Name: Mise en place d’un modèle d’embolie pulmonaire peu invasif chez le rat à l’aide de caillots sanguins autologues (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-25T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Apprenez à établir un modèle d'embolie pulmonaire peu invasif chez le rat en utilisant des caillots sanguins autologues. Cette méthode améliore la fiabilité des expériences et facilite le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.

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Toutes les expériences sur les animaux ont été menées avec l’approbation du Comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Académie chinoise des sciences médicales et du Collège médical de l’Union de Pékin (numéro d’approbation : IRM/2-1ACUC-2311-015). Des rats Sprague-Dawley mâles, âgés de 6 semaines et pesant environ 250 g, ont été utilisés dans cette étude. Les animaux ont été logés dans un environnement spécifique exempt d’agents pathogènes avec un accès ad libitum à une alimentation équilibrée et à de l’eau. Ils ont été conservés sous un cycle lumière/obscurité de 12 heures à une température ambiante de 22 °C ± 2 °C. Les animaux ont été laissés s’adapter à l’environnement pendant 1 semaine avant de subir des interventions chirurgicales. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.
1. Équipement et matériaux
<ol>
	<li>Équipement d’anesthésie : Utilisez un appareil d’anesthésie gazeuse pour les petits animaux et l’isoflurane.</li>
	<li>Matériel chirurgical : Préparez des cotons-tiges, un désinfectant à l’iodophor, un stéréomicroscope, un rasoir, du ruban médical, une seringue de 1 ml avec une aiguille de 27 g, une seringue de 5 ml, une seringue de 10 ml, une solution saline normale, de la gaze, 8-0 Fils de nylon, fil de nylon 6-0 avec une aiguille de suture, micro-pinces hémostatiques, micro-pinces à épiler et ciseaux fins.</li>
	<li>Autres matériaux : Procurez-vous des aiguilles de distribution de 19 G et 18 G compatibles avec les seringues médicales, un tube en silicone d’un diamètre intérieur de 1,2 mm et d’une longueur de 10 cm, d’un tube de perfusion d’un diamètre intérieur de 3,0 mm et d’une longueur de 20 cm, d’un tube à centrifuger de 1,5 ml, d’une pipette et d’embouts de pipette.</li>
	<li>Générateur de thrombus et injecteur de caillots sanguins fabriqués par vos soins (Figure 1) : Connectez le tube en silicone à l’aiguille de distribution de 19 G fixée à une seringue de 1 ml pour créer le générateur de thrombus. Connectez une extrémité du tube de perfusion à l’aiguille de distribution de 18 G et fixez l’autre extrémité à une seringue de 5 ml pour créer l’injecteur de caillot.</li>
</ol>
2. Préparation autologue du caillot sanguin
<ol>
	<li>Anesthésie<ol>
		<li>Placez l’animal à l’intérieur de la chambre d’induction de l’anesthésie et administrez-lui un mélange d’isoflurane à 4 % avec de l’air ambiant à un débit de 2 L/min pendant 2 à 3 minutes (en suivant les protocoles approuvés par l’établissement).</li>
		<li>Positionnez l’animal sur la plate-forme d’opération en position couchée. Maintenez l’anesthésie en administrant de l’isoflurane à 2,5 % à un débit de 0,4 L/min. Testez le réflexe de la pédale pour vous assurer qu’une anesthésie adéquate est obtenue.</li>
		<li>Étendez les deux membres antérieurs horizontalement du corps et étendez les membres postérieurs pour exposer adéquatement la région de l’aine. Fixez l’animal dans cette position à l’aide d’un ruban adhésif médical (figure 2A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Prélèvement sanguin par la veine cave crânienne (CVC)<ol>
		<li>Retirez les poils autour du manubrium à l’aide d’un rasoir et d’une crème dépilatoire. Désinfectez la peau avec de l’iodophore.</li>
		<li>Insérez l’aiguille de 27 G fixée à la seringue de 1 mL verticalement jusqu’à une profondeur de 8 mm pour percer le CVC gauche ou droit, comme illustré à la figure 2A. REMARQUE : La projection de la surface du corps du CVC est de 5 mm latérale au manubrium. Les deux côtés peuvent être utilisés, et le choix n’affecte pas les étapes suivantes.</li>
		<li>Tenez la seringue et tirez doucement le piston vers l’arrière pour créer une pression négative à l’intérieur du cylindre. Retirez graduellement l’aiguille jusqu’à ce que le sang coule, puis maintenez cette position jusqu’à ce que 0,3 mL de sang soit prélevé (figure 2B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Préparation des caillots sanguins<ol>
		<li>Poussez le sang recueilli dans un tube à centrifuger de 1,5 ml, en prenant soin de ne pas produire de bulles.</li>
		<li>Aspirez le sang dans le tube en silicone du générateur de thrombus fabriqué par vos soins jusqu’à ce que la colonne sanguine atteigne 10 cm de long. REMARQUE : Effectuez ces deux étapes rapidement, car la coagulation commencera et se propagera dans le tube de centrifugation, abaissant la qualité des caillots sanguins récoltés.</li>
		<li>Attendez 30 minutes jusqu’à ce que le sang soit complètement thrombosé. Pendant ce temps, préparez des colonnes de sang pour les autres animaux de la même manière.</li>
		<li>Rincez la colonne sanguine thrombosée dans une boîte de Pétri contenant une solution saline normale et lavez la colonne thrombus avec une solution saline normale trois fois (Figure 2C).</li>
		<li>À l’aide de ciseaux fins, la colonne du thrombus est découpée en caillots sanguins uniformes de 4 mm de longueur chacun (figure 2D). Aspirez 10 à 20 caillots dans l’injecteur fait maison pré-rempli de 2 ml de solution saline normale. REMARQUE : La longueur des caillots sanguins ne doit pas dépasser 1 cm, sinon ils se coinceront dans le ventricule droit.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Préparation de l’accès veineux
<ol>
	<li>Exposer les vaisseaux épigastriques superficiels<ol>
		<li>Anesthésie et fixe l’animal comme décrit à l’étape 2.1.</li>
		<li>Rasez les poils entourant la région de l’aine gauche. Appliquez de la crème dépilatoire sur ces zones, attendez 1 minute, puis essuyez la crème avec de la gaze. Désinfectez la peau avec de l’iodophore.</li>
		<li>Faites une incision cutanée de 5 mm au-dessus de l’origine des vaisseaux épigastriques superficiels dans la région de l’aine. Habituellement, l’origine des vaisseaux épigastriques superficiels peut être retracée en observant une minuscule pulsation dans la région de l’aine.</li>
		<li>À l’aide d’un stéréomicroscope à grossissement 10x, séparez une fine couche de graisse sous-cutanée pour exposer les vaisseaux épigastriques superficiels (Figure 3A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Isolement de la veine épigastrique superficielle<ol>
		<li>Isolez soigneusement la veine épigastrique superficielle de l’artère, du nerf et du tissu adipeux. Effectuez cela à la fois proximalement, jusqu’au point où il s’écoule dans la veine fémorale, et distalement, jusqu’à la première bifurcation veineuse.</li>
		<li>Ligate du côté distal avec 8-0 Vissez et serrez le filetage à l’aide d’une micro-pince. Contrôlez le côté proximal avec un 8-0 boucle de filetage fixée à une autre micro-pince (Figure 3B).</li>
		<li>Faites une petite incision transversale sur le côté distal de la veine isolée. Contrôlez le côté proximal pour éviter les saignements. Rincez le sang restant dans la lumière veineuse avec une solution saline normale. Une fois que la veine est dégagée, utilisez une micro-pince à épiler pour élargir l’incision veineuse.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Embolisation
<ol>
	<li>Canulation veineuse<ol>
		<li>Insérez doucement l’aiguille de l’injecteur fait maison dans la veine par l’incision veineuse. Fixez l’aiguille avec une troisième pince pour l’empêcher de glisser hors de la veine.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Procédure d’embolisation<ol>
		<li>Poussez lentement le piston pour administrer une petite quantité de solution saline normale. La plénitude de la veine sans résistance indique un accès veineux non obstrué (Figure 3D).</li>
		<li>Continuez à pousser le piston pour administrer des caillots dans la veine fémorale par l’accès superficiel de la veine épigastrique. Contrôlez la vitesse d’embolisation à 5 embolies par minute. Surveiller la respiration de l’animal ; L’apparition et l’exacerbation de la dyspnée indiquent une embolisation réussie.</li>
		<li>Après avoir injecté la quantité prédéfinie de caillots sanguins, retirez l’aiguille et ligaturez le côté proximal de la veine épigastrique superficielle.</li>
		<li>Suturez l’incision et placez l’animal dans une boîte chaude. Transférez l’animal dans sa cage une fois qu’il s’est réveillé.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Quantification de la zone infarctus
<ol>
	<li>Euthanasie et perfusion cardiaque<ol>
		<li>Ajoutez 25 000 U d’héparine sodique à 250 ml de solution saline normale et mélangez soigneusement. Connectez le flacon à un appareil de perfusion et suspendez le flacon à l’envers à une hauteur de 80 cm. Fermez la valve de l’appareil de perfusion.</li>
		<li>Euthanasier les animaux présentant une surdose d’isoflurane (en suivant les protocoles approuvés par l’établissement).</li>
		<li>Coupez les côtes avec de grands ciseaux et ouvrez la poitrine, en évitant d’endommager les poumons et les gros vaisseaux.</li>
		<li>Insérez l’aiguille du dispositif de perfusion dans le ventricule gauche. Ouvrez la valve du dispositif de perfusion pour permettre la perfusion de solution saline héparinisée. Utilisez des ciseaux pour couper la veine cave inférieure et l’appendice gauche pour permettre le drainage. Contrôler la vitesse de perfusion à 50 mL/min. REMARQUE : Au cours de cette procédure, le tissu pulmonaire normal deviendra blanc, tandis que la zone embolisée reste rouillée.</li>
		<li>Après avoir terminé la perfusion avec une solution saline héparinisée, percer le tronc de l’artère pulmonaire à travers le ventricule droit à l’aide d’une seringue de 10 ml remplie d’une solution de paraformaldéhyde à 4 %. Fixer le tissu pulmonaire en effectuant une perfusion de paraformaldéhyde à 4 % dans les poumons pour un volume total de 30 mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Introduction d’un indice appelé taux d’infarctus<ol>
		<li>Après la fixation, excisez les poumons, le cœur, la trachée, l’œsophage, le thymus et les gros vaisseaux dans leur ensemble de la colonne vertébrale et du diaphragme11.</li>
		<li>Retirez soigneusement l’œsophage, le thymus et le tissu adipeux de la masse initiale, ne laissant que le cœur, les poumons et les gros vaisseaux.</li>
		<li>Immerger la partie restante dans un volume adéquat de solution de paraformaldéhyde à 4 % pendant au moins 48 h.</li>
		<li>Utilisez une balance analytique pour peser l’ensemble des poumons. Utilisez des ciseaux fins pour séparer la partie infarctus des poumons et pesez le tissu infarctus avec la même balance. Calculez le taux d’infarctus à l’aide de l’équation suivante : 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66776/66776eq01.jpg" style="margin: auto;"> 
		i est le poids du tissu infarctus, w est le poids de l’ensemble des poumons, I représente le taux d’infarctus.</li>
		<li>Après avoir quantifié la zone infarctus, coupez le tissu pulmonaire fixé au paraformaldéhyde pour l’incorporation de paraffine11.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Visualisation de l’arbre artériel pulmonaire
<ol>
	<li>Moulage de l’artère pulmonaire<ol>
		<li>Euthanasier l’animal et effectuer une perfusion cardiaque comme décrit à l’étape 5.1.</li>
		<li>Ajoutez une quantité égale (en poids) de diluant à la pâte de coulée de silicone, mélangez le mélange, puis ajoutez 5 % (en poids ou en volume) de l’agent de durcissement. Mélangez à nouveau le mélange.</li>
		<li>Prélevez 1 mL du mélange dans une seringue de 1 mL, évacuez l’air et insérez l’aiguille dans le tronc de l’artère pulmonaire par le ventricule droit. Fixez l’aiguille à l’artère pulmonaire pour éviter le glissement et le reflux.</li>
		<li>Appuyez doucement sur le piston pour permettre au mélange de coulée de silicone de remplir l’arbre artériel pulmonaire. Les zones pulmonaires normales seront teintées par le mélange de coulée, tandis que les zones infarctus resteront rouge rouille. REMARQUE : Le plâtre de l’artère pulmonaire ne doit être appliqué que sur du tissu pulmonaire intact. En règle générale, 0,6 à 0,8 mL du mélange de coulée est suffisant pour remplir l’arbre artériel pulmonaire. Une injection excessive du mélange de coulée peut entraîner un plâtre de la veine pulmonaire, ce qui a un impact sur la visualisation de l’arbre artériel pulmonaire. Le mélange de coulée doit être utilisé dans les 20 minutes suivant l’ajout de l’agent de durcissement, car il cristallise au-delà de ce temps.</li>
		<li>Retirez la seringue après la perfusion du plâtre, ligaturez le tronc de l’artère pulmonaire et prélevez les poumons, le cœur et les gros vaisseaux comme décrit à l’étape 5.2. Placez toute la masse dans une boîte de Pétri et conservez-la dans un réfrigérateur à 4 °C pendant la nuit pour permettre au mélange de coulée de cristalliser.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nettoyage et visualisation<ol>
		<li>Retirez le cœur et les gros vaisseaux des poumons avec des ciseaux, puis nettoyez les débris du mélange de durcissement de la surface des poumons.</li>
		<li>Immergez les poumons séquentiellement dans des solutions d’alcool éthylique à 25 %, 50 %, 75 %, 95 % et 100 %, pendant 24 h chacune. Cette procédure déshydratera complètement les poumons.</li>
		<li>Immerger les poumons déshydratés dans du salicylate de méthyle pendant 24 h. Après ce processus de nettoyage, l’arbre artériel pulmonaire sera visible, et les emboles peuvent également être vus, car le salicylate de méthyle n’élimine pas l’hémoglobine (Figure 4B, D).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

<table><tbody><tr><td>Balance analytique</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>MA55/A</td><td>Aucun Aiguille</td></tr><tr><td>de distribution</td><td>Jinrong electronics</td><td>Aucun</td><td>19 G et 18 G</td></tr><tr><td>Ciseaux fins</td><td>Stronger</td><td>XGJ1300</td><td>Aucun</td></tr><tr><td>Héparine sel de sodium</td><td>Solarbio</td><td>01-08-9041</td><td>140U/mg</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>RWD</td><td>R510-22-10</td><td>Aucun</td></tr><tr><td>Salicylate de méthyle</td><td>Macklin</td><td>M813577</td><td>AR, 99 %</td></tr><tr><td>Micro pince</td><td>JZ&nbsp ;</td><td>W40160</td><td>Aucun</td></tr><tr><td>Micro pince à épiler</td><td>Stronger</td><td>XGN1310</td><td>Aucun</td></tr><tr><td>Composé de coulée de silicone</td><td>Flow Tech</td><td>MV-130</td><td>Aucun</td></tr><tr><td>Rats Sprague-Dawley</td><td>Vital River</td><td>SD-IGS</td><td>Aucun</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Murzider</td><td>MSD204</td><td>Aucun</td></tr></tbody></table>

mise en place d’un modèle d’embolie pulmonaire peu invasif chez le rat à l’aide de caillots sanguins autologues

Establishment of a Minimally Invasive Rat Model of Pulmonary Embolism Using Autologous Blood Clots

Symptômes et pathologie du modèle EP Pendant l’embolisation, les rats ont ressenti un essoufflement et le thorax a montré des fluctuations élargies. Presque tous les animaux ont survécu à l’épisode d’embolie pulmonaire lorsque moins de 10 cm de caillots sanguins ont été administrés (14 animaux modélisés sur 15). Après avoir été renvoyés dans leurs cages, les animaux se sont recroquevillés dans des coins et ont montré un intérêt réduit pour la nourriture et l’eau. Cependant, ces symptômes ont disparu rapidement et, en quelques heures, les animaux se sont comportés normalement. Il n’y avait pas de différence significative de poids entre le départ et 24 h après l’embolisation (341,8 ± 10,4 vs 343,3 ± 8,5, p = 0,25).
La pathologie macroscopique a révélé que les zones embolisées (infarctus) étaient en forme de coin, principalement situées dans la partie inférieure des poumons, avec des bords clairs. Les emboles ont été trouvés à l’apex des zones infarctuses, bloquant les première et deuxième branches de l’artère pulmonaire. Une pathologie microscopique utilisant une coloration à l’hématoxyline-éosine a confirmé l’embolisation d’une branche de l’artère pulmonaire (Figure 4F).
Charge de caillots sanguins et zone infarctus Dans une étude préliminaire sur l’impact de la charge de caillots sanguins sur l’infarctus du poumon, nous avons testé à la fois une faible charge de caillots sanguins (colonne de thrombus de 6 cm, 15 caillots) et une charge de caillot sanguin élevée (colonne de thrombus de 10 cm, 25 caillots). Comme prévu, une charge plus élevée d’embolies a entraîné une plus grande zone d’infarctus pulmonaire (figure 5A-C).
Fibrinolyse intrinsèque dans les 24 h Par rapport aux échantillons pulmonaires prélevés immédiatement après l’embolisation, les échantillons pulmonaires prélevés 24 heures après l’embolisation ont montré une diminution marquée des zones infarctuses, indiquant un fort potentiel de fibrinolyse intrinsèque chez le rat (figure 5D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66776/66776fig01.jpg"> 
Figure 1 : Construction du générateur de thrombus et de l’injecteur de caillots sanguins. (A) Le générateur de thrombus a été assemblé en connectant un tube de silicium à une aiguille de distribution de 18 G (diamètre extérieur de 12 mm) et à une seringue de 1 mL préremplie de 0,5 mL de solution saline normale. (B) L’injecteur de caillot sanguin a été construit en connectant une aiguille de distribution de 19 G (diamètre intérieur de 0,84 mm, diamètre extérieur de 1,08 mm) à un tube de perfusion (récipient de caillot) et à une seringue de 5 mL préremplie de solution saline normale de 2 mL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66776/66776fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66776/66776fig02.jpg"> 
Figure 2 : Prélèvement sanguin et préparation du caillot. (A) Le rat a été anesthésié et fixé en position couchée. Le cercle blanc avec une ligne pointillée indique le manubrium, servant de marqueur de surface corporelle. Les points rouges à côté du cercle blanc indiquent les sites de ponction permettant d’accéder à la veine cave crânienne bilatérale (CVC). La partie inférieure de la figure montre une illustration d’autopsie des positions relatives du manubrium, des CVC et des sites de ponction. (B) Prélèvement sanguin réussi grâce au CVC droit. (C) Colonne de sang thrombosée évacuée du générateur de thrombus fabriqué par ses soins. (D) Caillots sanguins dérivés de la colonne sanguine thrombosée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66776/66776fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66776/66776fig03.jpg"> 
Figure 3 : Accès veineux et embolisation. (A) Exposition des vaisseaux épigastriques superficiels par une incision cutanée de 5 mm, la flèche bleue indiquant la veine épigastrique superficielle et la flèche rouge indiquant l’artère épigastrique superficielle. (B) Isolement de la veine épigastrique superficielle des tissus environnants et contrôle de la veine avec des fils de nylon. (C) L’injecteur fabriqué par ses soins contenant des caillots sanguins. (D) Canulation de la veine avec l’aiguille de distribution de l’injecteur fabriqué par l’utilisateur et administration de caillots sanguins par l’accès veineux. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66776/66776fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66776/66776fig04.jpg"> 
Figure 4 : Pathologie de l’embolie pulmonaire. (A) Poumons normaux après perfusion de solution saline cardiaque et fixation à 4 % de paraformaldéhyde. (B) Poumons normaux visualisés par un mélange de moulage de silicone et une clairance de salicylate de méthyle, montrant un arbre artériel pulmonaire perméable et une microvascularisation. (C) Poumons immédiatement après l’embolisation avec des caillots sanguins autologues, avec des zones marquées indiquant un infarctus pulmonaire dû à l’embolisation. (D) Poumons malades visualisés par moulage d’un mélange de silicone et élimination du salicylate de méthyle, avec des flèches noires indiquant les emboles obstruant les branches de l’artère pulmonaire et des cercles pointillés blancs indiquant leurs zones touchées, qui sont infarctus. (E) Dissection du lobe pulmonaire gauche montrant des embolies (flèches rouges) dans les branches de l’artère pulmonaire. (F) Images microscopiques de l’embolisation d’un caillot sanguin dans une branche de l’artère pulmonaire à l’aide d’une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine. Barre d’échelle : 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66776/66776fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66776/66776fig05.jpg"> 
Figure 5 : Quantification du taux d’infarctus du poumon. (A) Poumons prélevés immédiatement sur un rat après embolisation avec 10 cm de caillots sanguins (longueur totale). (B) Poumons prélevés immédiatement sur un rat après embolisation avec 6 cm de thrombus. (C) Poumons immédiatement prélevés sur un rat après embolisation avec 8 cm de caillots sanguins. (D) Poumons prélevés sur un rat 24 h après l’embolisation avec 8 cm de caillots sanguins. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66776/66776fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Mise en place d’un modèle d’embolie pulmonaire peu invasif chez le rat à l’aide de caillots sanguins autologues

Pulmonary embolism (PE) is one of the leading causes of cardiovascular death, resulting in a significant socioeconomic burden. Although current treatments ...

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Mise en place d’un modèle d’embolie pulmonaire peu invasif chez le rat à l’aide de caillots sanguins autologues

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