifs dans les niveaux de mort cellulaire à ce moment-là ; cependant, les affections traitées par le TNF-α ont montré une légère augmentation de la cytotoxicité (figure 2B). Après 24 heures, les niveaux de mort cellulaire avaient augmenté pour toutes les affections traitées par des cytokines. Cependant, il y a eu un changement minime de la mort cellulaire pour la condition de contrôle BSA entre les points temporels (7,5 % de la toxicité maximale à 24 h). Les colonoïdes traités avec IFN-γ + TNF-α ont présenté la plus forte augmentation des niveaux de mort cellulaire par rapport au témoin BSA (29,4 % de la toxicité maximale). La différence de taux de mort cellulaire entre le traitement combiné et les traitements à cytokines uniques (IFN-γ, TNF-α) était très significative. Ces résultats suggèrent la possibilité d’une interaction synergique cytotoxique entre l’IFN-γ et le TNF-α à 24 h.
Nous avons utilisé l’IPC pour quantifier les interactions cytotoxiques entre les traitements à base de cytokines et pour déterminer si elles étaient synergiques. Les interactions entre cytokines sont considérées comme synergiques lorsque la valeur CPI est de &lt;1, additives lorsque =1 ou antagonistes lorsque &gt;1. Nous avons calculé les valeurs de l’IPC par point temporel (figure 2C). À 8 h, la valeur de l’IPC indiquait une légère synergie (0,99), tandis que la valeur de l’IPC diminuait considérablement à 24 h (0,83). Cette analyse a confirmé que l’interaction entre l’IFN-γ et le TNF-α à 24 h était synergique. De plus, il illustre comment, dans ce contexte, la synergie entre l’IFN-γ et le TNF-α dépend du temps.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66759/66759fig01v2.jpg"> Figure 1 : Schéma du flux de travail expérimental et du dépannage. (A) Vue d’ensemble schématique du protocole. (B) Images représentatives. (Bi) Image de microscopie optique illustrant la densité optimale de la culture et la taille optimale des coloïdes avant le passage pour un essai. Barre d’échelle = 500 μm. (Bii) Image de microscopie optique illustrant la taille optimale des fragments de coloïde après dissociation ; Fragments surlignés en rouge. Barre d’échelle = 100 μm. (Biii) Image en microscopie optique de la morphologie néoïde des coloïdes nécrotiques après traitement par MT (avec Triton X-100). Barre d’échelle = 25 μm. (Biv) Image de microscopie optique de deux colonoïdes se chevauchant dans le même plan focal. Barre d’échelle = 25 μm. (Bv) Image de microscopie optique des débris de cellules coloïdes présents après le passage ; Débris surlignés en rouge. Barre d’échelle = 25 μm. Abréviations : ROI = région d’intérêt ; MFI = intensité moyenne de fluorescence ; MT = Toxicité maximale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66759/66759fig01largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66759/66759fig02v2.jpg"> Figure 2 : Analyse quantitative de la mort cellulaire induite par les cytokines chez les colonoïdes humains atteints de la MC. (A) Images représentatives en direct de colonoïdes de la MC traités avec la coloration d’acide nucléique vert SYTOX (colorant fluorescent de la mort cellulaire) et des cytokines à 8 h et 24 h ; canaux de transmission et GFP (couleur verte) superposés. Les colonoïdes ont été traités comme suit : 1) PBS/BSA, 2) 10 ng/mL d’IFN-γ, 3) 10 ng/mL de TNF-α, 4) 10 ng/mL d’IFN-γ + 10 ng/mL de TNF-α. Barres d’échelle = 25 μm. (B) Analyse quantitative des colonoïdes CD traités avec le colorant fluorescent de mort cellulaire et des cytokines à 8 et 24 h ; les données sont exprimées en % de la condition MT. N = 2 lignées de coloïdes CD, 11 à 16 colonoïdes imagés par condition. (C) IPC calculé par point temporel à l’aide de l’ensemble de données de B, N = 2 lignes de colonoïdes CD. Les données sont exprimées en moyens ± SE. Dans l’hypothèse B, une analyse ANOVA bidirectionnelle a été effectuée, suivie de post-tests de Bonferroni, *P &lt; 0,05, ***P &lt; 0,001 comme indiqué. Abréviations : CD = maladie de Crohn ; GFP = protéine fluorescente verte ; CPI = coefficient d’interaction des perturbagènes ; PBS = solution saline tamponnée au phosphate ; BSA = albumine sérique bovine ; TNF-α = facteur de nécrose tumorale-alfa ; IFN-γ = interféron-gamma ; MT = Toxicité maximale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66759/66759fig02largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Tableau 1 : Composition des milieux de culture pour le protocole. Pour préparer un milieu de prolifération organoïde, combinez un milieu conditionné au L-WRN et un milieu sans sérum 1:1, puis ajoutez des suppléments. Le milieu de prolifération des organoïdes doit être utilisé dans les 2 semaines suivant la préparation. Veuillez noter que tous les supports complets doivent être stockés à 4 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66759/66759_Table%201%20(1).xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau 2 : Disposition expérimentale des plaques à 96 puits et traitements par cytokines. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66759/66759_Table%202%20(1).xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>

Ce protocole décrit une méthode simple et rentable pour étudier et quantifier la mort cellulaire dans les organoïdes du côlon humain en réponse à des perturbagènes cytotoxiques tels que les cytokines. L’approche utilise un colorant fluorescent de mort cellulaire (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), une microscopie à fluorescence en direct et un logiciel d’analyse d’images open source pour quantifier les réponses d’un seul organoïde aux stimuli cytotoxiques.

Quantification de la mort cellulaire induite par les cytokines dans les organoïdes du côlon humain à l’aide de la microscopie à fluorescence en direct

Intestinal epithelial cell (IEC) death is increased in patients with inflammatory bowel diseases (IBD) such as ulcerative colitis (UC) and Crohn's disease ...

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