Name: Formation d’organoïdes de thymus humain dans des hydrogels de fibrine tridimensionnels (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T13:20:00.000+00:00
Duration: 3 min 31 s
Description: Découvrez la formation d'organoïdes thymiques humains dans des hydrogels de fibrine 3D pour étudier l'auto-tolérance et l'auto-immunité. Cette méthode permet de maintenir des organoïdes jusqu'à six semaines et de produire des lymphocytes T in vitro.

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<meta charset="utf8"></head><body>Recréer le microenvironnement thymique avec des organoïdes dérivés d’iPSC

<ol><li>Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+selection+of+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Positive and negative selection of T cells.</a> Annu Rev Immunol. 21, 139-176 (2003).</li>
<li>Carpenter, A. C., Bosselut, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decision+checkpoints+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Decision checkpoints in the thymus.</a> Nat Immunol. 11 (8), 666-673 (2010).</li>
<li>Miller, J. F. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+the+thymus+and+its+impact+on+modern+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The function of the thymus and its impact on modern medicine.</a> Science. 369 (6503), eaba2429 (2020).</li>
<li>Haddad, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+thymus-colonizing+cells+during+human+development%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Dynamics of thymus-colonizing cells during human development.</a> Immunity. 24 (2), 217-230 (2006).</li>
<li>Cumano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+molecular+insights+into+immune+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">New molecular insights into immune cell development.</a> Annu Rev Immunol. 37, 497-519 (2019).</li>
<li>Bautista, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptional+profiling+of+human+thymic+stroma+uncovers+novel+cellular+heterogeneity+in+the+thymic+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptional profiling of human thymic stroma uncovers novel cellular heterogeneity in the thymic medulla.</a> Nat Commun. 12 (1), 1096(2021).</li>
<li>Kadouri, N., Nevo, S., Goldfarb, Y., Abramson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+epithelial+cell+heterogeneity%3A+TEC+by+TEC%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic epithelial cell heterogeneity: TEC by TEC.</a> Nat Rev Immunol. 20 (4), 239-253 (2020).</li>
<li>Alves, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+progression+of+cortical+and+medullary+thymic+epithelial+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Serial progression of cortical and medullary thymic epithelial microenvironments.</a> Eur J Immunol. 44 (1), 16-22 (2014).</li>
<li>Baik, S., Jenkinson, E. J., Lane, P. J. L., Anderson, G., Jenkinson, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+both+cortical+and+Aire%2B+medullary+thymic+epithelial+compartments+from+CD205%2B+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation of both cortical and Aire+ medullary thymic epithelial compartments from CD205+ progenitors.</a> Eur J Immunol. 43 (3), 589-594 (2013).</li>
<li>Tavian, M., Peault, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+development+of+the+human+hematopoietic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic development of the human hematopoietic system.</a> Int J Dev Biol. 49 (2-3), 243-250 (2005).</li>
<li>Abramson, J., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic epithelial cells.</a> Annu Rev Immunol. 35 (1), 85-118 (2017).</li>
<li>Anderson, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projection+of+an+immunological+self+shadow+within+the+thymus+by+the+aire+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein.</a> Science. 298 (5597), 1395-1401 (2002).</li>
<li>Sharma, H., Moroni, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advancements+in+regenerative+approaches+for+thymus+rejuvenation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci%22%5BJournal%5D)">Recent advancements in regenerative approaches for thymus rejuvenation.</a> Adv Sci. 8 (14), 2100543(2021).</li>
<li>Alenghat, F. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction%3A+all+signals+point+to+cytoskeleton%2C+matrix%2C+and+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction: all signals point to cytoskeleton, matrix, and integrins.</a> Sci STKE. 2002 (119), 6(2002).</li>
<li>Pinto, S., Schmidt, K., Egle, S., Stark, H. -J., Boukamp, P., Kyewski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+organotypic+coculture+model+supporting+proliferation+and+differentiation+of+medullary+thymic+epithelial+cells+and+promiscuous+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression.</a> J Immunol. 190 (3), 1085-1093 (2013).</li>
<li>Hun, M., Barsanti, M., Wong, K., Ramshaw, J., Werkmeister, J., Chidgey, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+thymic+extracellular+matrix+improves+in+vivo+thymic+organoid+T+cell+output%2C+and+drives+in+vitro+thymic+epithelial+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Native thymic extracellular matrix improves in vivo thymic organoid T cell output, and drives in vitro thymic epithelial cell differentiation.</a> Biomaterials. 118, 1-15 (2017).</li>
<li>Asnaghi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymus+extracellular+matrix-derived+scaffolds+support+graft-resident+thymopoiesis+and+long-term+in+vitro+culture+of+adult+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Funct+Mater%22%5BJournal%5D)">Thymus extracellular matrix-derived scaffolds support graft-resident thymopoiesis and long-term in vitro culture of adult thymic epithelial cells.</a> Adv Funct Mater. 31 (20), 2010747(2021).</li>
<li>Villegas, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+human+thymic-derived+cells+display+medullary+thymic+epithelial+cell+phenotype+and+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cultured human thymic-derived cells display medullary thymic epithelial cell phenotype and functionality.</a> Front Immunol. 9, 1663(2018).</li>
<li>Hauri-Hohl, M., Zuklys, S., Holländer, G. A., Ziegler, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+role+for+TGF-%CE%B2+signaling+in+the+establishment+and+function+of+the+thymic+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">A regulatory role for TGF-β signaling in the establishment and function of the thymic medulla.</a> Nat Immunol. 15 (6), 554-561 (2014).</li>
<li>Campinoti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+a+functional+human+thymus+by+postnatal+stromal+progenitor+cells+and+natural+whole-organ+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of a functional human thymus by postnatal stromal progenitor cells and natural whole-organ scaffolds.</a> Nat Commun. 11 (1), 6372(2020).</li>
<li>Ramos, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+thymic+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of functional thymic organoids from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 18 (4), 829-840 (2023).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+thymus+organoids+to+restore+thymic+function+and+induce+donor-specific+immune+tolerance+to+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Bioengineering thymus organoids to restore thymic function and induce donor-specific immune tolerance to allografts.</a> Mol Ther. 23 (7), 1262-1277 (2015).</li>
<li>Provin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatory+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+generates+thymic+epithelium+that+supports+thymic+crosstalk+and+directs+dendritic-+and+CD4%2FCD8+T-cell+full+development%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Combinatory differentiation of human induced pluripotent stem cells generates thymic epithelium that supports thymic crosstalk and directs dendritic- and CD4/CD8 T-cell full development.</a> bioRxiv. 2023, 572664(2023).</li>
<li>Parent, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+thymic+epithelium+from+human+embryonic+stem+cells+that+supports+host+T+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of functional thymic epithelium from human embryonic stem cells that supports host T cell development.</a> Cell Stem Cell. 13 (2), 219-229 (2013).</li>
<li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+thymic+epithelial+progenitor-like+cells+reconstitutes+the+thymic+microenvironment+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human embryonic stem cells into thymic epithelial progenitor-like cells reconstitutes the thymic microenvironment in vivo.</a> Cell Stem Cell. 13 (2), 230-236 (2013).</li>
<li>Inami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+to+thymic+epithelial+cells+by+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of induced pluripotent stem cells to thymic epithelial cells by phenotype.</a> Immunol Cell Biol. 89 (2), 314-321 (2011).</li>
<li>Gras-Pena, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+stem+cell-derived+thymic+epithelial+cells+enhance+human+T+cell+development+in+a+xenogeneic+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human stem cell-derived thymic epithelial cells enhance human T cell development in a xenogeneic thymus.</a> J Allergy Clin Immunol. 149 (5), 1755-1771 (2022).</li>
<li>Lai, L., Jin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+thymic+epithelial+cell+progenitors+by+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of thymic epithelial cell progenitors by mouse embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 27 (12), 3012-3020 (2009).</li>
<li>Ramos, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+human+thymic+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation of functional human thymic cells from induced pluripotent stem cells.</a> J Allergy Clin Immunol. 149 (2), 767-781 (2022).</li>
<li>Provin, N., Giraud, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+pluripotent+stem+cells+into+thymic+epithelial+cells+and+generation+of+thymic+organoids%3A+Applications+for+therapeutic+strategies+against+APECED%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of pluripotent stem cells into thymic epithelial cells and generation of thymic organoids: Applications for therapeutic strategies against APECED.</a> Front Immunol. 13, 930963(2022).</li>
<li>Montel-Hagen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+recapitulation+of+murine+thymopoiesis+from+single+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">In vitro recapitulation of murine thymopoiesis from single hematopoietic stem cells.</a> Cell Rep. 33 (4), 108320(2020).</li>
<li>Park, J. -E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+atlas+of+human+thymic+development+defines+T+cell+repertoire+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A cell atlas of human thymic development defines T cell repertoire formation.</a> Science. 367 (6480), 3224(2020).</li>
<li>Flippe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+reproducible+differentiation+of+hematopoietic+and+T+cell+progenitors+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid and reproducible differentiation of hematopoietic and T cell progenitors from pluripotent stem cells.</a> Front Cell Dev Biol. 8, 577464(2020).</li>
<li>Padonou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aire-dependent+transcripts+escape+Raver2-induced+splice-event+inclusion+in+the+thymic+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Aire-dependent transcripts escape Raver2-induced splice-event inclusion in the thymic epithelium.</a> EMBO Rep. 23 (3), e53576(2022).</li>
<li>Han, J., Zúñiga-Pflücker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-oxygen+submersion+fetal+thymus+organ+cultures+enable+FOXN1-dependent+and+-independent+support+of+T+lymphopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">High-oxygen submersion fetal thymus organ cultures enable FOXN1-dependent and -independent support of T lymphopoiesis.</a> Front Immunol. 12, 652665(2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>616370</td><td></td></tr><tr><td>BMP4</td><td>Miltenyi</td><td>130-111-165</td><td></td></tr><tr><td>CCR7 (CD197)</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>Clone : 3D12 ; Dilution : 1 : 200</td></tr><tr><td>CD14</td><td>BD</td><td>Biosciences FITC</td><td>Clone : M5E2 ; Dilution : 1 : 200</td></tr><tr><td>CD19</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>Clone : HIB19 ; Dilution : 1:200</td></tr><tr><td>CD205</td><td>BioLegend</td><td>FITC</td><td>Clone : MG38 ; Dilution : 1 : 200</td></tr><tr><td>CD3</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>PE Clone : HIT3a ; Dilution : 1 : 200</td></tr><tr><td>CD34</td><td>BD</td><td>Biosciences FITC</td><td>Clone : 8G12 ; Dilution : 1:100</td></tr><tr><td>CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>Clone : RPA-T4 ; Dilution : 1:100</td></tr><tr><td>CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>BV711</td><td>Clone : L200 ; Dilution : 1 : 200</td></tr><tr><td>CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>PerCP</td><td>Clone : HI30 ; dilution : 1 : 200</td></tr><tr><td>CD56</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>Clone : B159 ; Dilution : 1 : 200</td></tr><tr><td>CD62L</td><td>BD Biosciences</td><td>BV605</td><td>Clone : DREG-56 ; Dilution : 1 : 200</td></tr><tr><td>CD69</td><td>BD Biosciences</td><td>BV510</td><td>Clone : FN50 ; Dilution : 1:200</td></tr><tr><td>CD7</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Clone APC : M-T701 ; Dilution : 1 : 200</td></tr><tr><td>CD8</td><td>BD Biosciences</td><td>PeCy7</td><td>Clone : RPA-T8 ; Dilution : 1 : 200</td></tr><tr><td>CD8</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>PE Clone : HIT8a ; dilution : 1:200</td></tr><tr><td>Dynabeads Pan Mouse IgG</td><td>Invitrogen</td><td>11041</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Miltenyi</td><td>130-097-751</td><td></td></tr><tr><td>EPCAM (CD326)</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>Clone : HEA-125 ; Dilution : 1:200</td></tr><tr><td>EPCAM (CD326)</td><td>Miltenyi</td><td>BV711</td><td>Clone : EBA-1 ; Dilution : 1 : 200</td></tr><tr><td>FGF10</td><td>Miltenyi</td><td>130-127-858</td><td></td></tr><tr><td>FGF8</td><td>Biotechne R& D</td><td>423-F8</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogène</td><td>Sigma Aldrich</td><td>341578</td><td></td></tr><tr><td>FLT3 L</td><td>Peprotech</td><td>AF-300-19</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-61</td><td></td></tr><tr><td>IGF1</td><td>Miltenyi</td><td>130-093-886</td><td></td></tr><tr><td>IL7</td><td>Peprotech</td><td>AF-200-07</td><td></td></tr><tr><td>RANK L</td><td>Biotechne R& D</td><td>6449-TEC</td><td></td></tr><tr><td>Solution de lyse des globules rouges</td><td>Miltenyi</td><td>130-094-183</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>Peprotech</td><td>AF-300-07</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>605190</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>2605010</td><td></td></tr><tr><td>XVIVO10</td><td>Lonza</td><td>LONBE04-380Q</td><td></td></tr></tbody></table>

formation d’organoïdes de thymus humain dans des hydrogels de fibrine tridimensionnels

Formation of Human Thymus Organoids in Three-Dimensional Fibrin Hydrogels

Le flux de travail du protocole est résumé dans la figure 4. Pour ce modèle de culture d’organoïdes 3D, nous avons adopté un hydrogel de thrombine et de fibrinogène qui avait déjà été utilisé par notre équipe pour maintenir les mTECs primaires de souris pendant quelques jours, grâce aux indices physiques et mécaniques qu’il fournissait34. Après polymérisation, le gel doit présenter une structure de maille lâche, semblable à une éponge (Figure 5).
Après la phase initiale d’ensemencement et de fixation, les organoïdes ont progressivement grandi et se sont développés à la fois à la surface et dans les couches supérieures du gel. En fonction des propriétés du gel, des conditions d’ensemencement et du nombre d’organoïdes ensemencés sur le gel, les organoïdes ont formé des structures sphériques à oblongues (Figure 6) et ont parfois fusionné pour former des structures plus grandes. Deux sous-niveaux particuliers de l’organisation ont été observés au sein des organoïdes après la première semaine de culture : d’abord, nous avons observé de longues structures ressemblant à des projections à la surface des cellules formées par de grandes cellules irradiant des organoïdes et colonisant l’hydrogel dans toutes les directions (Figure 6 et Figure 7). Deuxièmement, nous avons observé des structures en forme d’amas formées par des cellules plus petites se concentrant autour de ces projections cellulaires. Bien que nous n’ayons pas été en mesure d’isoler les deux types de cellules pour confirmer l’hypothèse de l’étude, ce phénomène rappelle les arrangements 3D trouvés dans le cortex thymique, formés par l’interaction de cTEC individuels avec un grand nombre de cellules T en développement beaucoup plus petites, connues sous le nom de complexes de cellules nourricières thymiques11 (Figure 8).
À plusieurs moments de la phase de culture d’organoïdes, nous avons évalué la composition cellulaire des organoïdes thymiques par cytométrie en flux et identifié plusieurs compartiments clés : les TEC (caractérisés par EPCAM+ CD45-), les thymocytes (EPCAM- CD45+ CD3+) (Figure 9), ainsi qu’un compartiment EPCAM-CD45+ CD3- comprenant des sous-ensembles hématopoïétiques thymiques non thymocytaires. De plus amples détails sont disponibles dans Provin et al.23.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig01.jpg"> Figure 1 : Caractérisation de la différenciation iPSC à TEP. (A) Exemple de différenciation iPSC à TEP à D13, microscope à contraste de phase inversé, 400x. Barre d’échelle : 500 μm. (B) Exemple de diagramme à points, la proportion de cellules EPCAM+ parmi les cellules DAPI- au jour 14 de la différenciation, image de FlowJo 10.0.7. (C) Immunomarquage contre DAPI (bleu), PAX9 (rouge) et KRT8 (vert), immunofluorescence et imagerie confocale au jour 16 de la différenciation iPSC en TEP. Des flèches blanches indiquent des exemples de coloration anti-PAX9. Barre d’échelle : 50 μm (D) Niveau d’expression de FOXN1 (RQ à GAPDH) lors de la différenciation de iPS à TEP. TEC : Référence de contrôle positif, TEC humains primaires isolés à partir d’échantillons de thymus pédiatriques. Graphique de Prism (GraphPad version 8.0.1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig02.jpg"> Figure 2 : Configuration expérimentale pour la formation d’hydrogels, l’ensemencement d’organoïdes et la distribution du milieu de culture. (A) Plaque de culture avec des hydrogels coulés dans des inserts suspendus placés dans les rangées supérieure et inférieure. (B) Ensemencement organoïde : le cône de pipette coupé contenant 1 organoïde est placé au-dessus de l’hydrogel sans le toucher, et l’organoïde est doucement ensemencé à la surface du gel. (C) Le milieu de culture est déposé dans le puits de culture en positionnant la pointe de la pipette entre les bras de l’insert suspendu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig03.jpg"> Figure 3 : D0 d’une culture d’organoïdes thymiques avant l’ensemencement (jours 13 à 15 du protocole complet). (A) organoïde produit avec des TEC dérivés de la gamme Lon71.019 iPS. (B) Organoïde produit avec des TEC dérivés de la lignée MIPS203.003 iPS. Microscope à contraste de phase inversé, 1000x. Barres d’échelle : 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig04.jpg"> Figure 4 : Représentation résumée de toutes les étapes du protocole. Des échantillons de thymus pédiatriques ont été prélevés et dissociés, et les ETP primaires Lin-CD34+ CD7+ ont été triés par cytométrie en flux. La différenciation des cellules iPS a été menée vers une identité TEP. Les ETP et les TEP dérivés d’iPS ont été regroupés et ensemencés dans des plaques à 96 puits à faible liaison et agrégés en organoïdes thymiques pendant la nuit. Des hydrogels de fibrine ont été préparés à partir d’aprotinine, de fibrinogène et de thrombine et coulés dans des inserts suspendus. Après la polymérisation, les organoïdes ont été ensemencés sur les hydrogels et le milieu de culture de phase 1 a été ajouté aux puits. Les organoïdes ont été conservés en culture jusqu’à 6 semaines. Créé dans BioRender, la licence de publication AG26EFCZOM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig05.jpg"> Figure 5 : Organisation et structure de l’hydrogel. Microscope à contraste de phase inversé, 1000x. Barre d’échelle : 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig06.jpg"> Figure 6 : Organoïdes matures et structure tridimensionnelle. (A) Organoïde thymique au jour 24 de la culture 3D, MIPS203.003 raie iPS. (B) Image composite d’un organoïde thymique au 32e jour de la culture 3D, ligne Lon71.019 iPS. Microscope à contraste de phase inversé. Barres d’échelle : 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig07.jpg"> Figure 7 : Détail de la structure des organoïdes thymiques. (A) Organoïde thymique au 32e jour de la culture 3D, ligne L71.019 iPS. (B) Organoïde thymique au jour 27 de la culture 3D, lignée L80.002 iPS. Microscope à contraste de phase inversé, 400x. Barres d’échelle : 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig07large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig08.jpg"> Figure 8 : Détail de la structure d’un organoïde thymique au jour 32 de la culture 3D. Des flèches blanches indiquent des amas de petits thymocytes qui prolifèrent à proximité des cellules TEC. Microscope à contraste de phase inversé, 400x. Barre d’échelle : 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig08large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig09.jpg"> Figure 9 : Proportion du compartiment des lymphocytes T dans les organoïdes thymiques. (A) Exemple de diagramme à points, proportion de cellules CD45+ CD3+ dans les cellules vivantes (DAPI-) dans les organoïdes thymiques au jour 35 de la culture 3D, image de FlowJo 10.0.7. La fraction CD45+ CD3- comprend des cellules hématopoïétiques non thymocytaires. (B) La proportion de cellules CD45+ CD3+ dans les cellules vivantes des organoïdes thymiques aux jours 17, 24/25, 32 et 39/40 de la culture 3D, n = 2 en double ou en triple exemplaire, graphique de Prism (GraphPad version 8.0.1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig09large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Unité</td>
			<td>Phase 1 moyenne Jour 14 à Jour 18</td>
			<td>Phase 2 moyenne à partir du 19e jour</td>
		</tr><tr><td>Base</td>
			<td></td>
			<td>XVIVO10</td>
			<td>XVIVO10</td>
		</tr><tr><td>BMP4</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>50</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>FGF8</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>FGF10</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>IGF1</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>FEM</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>RANG L</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr><tr><td>IL7</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>FLT3 L</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>SCF</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>Glutamax</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>1%</td>
			<td>1%</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Suppléments et leurs concentrations respectives.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Aprotinine (μL)</td>
			<td>Thrombine (μL)</td>
			<td>Fibrinogène (μL)</td>
			<td>Phase 1 : support</td>
			<td>Organoïdes (unité)</td>
		</tr><tr><td>Plaque à 24 puits</td>
			<td>5</td>
			<td>75</td>
			<td>75</td>
			<td>1</td>
			<td>3 à 5</td>
		</tr><tr><td>Plaque à 12 puits</td>
			<td>9.2</td>
			<td>138.2</td>
			<td>138.2</td>
			<td>1.8</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Plaque à 6 puits</td>
			<td>16</td>
			<td>240.8</td>
			<td>240.8</td>
			<td>3.2</td>
			<td>8 à 9</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 2 : Rapports requis des composants pour la préparation des hydrogels et de l’ensemencement des organoïdes dans des plaques à 6, 12 et 24 puits.

Formation d’organoïdes de thymus humain dans des hydrogels de fibrine tridimensionnels

Generation of a functional and self-tolerant T cell repertoire is a complex process dependent on the thymic microenvironment and, primarily, on the ...

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Recherche

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3D organotypiques Co-culture Modèle Soutenir médullaire thymique des cellules épithéliales prolifération, la différenciation et Promiscuous Gene Expression

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