Name: Isolement des mitochondries pour l’analyse des supercomplexes mitochondriaux à partir de petits échantillons de tissus et de cultures cellulaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Découvrez l'isolement des mitochondries pour analyser les supercomplexes respiratoires à partir de petits échantillons de tissus et de cultures cellulaires. Cette méthode permet d'étudier la biogenèse mitochondriale et le système OXPHOS.

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Fractionnement mitochondrial dans de petits échantillons de tissus pour l’analyse supercomplexe

<ol><li>Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+active+mitochondrial+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Respiratory active mitochondrial supercomplexes.</a> Mol Cell. 32 (4), 529-539 (2008).</li>
<li>Schagger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplexes+in+the+respiratory+chains+of+yeast+and+mammalian+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria.</a> EMBO J. 19 (8), 1777-1783 (2000).</li>
<li>Schagger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ratio+of+oxidative+phosphorylation+complexes+I-V+in+bovine+heart+mitochondria+and+the+composition+of+respiratory+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The ratio of oxidative phosphorylation complexes I-V in bovine heart mitochondria and the composition of respiratory chain supercomplexes.</a> J Biol Chem. 276 (41), 37861-37867 (2001).</li>
<li>Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+the+respiratory+supercomplexes%3A+the+plasticity+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model.</a> Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).</li>
<li>Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+functional+role+of+the+electron+transport+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes.</a> Biochem Soc Trans. 49 (6), 2655-2668 (2021).</li>
<li>Genova, M. L., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+mitochondrial+respiratory+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes.</a> Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).</li>
<li>Kohler, A., Barrientos, A., Fontanesi, F., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+significance+of+mitochondrial+respiratory+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">The functional significance of mitochondrial respiratory chain supercomplexes.</a> EMBO Rep. 24 (11), e57092(2023).</li>
<li>Lapuente-Brun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplex+assembly+determines+electron+flux+in+the+mitochondrial+electron+transport+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain.</a> Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).</li>
<li>Milenkovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserved+respiratory+chain+capacity+and+physiology+in+mice+with+profoundly+reduced+levels+of+mitochondrial+respirasomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Preserved respiratory chain capacity and physiology in mice with profoundly reduced levels of mitochondrial respirasomes.</a> Cell Metab. 35 (10), e1797 1799-1813 (2023).</li>
<li>Vercellino, I., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assembly%2C+regulation+and+function+of+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 141-161 (2022).</li>
<li>Moreno-Loshuertos, R., Fernández-Silva, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoreno-Loshuertos%2C+R+%22Clinical+Bioenergetics%22">Clinical Bioenergetics</a>. Ostojic, S. , Academic Press. 3-60 (2021).</li>
<li>Fernandez-Vizarra, E., Ugalde, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+assembly+of+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Cooperative assembly of the mitochondrial respiratory chain.</a> Trends Biochem Sci. 47 (12), 999-1008 (2022).</li>
<li>Javadov, S., Jang, S., Chapa-Dubocq, X. R., Khuchua, Z., Camara, A. K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+supercomplexes+in+mammalian+cells%3A+structural+versus+functional+role%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory supercomplexes in mammalian cells: structural versus functional role.</a> Journal of Molecular Medicine. 99 (1), 57-73 (2021).</li>
<li>Lopez-Fabuel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+I+assembly+into+supercomplexes+determines+differential+mitochondrial+ROS+production+in+neurons+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Complex I assembly into supercomplexes determines differential mitochondrial ROS production in neurons and astrocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (46), 13063-13068 (2016).</li>
<li>Mukherjee, S., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+mitochondrial+respiratory+chain+assembly+and+its+relation+to+mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of mitochondrial respiratory chain assembly and its relation to mitochondrial diseases.</a> Mitochondrion. 53, 1-20 (2020).</li>
<li>Nesci, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+supramolecular+structure+of+the+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+system%3A+implications+for+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Life+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Molecular and supramolecular structure of the mitochondrial oxidative phosphorylation system: implications for pathology.</a> Life (Basel). 11 (3), 242(2021).</li>
<li>Frenzel, M., Rommelspacher, H., Sugawa, M. D., Dencher, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ageing+alters+the+supramolecular+architecture+of+OxPhos+complexes+in+rat+brain+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Ageing alters the supramolecular architecture of OxPhos complexes in rat brain cortex.</a> Exp Gerontol. 45 (7-8), 563-572 (2010).</li>
<li>Morant-Ferrando, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+oxidation+organizes+mitochondrial+supercomplexes+to+sustain+astrocytic+ROS+and+cognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Metab%22%5BJournal%5D)">Fatty acid oxidation organizes mitochondrial supercomplexes to sustain astrocytic ROS and cognition.</a> Nat Metab. 5 (8), 1290-1302 (2023).</li>
<li>McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+chain+supercomplexes+are+destabilized+in+Barth+Syndrome+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory chain supercomplexes are destabilized in Barth Syndrome patients.</a> J Mol Biol. 361 (3), 462-469 (2006).</li>
<li>Rosca, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+mitochondria+in+heart+failure%3A+decrease+in+respirasomes+and+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation.</a> Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).</li>
<li>Ramirez-Camacho, I., Garcia-Nino, W. R., Flores-Garcia, M., Pedraza-Chaverri, J., Zazueta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+mitochondrial+supercomplexes+assembly+in+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Basis+Dis%22%5BJournal%5D)">Alteration of mitochondrial supercomplexes assembly in metabolic diseases.</a> Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1866 (12), 165935(2020).</li>
<li>Gonzalez-Rodriguez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+mitochondrial+complex+I+induces+progressive+parkinsonism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Disruption of mitochondrial complex I induces progressive parkinsonism.</a> Nature. 599 (7886), 650-656 (2021).</li>
<li>Novack, G. V., Galeano, P., Castano, E. M., Morelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+supercomplexes%3A+physiological+organization+and+dysregulation+in+age-related+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial supercomplexes: physiological organization and dysregulation in age-related neurodegenerative disorders.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 11, 600(2020).</li>
<li>Ramirez-Camacho, I., Flores-Herrera, O., Zazueta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relevance+of+the+supramolecular+arrangements+of+the+respiratory+chain+complexes+in+human+diseases+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">The relevance of the supramolecular arrangements of the respiratory chain complexes in human diseases and aging.</a> Mitochondrion. 47, 266-272 (2019).</li>
<li>Hollinshead, K. E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+Supercomplexes+Promote+Mitochondrial+Efficiency+and+Growth+in+Severely+Hypoxic+Pancreatic+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Respiratory Supercomplexes Promote Mitochondrial Efficiency and Growth in Severely Hypoxic Pancreatic Cancer.</a> Cell Rep. 33 (1), 108231(2020).</li>
<li>Ikeda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+supercomplex+assembly+promotes+breast+and+endometrial+tumorigenesis+by+metabolic+alterations+and+enhanced+hypoxia+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial supercomplex assembly promotes breast and endometrial tumorigenesis by metabolic alterations and enhanced hypoxia tolerance.</a> Nat Commun. 10 (1), 4108(2019).</li>
<li>Kamada, S., Takeiwa, T., Ikeda, K., Horie, K., Inoue, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+COX7RP+and+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of COX7RP and mitochondrial oxidative phosphorylation in breast cancer.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 717881(2022).</li>
<li>Marco-Brualla, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+ND2+subunit+of+mitochondrial+complex+I+are+sufficient+to+confer+increased+tumorigenic+and+metastatic+potential+to+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Mutations in the ND2 subunit of mitochondrial complex I are sufficient to confer increased tumorigenic and metastatic potential to cancer cells.</a> Cancers (Basel). 11 (7), 1027(2019).</li>
<li>Moreno-Loshuertos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+hot+can+mitochondria+be%3F+Incubation+at+temperatures+above+43+degrees+C+induces+the+degradation+of+respiratory+complexes+and+supercomplexes+in+intact+cells+and+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">How hot can mitochondria be? Incubation at temperatures above 43 degrees C induces the degradation of respiratory complexes and supercomplexes in intact cells and isolated mitochondria.</a> Mitochondrion. 69, 83-94 (2023).</li>
<li>Vonck, J., Schafer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+organization+of+protein+complexes+in+the+mitochondrial+inner+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Supramolecular organization of protein complexes in the mitochondrial inner membrane.</a> Biochim Biophys Acta. 1793 (1), 117-124 (2009).</li>
<li>Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrangement+of+electron+transport+chain+components+in+bovine+mitochondrial+supercomplex+I1III2IV1%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1.</a> EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).</li>
<li>Cogliati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+super-assembly+of+respiratory+complexes+III+and+IV%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV.</a> Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).</li>
<li>Gonzalez-Franquesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometry-based+proteomics+reveals+mitochondrial+supercomplexome+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometry-based proteomics reveals mitochondrial supercomplexome plasticity.</a> Cell Rep. 35 (8), 109180(2021).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+applications+of+blue-native+and+clear-native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis.</a> Proteomics. 8 (19), 3974-3990 (2008).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li>
<li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> J Vis Exp. (49), e2452(2011).</li>
<li>Lai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondrial+subpopulations+from+skeletal+muscle%3A+Optimizing+recovery+and+preserving+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity.</a> Acta Physiol (Oxf). 225 (2), e13182(2019).</li>
<li>Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+electrophoresis+for+isolation+of+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Native electrophoresis for isolation of mitochondrial oxidative phosphorylation protein complexes.</a> Methods Enzymol. 260, 190-202 (1995).</li>
<li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li>
<li>Chomyn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-mediated+transformation+of+mtDNA-less+human+cells%3A+analysis+of+phenotypic+variability+among+clones+from+normal+individuals--and+complementation+behavior+of+the+tRNALys+mutation+causing+myoclonic+epilepsy+and+ragged+red+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Platelet-mediated transformation of mtDNA-less human cells: analysis of phenotypic variability among clones from normal individuals--and complementation behavior of the tRNALys mutation causing myoclonic epilepsy and ragged red fibers.</a> Am J Hum Genet. 54 (6), 966-974 (1994).</li>
<li>Moreno-Loshuertos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+reactive+oxygen+species+production+explain+the+phenotypes+associated+with+common+mouse+mitochondrial+DNA+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Differences in reactive oxygen species production explain the phenotypes associated with common mouse mitochondrial DNA variants.</a> Nat Genet. 38 (11), 1261-1268 (2006).</li>
<li>Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFern%C3%A1ndez-Vizarra%2C+E+%22Cell+Biology+%28Third+Edition%29%22">Cell Biology (Third Edition)</a>. , Academic Press. 69-77 (2006).</li>
<li>Cogliati, S., Herranz, F., Ruiz-Cabello, J., Enríquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digitonin+concentration+is+determinant+for+mitochondrial+supercomplexes+analysis+by+BlueNative+page%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Digitonin concentration is determinant for mitochondrial supercomplexes analysis by BlueNative page.</a> Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1862 (1), 148332(2021).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Les adaptations méthodologiques introduites dans les protocoles décrits ici visent à éviter les pertes et à augmenter le rendement tout en maintenant les activités du complexe mitochondrial (ce qui est crucial lorsque la disponibilité de quantités suffisantes d’échantillons est compromise) et à reproduire le modèle de SC attendu du tissu ou de la lignée cellulaire (voir Figure 2C). Dans ce but et comme une grande pureté mitochondriale n’est pas nécessaire pour détecter correctement les SC, l...

Les supercomplexes (SC) sont des associations supramoléculairesentre les complexes 1,2 de la chaîne respiratoire individuelle. Depuis l’identification initiale des SC et la description de leur composition par le groupe de Schägger 2,3, confirmée plus tard par d’autres groupes, il a été établi qu’ils contiennent des complexes respiratoires I, III et IV (CI, CII et CIV, respectivement) dans différentes stœchiométries. Deux populations principales de CS peuvent être définies, celles contenant des CI (et soit CIII seul, soit CIII et CIV) et de très haut poids moléculaire (MW, à partir de ~1,5 MDa pour les SC plus petits : CI + CIII2) et celles contenant CIII et CIV mais pas CI, de taille beaucoup plus petite (comme CIII2 + CIV avec ~680 kDa). Ces SC coexistent dans la membrane mitochondriale interne avec des complexes libres, également dans des proportions différentes. Ainsi, alors que l’IC se trouve principalement sous ses formes associées (c’est-à-dire dans les SC : ~80% dans le cœur bovin et plus de 90% dans de nombreux types de cellules humaines)3, le CIV est très abondant sous sa forme libre (plus de 80% dans le cœur bovin), l’ICII montrant une distribution plus équilibrée (~40% dans sa forme libre plus abondante, comme dimère, dans le cœur de bovin).
Bien que leur existence soit maintenant généralement acceptée, leur rôle précis est encore en débat 4,5,6,7,8,9,10. Selon le modèle de plasticité, différentes proportions de SC et de complexes individuels peuvent exister en fonction du type de cellule ou de l’état métabolique 1,7,11. Cette nature dynamique de l’assemblage permettrait aux cellules de réguler l’utilisation des combustibles disponibles et l’efficacité du système de phosphorylation oxydative (OXPHOS) en réponse aux changements environnementaux 4,5,7. Les CS pourraient également contribuer à contrôler le taux de génération d’espèces réactives de l’oxygène et participer à la stabilisation et au renouvellement des complexes individuels 4,12,13,14. Des modifications de l’état d’assemblage des CS ont été décrites en association avec différentes situations physiologiques et pathologiques15,16 et avec le processus de vieillissement17.
Ainsi, des changements dans les motifs SC ont été décrits chez la levure en fonction de la source de carbone utilisée pour la croissance2 et dans les cellules de mammifères en culture lorsque le glucose est substitué par le galactose4. Des modifications ont également été signalées dans le foie de souris après le jeûne8 et dans les astrocytes lorsque l’oxydation des acides gras mitochondriaux est bloquée18. De plus, une diminution ou des altérations des SC et de l’OXPHOS ont été observées dans le syndrome de Barth19, l’insuffisance cardiaque20, plusieurs troubles métaboliques21 et neurologiques 22,23,24, et différentes tumeurs 25,26,27,28. La question de savoir si ces altérations de l’assemblage et des niveaux de SC sont une cause primaire ou représentent des effets secondaires dans ces situations pathologiques est encore à l’étude15,16. Différentes méthodologies peuvent fournir des informations sur l’assemblage et la fonction des SC ; Il s’agit notamment des mesures d’activité 8,29, de l’analyse ultrastructurale30,31 et de la protéomique32,33. Une alternative utile qui est de plus en plus utilisée et qui constitue le point de départ de certaines des méthodologies mentionnées précédemment est la détermination directe de l’état d’assemblage des SC par électrophorèse native bleue (BN), développée à cet effet par le groupede Schägger 34,35.
Cette approche nécessite des procédures reproductibles et efficaces pour obtenir et solubiliser les membranes mitochondriales et peut être complétée par d’autres techniques telles que l’analyse de l’activité dans le gel (IGA), l’électrophorèse de seconde dimension et le western blot (WB). Une limite dans les études sur la dynamique des CS par électrophorèse BN peut être la quantité de cellules de départ ou d’échantillons de tissus. Nous présentons une série de protocoles pour l’analyse de l’assemblage et de la fonction des CS, adaptés des méthodes de groupe de Schägger, qui peuvent être appliqués à des échantillons de cellules ou de tissus frais ou congelés à partir de 20 mg de tissu.

<table><tbody><tr><td>Acide acétique</td><td>PanReac</td><td>131008</td><td></td></tr><tr><td>Acide aminocaproïque</td><td>Fluka Analytical</td><td>7260</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Bis Tris</td><td>Acrons Organics</td><td>327721000</td><td></td></tr><tr><td>Bradford assay</td><td>Biorad</td><td>5000002</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blue G-250</td><td>Serva</td><td>17524</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blue R-250</td><td>Merck</td><td>1125530025</td><td></td></tr><tr><td>Cytochrome c</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2506</td><td></td></tr><tr><td>Diamino&nbsp ; benzidine (DAB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5637</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5628</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>PanReac</td><td>131669</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Acides gras libres BSA</td><td>Roche</td><td>10775835001</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>PanReac</td><td>A1067</td><td></td></tr><tr><td>Homogénéisateur Pilon en téflon</td><td>Deltalab</td><td>196102</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>PanReac</td><td>121512</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>PanReac</td><td>121509</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Labkem</td><td>MTOL-P0P</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>PanReac</td><td>131404</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Cell</td><td>BioRad</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>MTCO1 Anticorps monoclonal</td><td>Invitrogen</td><td>459600</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Roche</td><td>10107735001</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE 3 à 12 % Mini Protein Gels</td><td>Invitrogen</td><td>BN1001BOX</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE Additif de tampon cathodique (20x)</td><td>Invitrogen</td><td>BN2002</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE Tampon de fonctionnement (20x)&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>BN2001</td><td></td></tr><tr><td>NDUFA9 Anticorps monoclonal</td><td>Invitrogen</td><td>459100</td><td></td></tr><tr><td>Nitroblue Sel de tétrazolium (NBT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6876</td><td></td></tr><tr><td>Pb(NO3)2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>228621</td><td></td></tr><tr><td>Membrane PDVF</td><td>Amersham</td><td>10600023</td><td></td></tr><tr><td>Méthasulfate de phénazine (PMS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9625</td><td></td></tr><tr><td>Pierce ECL Substrat</td><td>Thermo Scientific</td><td>32106</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Merck</td><td>PMSF-RO</td><td></td></tr><tr><td>SDHA Anticorps monoclonal</td><td>Invitrogen</td><td>459200</td><td></td></tr><tr><td>Succinate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2378</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycine/pénicilline</td><td>PAN biotech</td><td>P06-07100</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3089</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>PanReac</td><td>A2264</td><td></td></tr><tr><td>UQCRC1 Anticorps monoclonal</td><td>Invitrogen</td><td>459140</td><td></td></tr><tr><td>XCell&nbsp ; SureLock Mini-Cell</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp ; EI0001</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement des mitochondries pour l’analyse des supercomplexes mitochondriaux à partir de petits échantillons de tissus et de cultures cellulaires 

Isolation of Mitochondria for Mitochondrial Supercomplex Analysis from Small Tissue and Cell Culture Samples

Au cours des dernières décennies, les preuves accumulées de l’existence de supercomplexes respiratoires (SC) ont changé notre compréhension de l’organisation de la chaîne de transport d’électrons mitochondriaux, donnant lieu à la proposition du « modèle de plasticité ». Ce modèle postule la coexistence de différentes proportions de SC et de complexes en fonction du tissu ou de l’état métabolique cellulaire. La nature dynamique de l’assemblage dans les SC permettrait aux cellules d’optimiser l’utilisation des combustibles disponibles et l’efficacité du transfert d’électrons, minimisant la génération d’espèces réactives de l’oxygène et favorisant la capacité des cellules à s’adapter aux changements environnementaux. 
Plus récemment, des anomalies dans l’assemblage des cellules souches embryonnaires ont été rapportées dans différentes maladies telles que les troubles neurodégénératifs (maladie d’Alzheimer et de Parkinson), le syndrome de Barth, le syndrome de Leigh ou le cancer. Le rôle des altérations de l’assemblage des SC dans la progression de la maladie doit encore être confirmé. Néanmoins, la disponibilité d’un nombre suffisant d’échantillons pour déterminer l’état de l’assemblage du SC est souvent un défi. C’est le cas lors de biopsies ou d’échantillons de tissus qui sont petits ou qui doivent être divisés pour plusieurs analyses, avec des cultures cellulaires à croissance lente ou provenant de dispositifs microfluidiques, avec des cultures primaires ou des cellules rares, ou lorsque l’effet de traitements particuliers coûteux doit être analysé (avec des nanoparticules, des composés très coûteux, etc.). Dans ces cas, une méthode efficace et facile à appliquer est nécessaire. Cet article présente une méthode adaptée pour obtenir des fractions mitochondriales enrichies à partir de petites quantités de cellules ou de tissus afin d’analyser la structure et la fonction des CS mitochondriaux par électrophorèse native suivie de dosages d’activité en gel ou de western blot.

Les rendements en mitochondries obtenus selon les protocoles décrits ci-dessus varient en fonction de plusieurs facteurs tels que la lignée cellulaire ou le type de tissu, la nature des échantillons (c’est-à-dire si des tissus frais ou congelés sont utilisés) ou l’efficacité du processus d’homogénéisation. Les rendements attendus de mitochondries provenant de différentes lignées cellulaires et tissus sont rassemblés dans le tableau 2. Une fois que les fractions mitochondriales ont été obtenues, l’étape s...

Ce protocole décrit une technique d’analyse des supercomplexes respiratoires lorsque seules de petites quantités d’échantillons sont disponibles.

Isolement des mitochondries pour l’analyse des supercomplexes mitochondriaux à partir de petits échantillons de tissus et de cultures cellulaires 

Over the last decades, the evidence accumulated about the existence of respiratory supercomplexes (SCs) has changed our understanding of the mitochondrial ...

Nos recherches visent à mieux comprendre la biogenèse mitochondriale, en particulier l’organisation et la régulation du système OXPHOS, ainsi qu’à définir le rôle que jouent les mitochondries dans les maladies allant du cancer aux maladies neurodégénératives. Les mitochondries jouent des rôles multiples et essentiels dans la cellule, conditionnant l’ensemble de son métabolisme et sa survie. Nous améliorons lentement nos connaissances sur la complexité mitochondriale et sa contribution aux mécanismes d’adaptation cellulaire dans la santé et la maladie.Nous avons contribué à établir un nouveau modèle d’organisation pour le système OXPHOS, le modèle de plasticité qui intègre les propositions précédentes et suppose la coexistence de super-complexes et de complexes libres dans des proportions différentes pour optimiser sa fonction et permettre des adaptations cellulaires. Notre protocole permet de partir de petits tissus ou d’échantillons de culture cellulaire pour obtenir des quantités suffisantes de protéines mitochondriales pour analyser l’assemblage, l’état et la fonction des supercomplexes par électrophorèse native bleue ou d’autres techniques. Nous pouvons le faire de manière repr

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Cette vidéo décrit la procédure d’isolement des mitochondries des tissus cancéreux de l’ovaire humain à l’aide de la centrifugation à vitesse différentielle associée à la centrifugation à gradient de densité. Les mitochondries isolées peuvent être utilisées pour l’analyse protéomique du protéome mitochondrial du cancer de l’ovaire humain.

Isolement mitochondrial : une technique pour isoler les mitochondries d’un échantillon de tissu cancéreux de l’ovaire humain

Procédé pour l'isolement rapide de mitochondries à partir de biopsies de tissu de mammifère est décrite. foie de rat ou des préparations musculaires squelettiques ont été homogénéisés avec un dissociateur tissu commercial et les mitochondries ont été isolées par filtration différentielle à travers des filtres en filet de nylon. Temps d'isolement des mitochondries est &lt;30 min par rapport à 60 - 100 min en utilisant des méthodes alternatives.

Isolement rapide et la purification des mitochondries pour la transplantation par la dissociation des tissus et différencié Filtration

La comparaison du potentiel de membrane mitochondriale entre les échantillons fournit des informations précieuses sur l’état cellulaire. Les étapes détaillées de l’isolement des mitochondries et de l’évaluation de la réponse aux inhibiteurs et aux découpleurs à l’aide de la fluorescence sont décrites. La méthode et l’utilité de ce protocole sont illustrées par l’utilisation d’une culture cellulaire et d’un modèle animal de stress cellulaire.

Isolement et analyse fonctionnelle des mitochondries de cellules cultivées et de tissus de souris

Ici, nous présentons une modification d’une méthode précédemment rapportée qui permet d’isoler des mitochondries purifiées de haute qualité à partir de plus petites quantités de muscle squelettique de souris. Cette procédure aboutit à des mitochondries fortement couplées qui respirent avec une fonction élevée lors des tests respiratoires sur microplaques.

Isolement des mitochondries à partir des quantités minimes de souris muscle squelettique pour les mesures à haut débit microplaques respiratoires

Ce protocole décrit la séparation des complexes fonctionnels de la chaîne de transport d'électrons mitochondriaux (Cx) IV et des supercomplexes de ceux-ci en utilisant une électrophorèse native pour révéler des informations sur leur assemblage et leur structure. Le gel natif peut être soumis à un immunoblot, des essais en gel et une purification par électroélution pour caractériser davantage les complexes individuels.

Analyse des supercomplexes de la chaîne de transport d&#39;électrons mitochondriaux avec électrophorèse native, essais en gel et électroélution

Comme les mitochondries sont seulement un petit pourcentage de la cellule végétale, ils doivent être purifiés pour une série d’études. Les mitochondries peuvent être isolés dans divers organes de la plante par homogénéisation, suivie par centrifugation en gradient de différentiel et densité afin d’obtenir une fraction mitochondriale hautement purifiée.

Isolement et mesures respiratoire des mitochondries d’Arabidopsis thaliana

Mitochondries ont spécialisé des ribosomes qui ont divergé de leurs équivalents bactériens et cytoplasmiques. Ici, nous montrons comment mitoribosomes peuvent provenir de leur compartiment natif dans les cellules HEK. La méthode implique l’isolation des mitochondries des cellules en suspension et purification conséquente de mitoribosomes.

Isolation rapide de la Mitoribosome de cellules HEK

Ici, nous présentons une compilation de tests pour mesurer directement la fonction mitochondriale dans les cellules de mammifères indépendamment de leur capacité à consommer de l’oxygène moléculaire.

Tests indépendants de l’oxygène pour mesurer la fonction mitochondriale chez les mammifères

Nous présentons un protocole en deux étapes pour l’isolement de mitochondries de haute qualité qui est compatible avec la découverte et la quantification des protéines à l’échelle du protéome. Notre protocole ne nécessite pas de génie génétique et convient donc à l’étude des mitochondries de toutes les cellules et tissus primaires.

Isolement sans marquage en deux étapes des mitochondries pour améliorer la découverte et la quantification des protéines

Des études bioénergétiques et métabolomiques sur les mitochondries ont révélé leur rôle multiforme dans de nombreuses maladies, mais les méthodes d’isolement de ces organites varient. La méthode détaillée ici est capable de purifier des mitochondries de haute qualité à partir de plusieurs sources tissulaires. La qualité est déterminée par les rapports de contrôle respiratoire et d’autres paramètres évalués à l’aide de la respirométrie à haute résolution.

Isolement mitochondrial robuste à partir de tissu cardiaque de rongeur 

Découvrez l'isolement des mitochondries pour analyser les supercomplexes respiratoires à partir de petits échantillons de tissus et de cultures cellulaires. Cette méthode permet d'étudier la biogenèse mitochondriale et le système OXPHOS.

Isolement des mitochondries pour l’analyse des supercomplexes mitochondriaux à partir de petits échantillons de tissus et de cultures cellulaires (Vidéo) | JoVE Journal

Isolement des mitochondries pour l’analyse des supercomplexes mitochondriaux à partir de petits échantillons de tissus et de cultures cellulaires

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