Name: Chanfreinage humide des aiguilles de micro-injection en utilisant une pression d’air constante pour un retour d’information sur l’ouverture de l’aiguille (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Découvrez le chanfreinage pneumatique d'aiguilles de micro-injection en verre borosilicate pour la recherche sur les insectes génétiquement modifiés. Cette méthode assure une ouverture précise et reproductible des aiguilles.

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<meta charset="utf8"></head><body>Protocole pour le biseautage humide des aiguilles de micro-injection sous pression d’air constante

<ol><li>Rubin, G. M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+Drosophila+with+transposable+Element+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of Drosophila with transposable Element Vectors.</a> Science. 218 (4570), 348-353 (1982).</li>
<li>O'Brochta, D. A., Atkinson, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+systems+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transformation systems in insects.</a> Methods Mol Biol. 260, 227-254 (2004).</li>
<li>Handler, A. M., James, A. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHandler%2C+AM+%22Insect+Transgenesis%3A+Methods+and+Applications%22">Insect Transgenesis: Methods and Applications</a>. , CRC Press. Boca Rato. (2000).</li>
<li>Harrell, R. A. Mosquito embryo microinjection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarrell%2C+RA+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22">Cold Spring Harbor Protocols</a>. , 10.1101/pdb.prot107686 (2023).</li>
<li>Allen, M. L., O'Brochta, D. A., Atkinson, P. W., Levesque, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable%2C+germ-line+transformation+of+Culex+Quinquefasciatus+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Stable, germ-line transformation of Culex Quinquefasciatus (Diptera: Culicidae).</a> J Med Entomol. 38 (5), 701-710 (2001).</li>
<li>Grossman, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transformation+of+the+malaria+vector%2C+Anopheles+gambiae%2C+with+the+piggyBac+transposable+element%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element.</a> Insect Mol Biol. 10 (6), 597-604 (2001).</li>
<li>Adelman, Z. N., Jasinskiene, N., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+applications+of+transgenesis+in+the+yellow+fever+mosquito%2C+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Development and applications of transgenesis in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti.</a> Mol Biochem Parasitol. 121 (1), 1-10 (2002).</li>
<li>Perera, O. P., Harrell, R. A., Handler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ-line+transformation+of+the+South+American+malaria+vector%2C+Anopheles+albimanus%2C+with+a+piggyBac%2FEGFP+transposon+vector+is+routine+and+highly+efficient%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Germ-line transformation of the South American malaria vector, Anopheles albimanus, with a piggyBac/EGFP transposon vector is routine and highly efficient.</a> Insect Mol Biol. 11 (4), 291-297 (2002).</li>
<li>Harrell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+embryo+microinjection+under+halocarbon+oil+or+in+aqueous+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Mosquito embryo microinjection under halocarbon oil or in aqueous solution.</a> Cold Spring Harb Protoc. , 10.1101/pdb.prot108203 (2023).</li>
<li>Louradour, I., Ghosh, K., Inbar, E., Sacks, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+mutagenesis+in+Phlebotomus+papatasi%3A+The+immune+deficiency+pathway+impacts+vector+competence+for+Leishmania+major%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 mutagenesis in Phlebotomus papatasi: The immune deficiency pathway impacts vector competence for Leishmania major.</a> mBio. 10 (4), e01941(2019).</li>
<li>Tamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transformation+of+the+silkworm+Bombyx+mori+L.+using+a+piggyBac+transposon-derived+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector.</a> Nat Biotechnol. 18 (1), 81-84 (2000).</li>
<li>BV-10 Micropipette Beveler Operation Manual Rev. 3.00. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.manualslib.com/manual/2073788/Sutter-Instrument-Bv-10.html">https://www.manualslib.com/manual/2073788/Sutter-Instrument-Bv-10.html</a> (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Microcapillaires de 1,0 mm de diamètre extérieur</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td>Huile</tr> de <tr><td>socle biseautée</td><td>Sutter Instruments</td><td>008</td><td></td></tr><tr><td>Clip d’aile de vélo</td><td>VeloOrange</td><td>R-clip 4-pack</td><td>https://velo-orange.com/products/vo-r-clip-4-pack</td></tr><tr><td>Boom Stand Microscope</td><td>AmScope</td><td></td><td>AMScope 3.5X-90X Trinocular LED Boom Stand Stereo Microscope ou équivalent</td></tr><tr><td>BV-10 Beveler</td><td>Sutter Instruments</td><td>BV-10</td><td></td></tr><tr><td>Plaque abrasive diamantée&nbsp ;</td><td>Sutter Instruments</td><td>104F</td><td>Plaque abrasive diamantée - extra fine (tailles de pointe 0,2 & ; micro ; à 1,0 & micro)</td></tr><tr><td>Joint, Buna-N</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>11761-2-pkg</td><td>Utilisé pour sceller la connexion sur les connecteurs en T ou en L, s’il n’est pas déjà inclus avec ces pièces</td></tr><tr><td>Collier</td><td>de serrage Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>5000-2-pkg</td><td></td></tr><tr><td>Connecteur de tuyau</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>CT4-pkg</td><td>Need 5 raccords de tuyau</td></tr><tr><td>Porte-aiguille de micro-injection</td><td>World Precision Instruments</td><td>MPH3-10 Porte-aiguille</td><td>pour microcapillaires de 1mm de diamètre extérieur</td></tr><tr><td>P-2000</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>Tout extracteur d’aiguille</td></tr><tr><td>Photo-Flo 200 Solution</td><td>B& H Photo, Vidéo et Audio</td><td>BH #KOPF200P&nbsp ; MFR #1464510</td><td>agent mouillant</td></tr><tr><td>Manomètre</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>PG-100</td><td>Mèche de référence 0-100 psi</td></tr><tr><td>Mèche de référence</td><td>Sutter Instruments</td><td>X050300</td><td></td></tr><tr><td>Porte-mèche de référence</td><td>Sutter Instruments</td><td>M100019</td><td></td></tr><tr><td>Régulateur</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>01-Mar</td><td>Besoin de ports #10-32 pour les connexions</td></tr><tr><td>Feuille d’emballage en caoutchouc 6 inx 6 in</td><td>Danco</td><td>Modèle # 59849</td><td></td></tr><tr><td>T raccord</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>15002-2-pqt</td><td></td></tr><tr>Barre <td></td><td></td><td>filetée</td><td>Soit une tige filetée, soit une barre avec extrémité filetée. Les fils doivent être de 10 à 32.</td></tr><tr><td>Tube en uréthane</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>Référence : URH1-0804-BLT-050</td><td></td></tr></tbody></table>

chanfreinage humide des aiguilles de micro-injection en utilisant une pression d’air constante pour un retour d’information sur l’ouverture de l’aiguille

Wet Beveling of Microinjection Needles Utilizing Constant Air Pressure for Feedback on Needle Opening

La procédure décrite ci-dessus produit des aiguilles de micro-injection toujours tranchantes. Les aiguilles pointues se caractérisent par leur capacité à s’insérer dans un chorion mou des embryons d’insectes, tels que des embryons de moustiques, avec peu ou pas de résistance de la membrane embryonnaire. Lorsque les embryons de moustiques sont micro-injectés pour la modification génétique, la membrane embryonnaire est relativement élastique. Si vous poussez une aiguille émoussée contre la membrane embryonnaire, vous la ferez s’indenter (figure 4B). Lorsque l’aiguille est tirée vers l’arrière, la membrane retrouve sa forme. Avec une pression suffisante, l’aiguille émoussée finira par déchirer la membrane et l’embryoplasme s’échappera probablement. Plus l’aiguille est pointue, moins il y a d’indentation car l’aiguille est pressée contre la membrane embryonnaire (Figure 4E). Au lieu de déchirer la membrane, une aiguille pointue glissera à travers la membrane, causant peu ou pas de dommages à l’embryon. Avec une aiguille idéale, il n’y aura presque pas d’indentation de la membrane embryonnaire lorsque l’aiguille se glissera dans l’embryon.
L’installation de transformation des insectes de l’Université du Maryland (UM-ITF) est une installation de service qui crée des insectes génétiquement modifiés pour des clients du milieu universitaire et de l’industrie. L’installation utilise des aiguilles biseautées pour la micro-injection d’embryons de moustiques. Au cours de la période allant de janvier 2023 à décembre 2023, l’UM-ITF a injecté 12 795 embryons d’Aedes dans 56 projets clients (tableau 1). L’utilisation d’aiguilles biseautées a permis à l’UM-ITF de maintenir une trappe post-injection moyenne de 31 % pour l’ensemble des projets (tableau 2). De plus, l’UM-ITF a été en mesure de maintenir un taux de réussite des injections de 96 %, tel que déterminé par le suivi post-projet auprès des clients (tableau 2). Le succès de l’injection est une mesure permettant de déterminer si les matériaux d’injection (guides CRISPR, protéine Cas9, plasmides de vecteurs transposons, etc.) injectés ont été administrés dans les embryons du projet de manière à ce que ces matériaux aient pu créer une modification génétique, en gros, y avait-il des preuves de la création de CRISPR Indel, de l’insertion du vecteur basé sur le transposon du client ou de l’insertion d’un vecteur de contrôle de la qualité de l’injection (le transposon se termine par un promoteur plus un marqueur). En d’autres termes, les injections étaient-elles assez bonnes pour produire une modification génétique, si les composants injectés fonctionnaient correctement. De nombreux facteurs contribuent au succès d’un projet de modification génétique, et des micro-injections de qualité avec des aiguilles pointues sont un facteur clé de succès. Le chanfreinage des aiguilles à l’aide de la procédure décrite dans le protocole ci-dessus permet à l’UM-ITF de produire des aiguilles de micro-injection pointues de qualité de manière constante, ce qui permet à l’UM-ITF de donner des injections toujours réussies.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66767/66767fig01.jpg"> Figure 1 : Schéma de principe des composants du système d’air et de la connexion au microcapillaire. L’air est acheminé vers l’aiguille capillaire à travers un système de tubes en uréthane à partir d’une alimentation en air (air domestique ou cylindre d’air). Les tubes en uréthane sont reliés au régulateur (R) et au manomètre par des raccords de tuyau (HC), qui se composent d’un raccord de tuyau et d’un collier de serrage. Le raccord du tuyau se visse dans un raccord femelle fileté 10-32 à la base du régulateur (R) et du manomètre. Un connecteur en T (T) est connecté au régulateur (R) pour déverser de l’air entre le manomètre et le porte-aiguille (NH). Le tube en uréthane est relié au porte-aiguille par un connecteur Luer (LC) qui est fourni avec le porte-aiguille (NH). Le raccordement à l’alimentation en air variera en fonction de l’alimentation en air utilisée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/66767fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66767/66767fig02.jpg"> Figure 2 : Pièces du manipulateur et configuration de l’air. Pièces du manipulateur : a. bouton de réglage grossier, b. bouton de réglage fin, c. pied à coulisse, d. porte-aiguille WPI, e. jauge d’angle, f. pince de retenue et clip d’aile de vélo, g. adaptateur Luer et connecteur de tuyau Luer, et h. tube en uréthane. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/66767fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66767/66767fig03.jpg"> Figure 3 : Placement de l’aiguille par rapport à la rotation de la plaque abrasive. (A) Placement correct de l’aiguille pendant le biseautage. L’aiguille à biseauter doit être placée sur la plaque abrasive rotative orientée quelque part entre perpendiculaire à la rotation et alignée avec la rotation, où la rotation s’éloigne de la pointe de l’aiguille. (B) Mauvais placement de l’aiguille. La rotation de la plaque abrasive dans cette orientation fait en sorte que la surface de la plaque abrasive pousse sur la pointe de l’aiguille plutôt que sous et au-delà de la pointe. Dans cette orientation, le biseautage peut ne pas se produire en douceur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/66767fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66767/66767fig04.jpg"> Figure 4 : Comparaison de l’insertion de l’aiguille par des aiguilles non tranchantes et des aiguilles pointues. (A-C) Aiguille non tranchante et (D-F) Aiguille pointue. (A) et (D) ont été capturés avant que l’aiguille n’entre en contact avec l’embryon ; (B) et (E) se trouvent juste avant que l’aiguille ne perce la membrane embryonnaire, et (C) et (F) sont juste après le perçage de l’aiguille. La flèche blanche en (B) indique l’indentation de la membrane embryonnaire car une pression plus grande doit être appliquée pour qu’une aiguille non tranchante puisse percer. La flèche noire en (E) indique l’absence d’indentation due au piercing à l’aiguille effectué facilement grâce à une aiguille pointue. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/66767fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Tableau 1 : Projets Aedes de l’UM-ITF de janvier 2023 à décembre 2023. Liste des projets de micro-injection UM-ITF Aedes avec le nombre d’embryons injectés pour chaque projet, le nombre de larves qui ont éclos de ces embryons injectés et le pourcentage total de larves qui ont éclos par embryon injecté. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/Table%201_RE.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau 2 : Résultats du projet Aedes de l’UM-ITF. L’UM-ITF est un établissement de services qui fournit des services de micro-injection pour la modification génétique des insectes. Le tableau répertorie le nombre de projets Aedes injectés par l’ITF de janvier 2023 à décembre 2023. Le nombre de clients qui ont répondu à des demandes de suivi de projet dans lesquelles la réponse indiquait le succès ou l’échec du projet d’injection. Le nombre de projets réussis, c’est-à-dire qu’il s’agit d’un projet dans lequel les matériaux d’injection ont été micro-injectés à un moment et à un endroit dans l’embryon en développement de sorte que les injections étaient capables de produire une modification génétique, et le nombre de projets qui ont été considérés comme non retenus en raison de l’absence de modification génétique. Le taux d’éclosion moyen des projets de micro-injection Aedes au cours de la période de janvier 2023 à décembre 2023. Le taux de réussite du projet et le taux de réponse du client. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/table%202_RE.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>

Chanfreinage humide des aiguilles de micro-injection en utilisant une pression d’air constante pour un retour d’information sur l’ouverture de l’aiguille

Microinjection needles are a critical tool in the delivery of genome modification reagents, CRISPR components (guide RNAs, Cas9 protein, and donor ...

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Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Source : Poland, R. et al. Micro-injection de cerveau de rongeur pour étudier les substrats moléculaires du comportement motivé. J. Vis. Exp. (2015)Dans cette vidéo, une installation de micro-injection remplie d’eau composée d’une seringue et d’un tube de micro-injecteur est utilisée pour une administration précise du médicament. Un rat avec une canule guide pré-implantée subit une micro-injection cérébrale ciblée, permettant une administration précise d’agents thérapeutiques chez les animaux...

Administration par micro-injection d’un agent thérapeutique dans le cerveau d’un rongeur éveillé

Source : Vanegas, M. I., et al. Système de micro-injecteur pour la perfusion combinée de médicaments et l’électrophysiologie. J. Vis. Exp. (2019)Cette vidéo fait la démonstration d’un dispositif microfluidique à base de microélectrodes qui délivre une solution médicamenteuse à travers un tube capillaire, à l’aide d’une solution de marqueur à base d’huile pour un suivi précis du volume et permettant un enregistrement neuronal et une perfusion de médicament simultanés.

Système de micro-injecteur à base microfluidique pour la perfusion de médicaments et l’électrophysiologie combinées

Source : Paolone, G., et al. Aiguilles personnalisées pour les micro-injections dans le cerveau des rongeurs. J. Vis. Exp. (2018).Cette vidéo montre l’injection d’une micro-aiguille de cerveau de rongeur à l’aide d’une micro-aiguille de quartz trouée. La micro-aiguille est attachée à une seringue et à une micropompe pour contrôler le débit de livraison. L’aiguille contenant la solution d’injection est insérée dans le cerveau avec la vitesse de livraison réglée à faible. Une fois positionné, la...

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