Name: Isolement des mitochondries pour l’analyse des supercomplexes mitochondriaux à partir de petits échantillons de tissus et de cultures cellulaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Découvrez l'isolement des mitochondries pour analyser les supercomplexes respiratoires à partir de petits échantillons de tissus et de cultures cellulaires. Cette méthode permet d'étudier la biogenèse mitochondriale et le système OXPHOS.

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Fractionnement mitochondrial dans de petits échantillons de tissus pour l’analyse supercomplexe

<ol><li>Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+active+mitochondrial+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Respiratory active mitochondrial supercomplexes.</a> Mol Cell. 32 (4), 529-539 (2008).</li>
<li>Schagger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplexes+in+the+respiratory+chains+of+yeast+and+mammalian+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria.</a> EMBO J. 19 (8), 1777-1783 (2000).</li>
<li>Schagger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ratio+of+oxidative+phosphorylation+complexes+I-V+in+bovine+heart+mitochondria+and+the+composition+of+respiratory+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The ratio of oxidative phosphorylation complexes I-V in bovine heart mitochondria and the composition of respiratory chain supercomplexes.</a> J Biol Chem. 276 (41), 37861-37867 (2001).</li>
<li>Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+the+respiratory+supercomplexes%3A+the+plasticity+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model.</a> Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).</li>
<li>Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+functional+role+of+the+electron+transport+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes.</a> Biochem Soc Trans. 49 (6), 2655-2668 (2021).</li>
<li>Genova, M. L., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+mitochondrial+respiratory+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes.</a> Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).</li>
<li>Kohler, A., Barrientos, A., Fontanesi, F., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+significance+of+mitochondrial+respiratory+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">The functional significance of mitochondrial respiratory chain supercomplexes.</a> EMBO Rep. 24 (11), e57092(2023).</li>
<li>Lapuente-Brun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplex+assembly+determines+electron+flux+in+the+mitochondrial+electron+transport+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain.</a> Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).</li>
<li>Milenkovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserved+respiratory+chain+capacity+and+physiology+in+mice+with+profoundly+reduced+levels+of+mitochondrial+respirasomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Preserved respiratory chain capacity and physiology in mice with profoundly reduced levels of mitochondrial respirasomes.</a> Cell Metab. 35 (10), e1797 1799-1813 (2023).</li>
<li>Vercellino, I., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assembly%2C+regulation+and+function+of+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 141-161 (2022).</li>
<li>Moreno-Loshuertos, R., Fernández-Silva, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoreno-Loshuertos%2C+R+%22Clinical+Bioenergetics%22">Clinical Bioenergetics</a>. Ostojic, S. , Academic Press. 3-60 (2021).</li>
<li>Fernandez-Vizarra, E., Ugalde, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+assembly+of+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Cooperative assembly of the mitochondrial respiratory chain.</a> Trends Biochem Sci. 47 (12), 999-1008 (2022).</li>
<li>Javadov, S., Jang, S., Chapa-Dubocq, X. R., Khuchua, Z., Camara, A. K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+supercomplexes+in+mammalian+cells%3A+structural+versus+functional+role%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory supercomplexes in mammalian cells: structural versus functional role.</a> Journal of Molecular Medicine. 99 (1), 57-73 (2021).</li>
<li>Lopez-Fabuel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+I+assembly+into+supercomplexes+determines+differential+mitochondrial+ROS+production+in+neurons+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Complex I assembly into supercomplexes determines differential mitochondrial ROS production in neurons and astrocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (46), 13063-13068 (2016).</li>
<li>Mukherjee, S., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+mitochondrial+respiratory+chain+assembly+and+its+relation+to+mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of mitochondrial respiratory chain assembly and its relation to mitochondrial diseases.</a> Mitochondrion. 53, 1-20 (2020).</li>
<li>Nesci, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+supramolecular+structure+of+the+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+system%3A+implications+for+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Life+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Molecular and supramolecular structure of the mitochondrial oxidative phosphorylation system: implications for pathology.</a> Life (Basel). 11 (3), 242(2021).</li>
<li>Frenzel, M., Rommelspacher, H., Sugawa, M. D., Dencher, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ageing+alters+the+supramolecular+architecture+of+OxPhos+complexes+in+rat+brain+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Ageing alters the supramolecular architecture of OxPhos complexes in rat brain cortex.</a> Exp Gerontol. 45 (7-8), 563-572 (2010).</li>
<li>Morant-Ferrando, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+oxidation+organizes+mitochondrial+supercomplexes+to+sustain+astrocytic+ROS+and+cognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Metab%22%5BJournal%5D)">Fatty acid oxidation organizes mitochondrial supercomplexes to sustain astrocytic ROS and cognition.</a> Nat Metab. 5 (8), 1290-1302 (2023).</li>
<li>McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+chain+supercomplexes+are+destabilized+in+Barth+Syndrome+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory chain supercomplexes are destabilized in Barth Syndrome patients.</a> J Mol Biol. 361 (3), 462-469 (2006).</li>
<li>Rosca, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+mitochondria+in+heart+failure%3A+decrease+in+respirasomes+and+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation.</a> Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).</li>
<li>Ramirez-Camacho, I., Garcia-Nino, W. R., Flores-Garcia, M., Pedraza-Chaverri, J., Zazueta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+mitochondrial+supercomplexes+assembly+in+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Basis+Dis%22%5BJournal%5D)">Alteration of mitochondrial supercomplexes assembly in metabolic diseases.</a> Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1866 (12), 165935(2020).</li>
<li>Gonzalez-Rodriguez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+mitochondrial+complex+I+induces+progressive+parkinsonism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Disruption of mitochondrial complex I induces progressive parkinsonism.</a> Nature. 599 (7886), 650-656 (2021).</li>
<li>Novack, G. V., Galeano, P., Castano, E. M., Morelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+supercomplexes%3A+physiological+organization+and+dysregulation+in+age-related+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial supercomplexes: physiological organization and dysregulation in age-related neurodegenerative disorders.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 11, 600(2020).</li>
<li>Ramirez-Camacho, I., Flores-Herrera, O., Zazueta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relevance+of+the+supramolecular+arrangements+of+the+respiratory+chain+complexes+in+human+diseases+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">The relevance of the supramolecular arrangements of the respiratory chain complexes in human diseases and aging.</a> Mitochondrion. 47, 266-272 (2019).</li>
<li>Hollinshead, K. E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+Supercomplexes+Promote+Mitochondrial+Efficiency+and+Growth+in+Severely+Hypoxic+Pancreatic+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Respiratory Supercomplexes Promote Mitochondrial Efficiency and Growth in Severely Hypoxic Pancreatic Cancer.</a> Cell Rep. 33 (1), 108231(2020).</li>
<li>Ikeda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+supercomplex+assembly+promotes+breast+and+endometrial+tumorigenesis+by+metabolic+alterations+and+enhanced+hypoxia+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial supercomplex assembly promotes breast and endometrial tumorigenesis by metabolic alterations and enhanced hypoxia tolerance.</a> Nat Commun. 10 (1), 4108(2019).</li>
<li>Kamada, S., Takeiwa, T., Ikeda, K., Horie, K., Inoue, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+COX7RP+and+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of COX7RP and mitochondrial oxidative phosphorylation in breast cancer.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 717881(2022).</li>
<li>Marco-Brualla, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+ND2+subunit+of+mitochondrial+complex+I+are+sufficient+to+confer+increased+tumorigenic+and+metastatic+potential+to+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Mutations in the ND2 subunit of mitochondrial complex I are sufficient to confer increased tumorigenic and metastatic potential to cancer cells.</a> Cancers (Basel). 11 (7), 1027(2019).</li>
<li>Moreno-Loshuertos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+hot+can+mitochondria+be%3F+Incubation+at+temperatures+above+43+degrees+C+induces+the+degradation+of+respiratory+complexes+and+supercomplexes+in+intact+cells+and+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">How hot can mitochondria be? Incubation at temperatures above 43 degrees C induces the degradation of respiratory complexes and supercomplexes in intact cells and isolated mitochondria.</a> Mitochondrion. 69, 83-94 (2023).</li>
<li>Vonck, J., Schafer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+organization+of+protein+complexes+in+the+mitochondrial+inner+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Supramolecular organization of protein complexes in the mitochondrial inner membrane.</a> Biochim Biophys Acta. 1793 (1), 117-124 (2009).</li>
<li>Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrangement+of+electron+transport+chain+components+in+bovine+mitochondrial+supercomplex+I1III2IV1%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1.</a> EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).</li>
<li>Cogliati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+super-assembly+of+respiratory+complexes+III+and+IV%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV.</a> Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).</li>
<li>Gonzalez-Franquesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometry-based+proteomics+reveals+mitochondrial+supercomplexome+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometry-based proteomics reveals mitochondrial supercomplexome plasticity.</a> Cell Rep. 35 (8), 109180(2021).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+applications+of+blue-native+and+clear-native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis.</a> Proteomics. 8 (19), 3974-3990 (2008).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li>
<li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> J Vis Exp. (49), e2452(2011).</li>
<li>Lai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondrial+subpopulations+from+skeletal+muscle%3A+Optimizing+recovery+and+preserving+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity.</a> Acta Physiol (Oxf). 225 (2), e13182(2019).</li>
<li>Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+electrophoresis+for+isolation+of+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Native electrophoresis for isolation of mitochondrial oxidative phosphorylation protein complexes.</a> Methods Enzymol. 260, 190-202 (1995).</li>
<li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li>
<li>Chomyn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-mediated+transformation+of+mtDNA-less+human+cells%3A+analysis+of+phenotypic+variability+among+clones+from+normal+individuals--and+complementation+behavior+of+the+tRNALys+mutation+causing+myoclonic+epilepsy+and+ragged+red+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Platelet-mediated transformation of mtDNA-less human cells: analysis of phenotypic variability among clones from normal individuals--and complementation behavior of the tRNALys mutation causing myoclonic epilepsy and ragged red fibers.</a> Am J Hum Genet. 54 (6), 966-974 (1994).</li>
<li>Moreno-Loshuertos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+reactive+oxygen+species+production+explain+the+phenotypes+associated+with+common+mouse+mitochondrial+DNA+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Differences in reactive oxygen species production explain the phenotypes associated with common mouse mitochondrial DNA variants.</a> Nat Genet. 38 (11), 1261-1268 (2006).</li>
<li>Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFern%C3%A1ndez-Vizarra%2C+E+%22Cell+Biology+%28Third+Edition%29%22">Cell Biology (Third Edition)</a>. , Academic Press. 69-77 (2006).</li>
<li>Cogliati, S., Herranz, F., Ruiz-Cabello, J., Enríquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digitonin+concentration+is+determinant+for+mitochondrial+supercomplexes+analysis+by+BlueNative+page%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Digitonin concentration is determinant for mitochondrial supercomplexes analysis by BlueNative page.</a> Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1862 (1), 148332(2021).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Les adaptations méthodologiques introduites dans les protocoles décrits ici visent à éviter les pertes et à augmenter le rendement tout en maintenant les activités du complexe mitochondrial (ce qui est crucial lorsque la disponibilité de quantités suffisantes d’échantillons est compromise) et à reproduire le modèle de SC attendu du tissu ou de la lignée cellulaire (voir Figure 2C). Dans ce but et comme une grande pureté mitochondriale n’est pas nécessaire pour détecter correctement les SC, le nombre d’étapes, de temps et de volumes a été réduit chaque fois que cela était possible.
Ainsi, après homogénéisation et élimination des noyaux et des cellules ininterrompues par centrifugation à basse vitesse, les surnageants contenant les mitochondries sont transférés dans des tubes en polypropylène de 1,5 mL, et les centrifugations ultérieures pour obtenir les fractions mitochondriales brutes sont effectuées dans un microfuge en augmentant la vitesse et en réduisant les temps et les volumes par rapport aux protocoles conventionnels. Cela permet de traiter plusieurs échantillons dans un délai relativement court : on estime que 10 échantillons peuvent être traités en ~2-2,5 h (depuis le début de l’homogénéisation (étape du protocole 1.6. ou équivalent pour les tissus) jusqu’à l’obtention de la fraction des SCs prête à être chargée dans un gel (étape du protocole 3.7) et minimise les pertes tout en conservant les activités. Une autre modification par rapport aux protocoles originaux du groupe de Schägger est de substituer, après la solubilisation membranaire pour l’obtention de la fraction SCs, une étape d’ultracentrifugation par une simple centrifugation par microfuge (étape 3.4 du protocole).
Il y a quelques étapes critiques dans la procédure. Tout d’abord, l’efficacité de la rupture cellulaire, en particulier dans le cas de cellules cultivées (voir note après l’étape 1.8 du protocole) et particulièrement dans le cas de petites cellules. Les tissus et les lignées cellulaires présentent un degré de difficulté variable dans la rupture cellulaire : par exemple, dans le cœur et les muscles, cette étape est généralement moins efficace que dans le foie ou la rate, mais elle est compensée en rendement car les premiers ont un contenu mitochondrial plus élevé. Une alternative pour améliorer le rendement mitochondrial lorsqu’il est isolé du muscle ou du cœur serait le traitement des échantillons avec de la trypsine avant l’homogénéisation. Le cerveau est un autre tissu qui présente une faible efficacité dans la rupture cellulaire en raison de l’homogénéisation manuelle, qui est plus douce et moins efficace et probablement aussi en raison de la plus grande variation des types de cellules dans ce tissu, comme il a été rapporté précédemment 42. Cela peut être partiellement compensé par une deuxième étape d’homogénéisation comme suggéré dans notre protocole (étape 2.7.4). D’autre part, si la rupture cellulaire est excessive, l’échantillon final contenant des CS pourrait être contaminé par des fragments d’ADN nucléaire qui pourraient interférer avec le fonctionnement électrophorétique. Ce problème se manifeste par une augmentation de la viscosité de l’échantillon lorsque la digitonine est ajoutée pour solubiliser les membranes mitochondriales et peut être résolu par un traitement avec de la DNAse I.
Deuxièmement, si le rapport détergent/protéine est trop faible, cela entraînerait une solubilisation membranaire moins efficace et la possibilité de formation d’agrégats. Cela pourrait se manifester dans les gels par une faible résolution dans les SC de haut poids moléculaire (voir Figure 4) ou par un CIV donnant plusieurs bandes correspondant aux oligomères43. Si le ratio est trop élevé, cela pourrait conduire à une désagrégation des SC (principalement des CI-SC). Troisièmement, il est important d’éviter de chauffer les échantillons pendant toute la procédure (voir la figure 4) et d’éviter les cycles répétés de congélation-décongélation, car ils peuvent affecter l’état de l’assemblage du SC.
Le tableau 2 présente un résumé des rendements attendus pour plusieurs types de cellules et d’échantillons de tissus. Les valeurs sont approximatives et dépendront de l’efficacité de la rupture de la cellule et de la nature de la source. Dans le cas des tissus, si le matériau de départ est congelé, il a tendance à donner un rendement plus élevé qu’avec des échantillons frais. Une estimation du nombre de voies (en considérant une charge comprise entre 50 et 60 μg de protéine mitochondriale par voie) qui peuvent être chargées est présentée.
Les protocoles présentés ici couvrent une variété de tissus et de types de cellules avec de petites variations, ils peuvent être utilisés avec des échantillons frais ou congelés et nécessitent un équipement simple et un coût relativement faible, n’impliquant pas l’utilisation de kits de purification ou de gradients coûteux. Cependant, ils peuvent nécessiter certaines adaptations pour être utilisés avec des types de cellules ou des échantillons particuliers, ainsi que lorsque des populations mitochondriales spécifiques, telles que les mitochondries synaptiques cérébrales ou les mitochondries sous-sarcolemmales musculaires, par exemple, font l’objet d’analyses.
Étant donné que les rôles physiologiques précis ainsi que l’implication potentielle des CS dans des situations pathologiques restent à définir, l’analyse de leur dynamique et des facteurs affectant leur assemblage, leur stabilité et leur fonction est nécessaire. Nos protocoles peuvent représenter des outils précieux qui permettent d’obtenir des résultats reproductibles sur les modèles de SC avec de petites tailles d’échantillons et à partir d’une variété de types de cellules et de tissus, en particulier lorsque plusieurs conditions expérimentales doivent être comparées29.

Les supercomplexes (SC) sont des associations supramoléculairesentre les complexes 1,2 de la chaîne respiratoire individuelle. Depuis l’identification initiale des SC et la description de leur composition par le groupe de Schägger 2,3, confirmée plus tard par d’autres groupes, il a été établi qu’ils contiennent des complexes respiratoires I, III et IV (CI, CII et CIV, respectivement) dans différentes stœchiométries. Deux populations principales de CS peuvent être définies, celles contenant des CI (et soit CIII seul, soit CIII et CIV) et de très haut poids moléculaire (MW, à partir de ~1,5 MDa pour les SC plus petits : CI + CIII2) et celles contenant CIII et CIV mais pas CI, de taille beaucoup plus petite (comme CIII2 + CIV avec ~680 kDa). Ces SC coexistent dans la membrane mitochondriale interne avec des complexes libres, également dans des proportions différentes. Ainsi, alors que l’IC se trouve principalement sous ses formes associées (c’est-à-dire dans les SC : ~80% dans le cœur bovin et plus de 90% dans de nombreux types de cellules humaines)3, le CIV est très abondant sous sa forme libre (plus de 80% dans le cœur bovin), l’ICII montrant une distribution plus équilibrée (~40% dans sa forme libre plus abondante, comme dimère, dans le cœur de bovin).
Bien que leur existence soit maintenant généralement acceptée, leur rôle précis est encore en débat 4,5,6,7,8,9,10. Selon le modèle de plasticité, différentes proportions de SC et de complexes individuels peuvent exister en fonction du type de cellule ou de l’état métabolique 1,7,11. Cette nature dynamique de l’assemblage permettrait aux cellules de réguler l’utilisation des combustibles disponibles et l’efficacité du système de phosphorylation oxydative (OXPHOS) en réponse aux changements environnementaux 4,5,7. Les CS pourraient également contribuer à contrôler le taux de génération d’espèces réactives de l’oxygène et participer à la stabilisation et au renouvellement des complexes individuels 4,12,13,14. Des modifications de l’état d’assemblage des CS ont été décrites en association avec différentes situations physiologiques et pathologiques15,16 et avec le processus de vieillissement17.
Ainsi, des changements dans les motifs SC ont été décrits chez la levure en fonction de la source de carbone utilisée pour la croissance2 et dans les cellules de mammifères en culture lorsque le glucose est substitué par le galactose4. Des modifications ont également été signalées dans le foie de souris après le jeûne8 et dans les astrocytes lorsque l’oxydation des acides gras mitochondriaux est bloquée18. De plus, une diminution ou des altérations des SC et de l’OXPHOS ont été observées dans le syndrome de Barth19, l’insuffisance cardiaque20, plusieurs troubles métaboliques21 et neurologiques 22,23,24, et différentes tumeurs 25,26,27,28. La question de savoir si ces altérations de l’assemblage et des niveaux de SC sont une cause primaire ou représentent des effets secondaires dans ces situations pathologiques est encore à l’étude15,16. Différentes méthodologies peuvent fournir des informations sur l’assemblage et la fonction des SC ; Il s’agit notamment des mesures d’activité 8,29, de l’analyse ultrastructurale30,31 et de la protéomique32,33. Une alternative utile qui est de plus en plus utilisée et qui constitue le point de départ de certaines des méthodologies mentionnées précédemment est la détermination directe de l’état d’assemblage des SC par électrophorèse native bleue (BN), développée à cet effet par le groupede Schägger 34,35.
Cette approche nécessite des procédures reproductibles et efficaces pour obtenir et solubiliser les membranes mitochondriales et peut être complétée par d’autres techniques telles que l’analyse de l’activité dans le gel (IGA), l’électrophorèse de seconde dimension et le western blot (WB). Une limite dans les études sur la dynamique des CS par électrophorèse BN peut être la quantité de cellules de départ ou d’échantillons de tissus. Nous présentons une série de protocoles pour l’analyse de l’assemblage et de la fonction des CS, adaptés des méthodes de groupe de Schägger, qui peuvent être appliqués à des échantillons de cellules ou de tissus frais ou congelés à partir de 20 mg de tissu.

<table><tbody><tr><td>Acide acétique</td><td>PanReac</td><td>131008</td><td></td></tr><tr><td>Acide aminocaproïque</td><td>Fluka Analytical</td><td>7260</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Bis Tris</td><td>Acrons Organics</td><td>327721000</td><td></td></tr><tr><td>Bradford assay</td><td>Biorad</td><td>5000002</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blue G-250</td><td>Serva</td><td>17524</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blue R-250</td><td>Merck</td><td>1125530025</td><td></td></tr><tr><td>Cytochrome c</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2506</td><td></td></tr><tr><td>Diamino&nbsp ; benzidine (DAB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5637</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5628</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>PanReac</td><td>131669</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Acides gras libres BSA</td><td>Roche</td><td>10775835001</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>PanReac</td><td>A1067</td><td></td></tr><tr><td>Homogénéisateur Pilon en téflon</td><td>Deltalab</td><td>196102</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>PanReac</td><td>121512</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>PanReac</td><td>121509</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Labkem</td><td>MTOL-P0P</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>PanReac</td><td>131404</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Cell</td><td>BioRad</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>MTCO1 Anticorps monoclonal</td><td>Invitrogen</td><td>459600</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Roche</td><td>10107735001</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE 3 à 12 % Mini Protein Gels</td><td>Invitrogen</td><td>BN1001BOX</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE Additif de tampon cathodique (20x)</td><td>Invitrogen</td><td>BN2002</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE Tampon de fonctionnement (20x)&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>BN2001</td><td></td></tr><tr><td>NDUFA9 Anticorps monoclonal</td><td>Invitrogen</td><td>459100</td><td></td></tr><tr><td>Nitroblue Sel de tétrazolium (NBT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6876</td><td></td></tr><tr><td>Pb(NO3)2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>228621</td><td></td></tr><tr><td>Membrane PDVF</td><td>Amersham</td><td>10600023</td><td></td></tr><tr><td>Méthasulfate de phénazine (PMS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9625</td><td></td></tr><tr><td>Pierce ECL Substrat</td><td>Thermo Scientific</td><td>32106</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Merck</td><td>PMSF-RO</td><td></td></tr><tr><td>SDHA Anticorps monoclonal</td><td>Invitrogen</td><td>459200</td><td></td></tr><tr><td>Succinate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2378</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycine/pénicilline</td><td>PAN biotech</td><td>P06-07100</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3089</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>PanReac</td><td>A2264</td><td></td></tr><tr><td>UQCRC1 Anticorps monoclonal</td><td>Invitrogen</td><td>459140</td><td></td></tr><tr><td>XCell&nbsp ; SureLock Mini-Cell</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp ; EI0001</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement des mitochondries pour l’analyse des supercomplexes mitochondriaux à partir de petits échantillons de tissus et de cultures cellulaires 

Isolation of Mitochondria for Mitochondrial Supercomplex Analysis from Small Tissue and Cell Culture Samples

Au cours des dernières décennies, les preuves accumulées de l’existence de supercomplexes respiratoires (SC) ont changé notre compréhension de l’organisation de la chaîne de transport d’électrons mitochondriaux, donnant lieu à la proposition du « modèle de plasticité ». Ce modèle postule la coexistence de différentes proportions de SC et de complexes en fonction du tissu ou de l’état métabolique cellulaire. La nature dynamique de l’assemblage dans les SC permettrait aux cellules d’optimiser l’utilisation des combustibles disponibles et l’efficacité du transfert d’électrons, minimisant la génération d’espèces réactives de l’oxygène et favorisant la capacité des cellules à s’adapter aux changements environnementaux. 
Plus récemment, des anomalies dans l’assemblage des cellules souches embryonnaires ont été rapportées dans différentes maladies telles que les troubles neurodégénératifs (maladie d’Alzheimer et de Parkinson), le syndrome de Barth, le syndrome de Leigh ou le cancer. Le rôle des altérations de l’assemblage des SC dans la progression de la maladie doit encore être confirmé. Néanmoins, la disponibilité d’un nombre suffisant d’échantillons pour déterminer l’état de l’assemblage du SC est souvent un défi. C’est le cas lors de biopsies ou d’échantillons de tissus qui sont petits ou qui doivent être divisés pour plusieurs analyses, avec des cultures cellulaires à croissance lente ou provenant de dispositifs microfluidiques, avec des cultures primaires ou des cellules rares, ou lorsque l’effet de traitements particuliers coûteux doit être analysé (avec des nanoparticules, des composés très coûteux, etc.). Dans ces cas, une méthode efficace et facile à appliquer est nécessaire. Cet article présente une méthode adaptée pour obtenir des fractions mitochondriales enrichies à partir de petites quantités de cellules ou de tissus afin d’analyser la structure et la fonction des CS mitochondriaux par électrophorèse native suivie de dosages d’activité en gel ou de western blot.

Les rendements en mitochondries obtenus selon les protocoles décrits ci-dessus varient en fonction de plusieurs facteurs tels que la lignée cellulaire ou le type de tissu, la nature des échantillons (c’est-à-dire si des tissus frais ou congelés sont utilisés) ou l’efficacité du processus d’homogénéisation. Les rendements attendus de mitochondries provenant de différentes lignées cellulaires et tissus sont rassemblés dans le tableau 2. Une fois que les fractions mitochondriales ont été obtenues, l’étape suivante est l’analyse du profil des SC respiratoires, qui est effectuée après la solubilisation brute de l’échantillon mitochondrial et la séparation électrophorétique par BN-PAGE, suivie d’une analyse IGA ou d’une immunodétection WB. La figure 1 montre l’aspect des bandes de gel non colorées juste après l’exécution et le motif des bandes après la coloration standard de Coomassie d’une lignée cellulaire cultivée et d’un échantillon mitochondrial de foie de souris.
Dans la figure 2A, B, des différences claires entre les modèles d’assemblage des CS dans les cellules humaines et de souris après l’utilisation de tests IGA peuvent être observées. Ainsi, le complexe libre I est observé dans les cellules de souris alors qu’il n’est pas détectable dans les mitochondries humaines. Le modèle complexe IV-IGA est très similaire dans les deux lignées cellulaires humaines (Figure 2B) tout en présentant des différences entre les deux lignées cellulaires de souris analysées dans la Figure 2A. Ces différences sont dues au fait que les cellules BL6 expriment une variante mutante de SCAF18.
Les modèles SC, obtenus avec le protocole d’isolement mitochondrial décrit ici pour fonctionner avec de petits échantillons, sont maintenus par rapport aux protocoles « conventionnels » utilisés pour les échantillons plus grands. On peut le voir sur la figure 2C, en comparant les voies 1 et 6 (obtenues après isolement mitochondrial à l’aide d’un protocole conventionnel à partir de 3 g de foie et 1,1 g de BAT) avec, respectivement, les voies 2 et 5 (obtenues à l’aide des protocoles présentés ici à partir d’environ 0,1 g des deux tissus). Comme proposé dans le modèle de plasticité, la proportion relative de complexes respiratoires et de CS varie en fonction du type de cellule et de l’état métabolique. Comme le montre la figure 2C, D, les différents tissus présentent différents modèles d’assemblage SC. Ainsi, les mitochondries cérébrales présentent de très faibles niveaux de complexe libre I et une proportion plus élevée de SC par rapport aux autres tissus, et la BAT se caractérise par ses faibles niveaux de CV (Figure 2A) et ses quantités élevées de SC III + IV (Figure 2D). Les mitochondries cardiaques présentent des niveaux élevés de CS et de CV. Les modèles d’assemblage des CV sont très similaires entre la lignée cellulaire cultivée et un échantillon mitochondrial de foie de souris (Figure 2E).
L’assemblage de la SC peut également être analysé par la WB, comme le montre la figure 3 , pour deux échantillons obtenus à partir de cellules de contrôle de la rate et de cellules tumorales. Dans ce cas, 30 à 50 μg de protéine mitochondriale sont généralement suffisants pour détecter les différents complexes et SC avec les anticorps spécifiques. La figure 4 montre quelques-uns des principaux pièges qui peuvent survenir lors de l’application de ces protocoles. De mauvais gradients de gel peuvent produire des schémas de migration anormaux et indésirables, comme dans la figure 4A, voie 1, où les SC restent près du puits dans la partie supérieure de la voie en raison d’une concentration d’acrylamide supérieure à la normale dans le gel. L’incubation des échantillons, même pour des périodes relativement courtes, à des températures élevées (ici 37 °C et 40 °C pendant 10 min) provoque une dégradation des SC et des CI (Figure 4A , couloirs 2-4). De même, le rapport détergent/protéines est essentiel pour obtenir de bons résultats et une résolution adéquate du gel. En dessous d’un rapport de 2 g de digitonine/g de protéine, la résolution de la bande est progressivement réduite et à la concentration la plus faible (0,5 g/g), seule une tache dans la zone correspondant aux CS est visible (Figure 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66771/66771fig01.jpg"> Figure 1 : Schéma des complexes mitochondriaux et des supercomplexes après séparation BNGE de mitochondries perméabilisées à la digitonine d’une lignée cellulaire de culture (L929Balbc) et du foie de souris. Les couloirs de gauche (1 et 2) représentent l’aspect du gel non coloré juste après le passage, où seul le CV est détectable, tandis que les couloirs de droite (3 et 4) montrent le motif des bandes après la coloration de Coomassie. Abréviations : BNGE = électrophorèse sur gel natif bleu ; CV = complexe V ; SC = supercomplexes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66771/66771fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66771/66771fig02.jpg"> Figure 2 : Analyse IGA de mitochondries isolées de différentes lignées cellulaires et tissus de souris. (A,B) Activité en gel des complexes indiqués dans les mitochondries isolées de (A) lignées cellulaires de souris ou (B) humaines. L929Balbc est une lignée cellulaire transmissible générée dans notre laboratoire en transférant des mitochondries de plaquettes de souris Balb/cJ vers des cellules néo ρ°L929 comme décrit précédemment40,41. Les fibroblastes BL6 sont une lignée cellulaire immortalisée générée dans notre laboratoire à partir d’une biopsie de l’oreille d’une souris BL6. (C) Profils CI-IGA à partir de mitochondries de souris isolées à l’aide soit d’une méthode conventionnelle commençant avec 3 g de foie (voie 1) et avec 1,1 g de BAT (voie 6), soit du protocole présenté ici et commençant avec environ 0,1 g de tissu dans tous les cas (voie 2, foie ; voie 3, cœur ; voie 4, cerveau, et voie 5 BAT). (D) Modèles CIV-IGA (réalisés après CI-IGA montré dans le panneau 2C, voies 2-5) dans le foie, le cœur, le cerveau et les mitochondries BAT de souris. (E) Analyse de l’activité CV-IGA dans des cellules cultivées et du foie de souris. Environ 60 à 75 μg de protéines mitochondriales par voie ont été chargés. Abréviations : IGA = activité dans le gel ; SC = supercomplexes ; IC = complexe I ; MTD = tissu adipeux brun. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66771/66771fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66771/66771fig03.jpg"> Figure 3 : Immunodétection WB des différents complexes et supercomplexes mitochondriaux dans des échantillons de rate. Après la séparation par PAGE Blue Native des complexes mitochondriaux et des SC obtenus à partir d’échantillons de contrôle de la rate (Rate M9) et de la tumeur (Tumeur M9), ils ont été transférés sur une membrane PVDF et hybridés séquentiellement avec des anticorps qui reconnaissent les sous-unités CI, CIII, CIV et CII indiquées (panels A-D, respectivement). Environ 50 μg de protéines mitochondriales ont été chargés par voie. Les astérisques indiquent le signal restant d’un western blot précédent. Abréviations : SC = supercomplexe ; IC = complexe I ; CIII = complexe III ; CIV = complexe IV ; CII = complexe II. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66771/66771fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66771/66771fig04v2.jpg"> Figure 4 : Pièges de l’analyse SC par Blue-Native PAGE. Analyse CI IGA de mitochondries isolées à partir (A) de foie de souris frais et (B) de foie de rat congelé dans différentes conditions de solubilisation. (A) Voie 1, mauvaise concentration de gradient de gel (8-13% au lieu des 3-13% normaux). Couloirs 2 à 4, échantillons incubés pendant 10 min sur de la glace ou à 37 °C et 40 °C avant le chargement, respectivement. (B) Profil après IGA pour l’IC des mitochondries obtenues à partir du foie de rat congelé en utilisant différents rapports digitonine/protéine pour la solubilisation. Abréviations : SC = supercomplexe ; PAGE = électrophorèse sur gel de polyacrylamide ; IC = complexe I ; IGA = activité dans le gel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66771/66771fig04largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Douleur moyenne</td>
			<td colspan="3">Composition</td>
		</tr><tr><td>Tampon hypotonique</td>
			<td colspan="3">10 mM de MOPS, 83 mM de saccharose, pH 7,2</td>
		</tr><tr><td>Tampon hypertonique</td>
			<td colspan="3">30 mM MOPS, 250 mM de saccharose, pH 7,2</td>
		</tr><tr><td>Tampon d’homogénéisation A</td>
			<td colspan="3">10 mM de Tris, 1 mM d’EDTA, 0,32 M de saccharose, pH 7,4</td>
		</tr><tr><td>tampon d’homogénéisation AT</td>
			<td colspan="3">225 mM de mannitol, 1 mM d’EGTA, 75 mM de saccharose, 0,01 % BSA pH 7,4</td>
		</tr><tr><td>Tampon d’homogénéisation AT2</td>
			<td colspan="3">225 mM de mannitol, 1 mM d’EGTA, 75 mM de saccharose, 0,02 % BSA pH 7,4</td>
		</tr><tr><td>Tampon d’échantillonnage BN</td>
			<td colspan="3">50 mM de NaCl, 50 mM d’imidazole, 2 mM d’acide aminocaproïque, 1 mM d’EDTA pH 7,0</td>
		</tr><tr><td>La solution Digitonin</td>
			<td colspan="3">10 % de digitonine dans 50 mM de NaCl, 50 mM d’imidazole, 5 mM d’aminocaproïque, 4 mM de PMSF</td>
		</tr><tr><td>Tampon de chargement BN</td>
			<td colspan="3">5% Coomassie Blue G dans de l’acide aminocaproïque 0,75 M</td>
		</tr><tr><td>Tampon cathodique BN A</td>
			<td colspan="3">50 mM de tricine, 15 mM de Bis-Tris pH = 7,0 (4 °C), 0,02 % G-250 (bleu brillant Coomassie G-250)</td>
		</tr><tr><td>Tampon cathodique BN B</td>
			<td colspan="3">50 mM de tricine, 15 mM de Bis-Tris pH = 7,0 (4 °C), 0,002 % G-250</td>
		</tr><tr><td>Tampon d’anode BN</td>
			<td colspan="3">50 mM de bis-tris, pH = 7,0</td>
		</tr><tr><td>Substrat IGA complexe I</td>
			<td colspan="3">5 mM de Tris-HCl pH 7,4, 0,1 mg/mL de NADH, 2,5 mg/mL de nitroblue tétrazolium (NBT)</td>
		</tr><tr><td>Substrat IGA Complex II</td>
			<td colspan="3">50 mM de tampon phosphate de potassium pH 7,4, 20 mM de succinate de sodium, 0,2 mM de méthosulfate de phénazine (PMS), 2,5 mg/mL de NBT</td>
		</tr><tr><td>Substrat IGA complexe III</td>
			<td colspan="3">50 mM tampon phosphate de potassium pH 7,2, 0,05% diaminobenzidine (DAB)</td>
		</tr><tr><td>Substrat IGA IV complexe</td>
			<td colspan="3">Même solution que CIII plus 50 μM cytochrome c</td>
		</tr><tr><td>Substrat IGA complexe V</td>
			<td colspan="3">35 mM Tris, 270 mM glycine pH 8,3, 14 mM MgSO4, 0,2% Pb(NO3)2, 8 mM ATP</td>
		</tr><tr><td>Solution de coloration</td>
			<td colspan="3">Colorant Coomassie R-250 à 0,25% dans 40% de méthanol et 10% d’acide acétique</td>
		</tr><tr><td>Solution de détachage/fixation</td>
			<td colspan="3">40 % de méthanol, 10 % d’acide acétique</td>
		</tr><tr><td>Tampon de transfert</td>
			<td colspan="3">48 mM de Tris, 39 mM de glycine, 20% de méthanol</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Tampons et composition des supports
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Type de cellule/tissu</td>
			<td>Montant de départ</td>
			<td>Rendement attendu (μg de protéine mitochondriale)</td>
			<td>Nombre de voies (50-60 μg/voie)</td>
		</tr><tr><td>Cellules cultivées</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>MDA-MB-468</td>
			<td>100 μL vpc</td>
			<td>300 à 400 μg</td>
			<td>6-9</td>
		</tr><tr><td>Dérivé de 143B</td>
			<td>100 μL vpc</td>
			<td>200 à 350 μg</td>
			<td>4-7</td>
		</tr><tr><td>Fibroblastes de souris</td>
			<td>100 μL vpc</td>
			<td>150 à 200 μg</td>
			<td>3-5</td>
		</tr><tr><td>Cœur</td>
			<td>100 mg</td>
			<td>400 à 500 μg</td>
			<td>10-12*</td>
		</tr><tr><td>Muscle squelettique</td>
			<td>100 mg</td>
			<td>300 à 400 μg</td>
			<td>8-10*</td>
		</tr><tr><td>Foie</td>
			<td>100 mg</td>
			<td>400 à 500 μg</td>
			<td>8-10</td>
		</tr><tr><td>Rate</td>
			<td>50 mg</td>
			<td>150 à 250 μg</td>
			<td>3-5</td>
		</tr><tr><td>CHAUVE-SOURIS</td>
			<td>100 mg</td>
			<td>200 à 300 μg</td>
			<td>4-6</td>
		</tr><tr><td>Cerveau</td>
			<td>100 mg</td>
			<td>250 à 300 μg</td>
			<td>5-8</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 2 : Rendements attendus des mitochondries de différents types de cellules et de tissus de souris. Les fractions mitochondriales obtenues à partir du cœur ou du muscle squelettique sont plus pures que celles obtenues à partir d’autres tissus. Ainsi, de plus petites quantités peuvent être chargées dans les gels (*).

Ce protocole décrit une technique d’analyse des supercomplexes respiratoires lorsque seules de petites quantités d’échantillons sont disponibles.

Isolement des mitochondries pour l’analyse des supercomplexes mitochondriaux à partir de petits échantillons de tissus et de cultures cellulaires 

Over the last decades, the evidence accumulated about the existence of respiratory supercomplexes (SCs) has changed our understanding of the mitochondrial ...

Nos recherches visent à mieux comprendre la biogenèse mitochondriale, en particulier l’organisation et la régulation du système OXPHOS, ainsi qu’à définir le rôle que jouent les mitochondries dans les maladies allant du cancer aux maladies neurodégénératives. Les mitochondries jouent des rôles multiples et essentiels dans la cellule, conditionnant l’ensemble de son métabolisme et sa survie. Nous améliorons lentement nos connaissances sur la complexité mitochondriale et sa contribution aux mécanismes d’adaptation cellulaire dans la santé et la maladie.Nous avons contribué à établir un nouveau modèle d’organisation pour le système OXPHOS, le modèle de plasticité qui intègre les propositions précédentes et suppose la coexistence de super-complexes et de complexes libres dans des proportions différentes pour optimiser sa fonction et permettre des adaptations cellulaires. Notre protocole permet de partir de petits tissus ou d’échantillons de culture cellulaire pour obtenir des quantités suffisantes de protéines mitochondriales pour analyser l’assemblage, l’état et la fonction des supercomplexes par électrophorèse native bleue ou d’autres techniques. Nous pouvons le faire de manière reproductible en peu de temps avec un équipement simple et à des coûts relativement faibles.

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Cette vidéo décrit la procédure d’isolement des mitochondries des tissus cancéreux de l’ovaire humain à l’aide de la centrifugation à vitesse différentielle associée à la centrifugation à gradient de densité. Les mitochondries isolées peuvent être utilisées pour l’analyse protéomique du protéome mitochondrial du cancer de l’ovaire humain.

Isolement mitochondrial : une technique pour isoler les mitochondries d’un échantillon de tissu cancéreux de l’ovaire humain

Procédé pour l'isolement rapide de mitochondries à partir de biopsies de tissu de mammifère est décrite. foie de rat ou des préparations musculaires squelettiques ont été homogénéisés avec un dissociateur tissu commercial et les mitochondries ont été isolées par filtration différentielle à travers des filtres en filet de nylon. Temps d'isolement des mitochondries est &lt;30 min par rapport à 60 - 100 min en utilisant des méthodes alternatives.

Isolement rapide et la purification des mitochondries pour la transplantation par la dissociation des tissus et différencié Filtration

La comparaison du potentiel de membrane mitochondriale entre les échantillons fournit des informations précieuses sur l’état cellulaire. Les étapes détaillées de l’isolement des mitochondries et de l’évaluation de la réponse aux inhibiteurs et aux découpleurs à l’aide de la fluorescence sont décrites. La méthode et l’utilité de ce protocole sont illustrées par l’utilisation d’une culture cellulaire et d’un modèle animal de stress cellulaire.

Isolement et analyse fonctionnelle des mitochondries de cellules cultivées et de tissus de souris

Ici, nous présentons une modification d’une méthode précédemment rapportée qui permet d’isoler des mitochondries purifiées de haute qualité à partir de plus petites quantités de muscle squelettique de souris. Cette procédure aboutit à des mitochondries fortement couplées qui respirent avec une fonction élevée lors des tests respiratoires sur microplaques.

Isolement des mitochondries à partir des quantités minimes de souris muscle squelettique pour les mesures à haut débit microplaques respiratoires

Comme les mitochondries sont seulement un petit pourcentage de la cellule végétale, ils doivent être purifiés pour une série d’études. Les mitochondries peuvent être isolés dans divers organes de la plante par homogénéisation, suivie par centrifugation en gradient de différentiel et densité afin d’obtenir une fraction mitochondriale hautement purifiée.

Isolement et mesures respiratoire des mitochondries d’Arabidopsis thaliana

Mitochondries ont spécialisé des ribosomes qui ont divergé de leurs équivalents bactériens et cytoplasmiques. Ici, nous montrons comment mitoribosomes peuvent provenir de leur compartiment natif dans les cellules HEK. La méthode implique l’isolation des mitochondries des cellules en suspension et purification conséquente de mitoribosomes.

Isolation rapide de la Mitoribosome de cellules HEK

Ici, nous décrivons une méthode détaillée pour l’isolement des mitochondries du muscle squelettique de la souris et l’analyse ultérieure de la respiration par taux de consommation d’oxygène (OCR) à l’aide de tests respirométriques sur microplaques. Ce pipeline peut être appliqué pour étudier les effets de multiples interventions environnementales ou génétiques sur le métabolisme mitochondrial.

Isolement des mitochondries du muscle squelettique de la souris pour les tests respirométriques

Ici, nous présentons une compilation de tests pour mesurer directement la fonction mitochondriale dans les cellules de mammifères indépendamment de leur capacité à consommer de l’oxygène moléculaire.

Tests indépendants de l’oxygène pour mesurer la fonction mitochondriale chez les mammifères

Nous présentons un protocole en deux étapes pour l’isolement de mitochondries de haute qualité qui est compatible avec la découverte et la quantification des protéines à l’échelle du protéome. Notre protocole ne nécessite pas de génie génétique et convient donc à l’étude des mitochondries de toutes les cellules et tissus primaires.

Isolement sans marquage en deux étapes des mitochondries pour améliorer la découverte et la quantification des protéines

Des études bioénergétiques et métabolomiques sur les mitochondries ont révélé leur rôle multiforme dans de nombreuses maladies, mais les méthodes d’isolement de ces organites varient. La méthode détaillée ici est capable de purifier des mitochondries de haute qualité à partir de plusieurs sources tissulaires. La qualité est déterminée par les rapports de contrôle respiratoire et d’autres paramètres évalués à l’aide de la respirométrie à haute résolution.

Isolement mitochondrial robuste à partir de tissu cardiaque de rongeur 

Découvrez l'isolement des mitochondries pour analyser les supercomplexes respiratoires à partir de petits échantillons de tissus et de cultures cellulaires. Cette méthode permet d'étudier la biogenèse mitochondriale et le système OXPHOS.

Isolement des mitochondries pour l’analyse des supercomplexes mitochondriaux à partir de petits échantillons de tissus et de cultures cellulaires (Vidéo) | JoVE Journal

Isolement des mitochondries pour l’analyse des supercomplexes mitochondriaux à partir de petits échantillons de tissus et de cultures cellulaires

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