Diagnostic post-mortem de la rage chez les animaux par le test actualisé et multiplexé LN34 Real-time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction

La rage est à cent pour cent fatale et un diagnostic rapide et précis est nécessaire pour obtenir un traitement vital à ceux qui en ont le plus besoin. Des tests de laboratoire fiables sont vraiment essentiels pour le contrôle de la rage. Le CDC a développé un protocole étape par étape pour le dépistage de la rage par PCR inverse quantitative ou RT-PCR, utilisant un test validé en temps réel du virus Alisa appelé LN34, permettant aux laboratoires d’améliorer la précision diagnostique et de soutenir les efforts de prévention de la rage.

Pendant des décennies, le dépistage de la rage reposait sur les tests directs d’anticorps de fluorescence appelés DFA ou FAT. Cependant, de nombreux laboratoires internationaux utilisent également la RT-PCR pour les tests de la rage en raison de son excellente sensibilité et de sa précision. Le test DFA pour la rage nécessite des microscopes spécialisés, un stockage en chaîne froide, une formation spécialisée du personnel et les réactifs ont connu des pénuries ces dernières années, la PCR et la RT-PCR sont désormais largement utilisées pour les tests d’agents pathogènes.

De nombreux laboratoires disposent déjà d’équipements et d’expertises PCR et RT-PCR, et les réactifs nécessaires sont disponibles auprès de fournisseurs commerciaux. Le coût constitue un obstacle majeur au dépistage de la rage dans les zones où l’humain compte le plus grand nombre de cas de rage. Le CDC a développé une forme multiplex du test LN34, qui améliore les contrôles qualité et réduit le coût par échantillon testé.

La RT-PCR est de plus en plus mise en œuvre pour le diagnostic de la rage car elle est largement utilisée pour tester d’autres agents pathogènes et les résultats sont faciles à interpréter. Mais utiliser un test validé est extrêmement important, et s’assurer que le test fonctionne comme prévu est tout aussi crucial. Notre protocole étape par étape inclut des contrôles de qualité, des considérations de sécurité et les meilleures pratiques PCR pour aider les laboratoires à démarrer.

Pour commencer, portez un équipement de protection individuelle, y compris des lunettes de sécurité, une blouse fermée à l’avant et deux paires de gants. Nettoyez et désinfectez la surface de travail avec un composé d’ammonium quaternaire ou un autre désinfectant adapté pour inactiver le virus de la rage. Étalez un coussinet absorbant doublé de plastique sur la surface de travail, en utilisant un tissu de collecte propre à usage unique représentant une section transversale complète du tronc cérébral et du cervelet.

Pour l’homogénéisation et l’extraction de l’ARN, enfin, hachez les tissus nécessaires à l’aide d’un scalpel à usage unique. Étalez le tissu haché avec un écouvillon et transférez le pré-écouvillon dans un tube prérempli de tampon d’homogénéisation et de billes. Après avoir jeté le gant extérieur à l’aide d’un désinfectant QAC dilué 1:256, nettoyez et désinfectez la station de travail, l’équipement et l’extérieur des tubes d’échantillon.

Homogénéisez les échantillons avec un mini batteur à billes pendant 60 secondes. Et inspectez visuellement les tubes. Laissez reposer les échantillons cinq minutes à température ambiante.

Enfin, nettoyez et désinfectez la station de travail, l’équipement et l’extérieur des tubes d’échantillon avec un désinfectant QAC avant de procéder à l’extraction ARN. Pour commencer, effectuez la décontamination de surface de l’armoire de sécurité biologique en utilisant un QAC dilué à 1:256. Effectuez un nettoyage supplémentaire pour éliminer la poussière ou d’autres contaminants environnementaux.

Posez un tapis absorbant doublé de plastique sur la plateforme de travail. Ensuite, rangez les réactifs et les échantillons dans l’armoire de biosécurité. Disposez tous les tubes de collecte dans un rack propre pour les tubes microcentrifuge.

Pré-remplir un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre avec 300 microlitres d’éthanol à 100 % pour chaque échantillon de cerveau. Centrifugez les échantillons homogénéisés de cerveau en feuille à 10 000 à 16 000 G pendant deux minutes dans une microcentrifugeuse de table. Transférez le surnageant rose clair dans un nouveau tube stérile contenant 100 % d’éthanol, pipetez de haut en bas pour mélanger et transférer 600 microlitres du mélange surnageant d’éthanol dans une colonne de rotation dans un tube de collecte.

Centrifugez pendant une minute jusqu’à ce que le liquide traverse la colonne, éliminez le flux et transférez chaque colonne dans un nouveau tube de collecte. Ajoutez 400 microlitres de tampon de pré-lavage ARN à chaque colonne. Centrifugez le mélange à 10 000 à 16 000 G pendant 30 secondes puis écartez le débit.

Retournez chaque colonne dans le même tube de collecte et répétez l’étape de pré-lavage une seconde fois. Ensuite, ajoutez 700 microlitres de tampon de lavage ARN à chaque colonne. Centrifugez à 10 000 à 16 000 G pendant deux minutes.

Et transférez-le soigneusement dans un tube sans RNase. Jetez le flux et le tube de collecte, puis retirez et jetez les gants extérieurs. Ajoutez maintenant 50 microlitres d’eau sans DNase et RNase directement dans la matrice de colonnes et faites couver pendant 30 secondes.

Ensuite, centrifugez à 10 000 à 16 000 G pendant une minute. Transférez soigneusement l’ARN dans un nouveau tube microcentrifuge à microcentrifuge à plaque à plaisir à accession à vis, pour le test RT-PCR. Pour commencer, décongelez un tampon RT-PCR en une étape, sans contrôle de gabarit, eau sans nucléase, amorces et sondes sur glace, dans l’espace de préparation du mélange maître.

Placez une étape de l’enzyme RT-PCR sur la glace. Calculez le volume de chaque réactif pour les mélanges multiplexés LN34 et A Master Mixes. Désignez les puits pour chaque échantillon en triple exemplaire pour le test multiplexé LN34 à l’aide d’une carte de plaques à 96 puits.

Après le vortex et la rotation, distribuez 23 microlitres de multiplex Master Mix LN34 dans chaque puits assigné LN34. Pour mettre en place des réactions de contrôle de gabarit négatif, ajoutez deux microlitres d’eau de qualité PCR dans chaque puits de contrôle de gabarit négatif. Placez la plaque de 96 puits sur la glace.

Nettoyez la station de travail avec 70 % d’éthanol. Maintenant, dans l’espace de travail de l’édition modèle, des échantillons d’ARN décongelé et une aliquote à usage unique à contrôle positif d’ARN artificiel sur glace. Après le vortex, centrifugez brièvement des tubes contenant des échantillons d’ARN, pipettez deux microlitres d’échantillon ou d’ARN témoin positif dans le puits correspondant.

Après avoir ajouté tous les échantillons, placez le couvercle adhésif optique sur les puits pour les sceller complètement. Centrifugez la plaque à 500 G pendant une minute à température ambiante, placez la plaque scellée dans un instrument PCR temps réel ou quantitatif calibré pour les matrices fam et VIC Hex Reporter. Réglez l’instrument selon les paramètres de cyclage appropriés.

Après la sortie, fixez les seuils à 0,2 pour LN34 et 0,05 pour la bêta-actine. Vérifiez les courbes d’échantillons de contrôle pour détecter des problèmes de qualité. Le test LN34 a montré des courbes d’amplification réussies avec des résultats positifs franchissant le seuil à des valeurs de seuil de cycle distinctes lorsqu’on les observe sur une échelle logarithmique.

Et des courbes d’amplification sigmoïdes à l’échelle linéaire pour LN34 et bêta-actine. Les résultats négatifs présentaient des lignes plates sans amplification. Des courbes d’amplification anormales ont été identifiées, certaines présentant des augmentations linéaires plutôt que sigmoïdales de la fluorescence, indiquant des résultats atypiques.

Les graphiques multicomposantes correspondants montraient des signaux fluorescents ondulés irréguliers plutôt que des courbes lisses attendues. Cela souligne la nécessité d’analyser les graphiques d’amplification au lieu de se fier uniquement aux seuils de cycles.