Name: Vitrification du tissu du cortex ovarien pour obtenir un état vitreux d’agrégation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: Découvrez la vitrification du tissu ovarien pour la préservation de la fertilité chez les patientes cancéreuses. Cette méthode améliore les protocoles de cryoconservation et augmente les chances de grossesse ultérieure.

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<meta charset="utf8"></head><body>Évaluation de la viabilité folliculaire dans les tissus vitrifiés du cortex ovarien humain

<table><tbody><tr><td>Flacons de 1,8 mL</td><td>VWR International GmbH</td><td>479-6837</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sérologique de 10 mL</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.001</td><td></td></tr><tr><td>Plaque 4 puits</td><td>Gynemed</td><td>GYOOPW-FW04</td><td></td></tr><tr><td>Tube de 50 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.559.001</td><td></td></tr><tr><td>Plaques 6 puits</td><td>Sarstedt</td><td>83.3920</td><td></td></tr><tr><td>Bacillol AF</td><td>Hartmann</td><td>973385</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Merck</td><td>17783</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase de type 1A</td><td>Merck</td><td>C2674</td><td></td></tr><tr><td>Cryosure DMSO</td><td>WAK Chemie</td><td>WAK-DMSO-10</td><td></td></tr><tr><td>Custodiol</td><td>Dr. Franz K&ouml ; hler Chemie</td><td>00867288</td><td></td></tr><tr><td>DPBS CTS Gibco</td><td>Life technologies</td><td>A12856-01</td><td></td></tr><tr><td>ErgoOne aide à la pipette</td><td>Starlab</td><td>S7166-0010</td><td></td></tr><tr><td>Ethylène glycol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>102466</td><td></td></tr><tr><td>Euronda récipient de stérilisation</td><td>euronda</td><td>282021</td><td></td></tr><tr><td>G-MOPS+</td><td>Vitrolife</td><td>10130</td><td></td></tr><tr><td>Métal mailles</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0770</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux Metzenbaum</td><td>instruments de précision mondiale</td><td>501262102</td><td></td></tr><tr><td>Système N-Bath</td><td>Nterilizer</td><td>N-Bath 3.0</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylpyrrolidone (PVP)</td><td>SAGE</td><td>ART-4005</td><td></td></tr><tr><td>Supplément de substitution de sérum (SSS)</td><td>Fujifilm Irvine scientific</td><td>99193</td><td></td></tr><tr><td>Gobelet</td> <td>stérileSarstedt</td><td>75.562.105</td><td></td></tr><tr><td>Pince stérile</td><td>Carl Roth</td><td>KL05.1</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Merck</td><td>S0389</td><td></td></tr></tbody></table>

vitrification du tissu du cortex ovarien pour obtenir un état vitreux d’agrégation

Vitrification of Ovarian Cortex Tissue to Achieve a Glassy State of Aggregation

Ce protocole présente les procédures de préparation des milieux de vitrification, des dispositifs de chargement, de la vitrification, de la préparation des milieux de réchauffement rapide, du réchauffement rapide et de la détermination de la viabilité folliculaire. Une comparaison directe de la viabilité folliculaire et des facteurs angiogéniques entre la congélation lente et la vitrification a été validée et publiée31,32.
Le succès global du protocole de vitrification décrit a été évalué en comparant le nombre de follicules vitaux avant et après la vitrification/réchauffement rapide. Le dispositif expérimental est illustré à la figure 1 et les résultats sont présentés à la figure 6. Chez 50 patients, un nombre moyen de 77,98 follicules vitaux a été observé avant la vitrification et de 62,99 après vitrification/réchauffement rapide, reflétant un taux de survie de 80,8%. Ce n’était pas significativement différent selon le test de Wilcoxon33.
Les grilles métalliques sont personnalisées individuellement à l’aide de ciseaux tranchants d’une taille de 25 mm x 8 mm, qui s’insèrent dans les bouchons des cryoflacons de 1,8 ml, comme le montrent les figures 2A et C. Après la stérilisation à l’autoclave à la vapeur, les grilles et les bouchons des flacons de 1,8 mL sont assemblés sous un banc à flux laminaire, comme l’indique la figure 2B. Cette configuration offre un maintien sûr dans le capuchon sans qu’il soit nécessaire d’effectuer des actions supplémentaires et offre une surface suffisante pour les tissus de différentes tailles. En règle générale, des morceaux de tissu de 5 mm x 10 mm pour la transplantation et des morceaux de 2 mm de diamètre pour évaluer le nombre de follicules vitaux après décongélation rapide sont vitrifiés. Les deux tailles s’adaptent parfaitement aux grilles métalliques.
L’équilibrage avec des solutions de vitrification (VS1, VS2 et VS3) est effectué dans une plaque à 6 puits sur un agitateur à bascule à température ambiante sous un banc d’écoulement laminaire, comme le montre la figure 3. Les délais prévus dans le schéma garantissent l’absorption efficace du cryoprotecteur éthylène glycol. Il est recommandé d’utiliser une plaque à 6 puits sur des vaisseaux uniques, car elle facilite le déplacement rapide du tissu entre les solutions et aide à prévenir les confusions.
Pour une vitrification verticale rapide dans l’azote liquide, le tissu du cortex ovarien est coupé en morceaux appropriés (Figure 4A). Des échantillons de cortex ovarien sont placés sur des dispositifs de charge (figures 4B, C) et immergés verticalement dans de l’azote liquide (figure 4D) pour obtenir un état d’agrégation vitreux par vitrification. Les grilles métalliques choisies permettent une manipulation verticale du tissu, comme le montre la figure 4D. De plus, les grilles métalliques sont hautement conductrices thermiquement, assurant des vitesses de refroidissement rapides de 22 °C à -196 °C, ce qui constitue une étape d’une importance cruciale dans le processus de vitrification.
Pour un réchauffement rapide, le RWS est préparé dans une tasse stérile à 37 °C. ES, RS1 et RS2 sont préparés dans une plaque à 6 puits sur un agitateur à bascule à température ambiante, comme le montre la figure 5. Le volume élevé de RWS préchauffé empêche la solution de refroidir excessivement lors de l’ajout du tissu vitrifié et assure un environnement constamment chaud pour le tissu tout au long du processus de réchauffement rapide.
Afin d’évaluer et d’assurer des normes de qualité élevées, des poinçons de biopsie de 2 mm x 2 mm sont colorés à la calcéine avant la vitrification et après un réchauffement rapide afin de déterminer la viabilité folliculaire à l’aide de la microscopie à fluorescence34,35 (Figure 6). Les follicules viables émettent une fluorescence verte à 495 nm après l’absorption intracellulaire de la calcéine. Alternativement, la viabilité folliculaire (tableau 3) peut être évaluée à l’aide de colorants rouges neutres36.
En suivant les étapes décrites dans ce protocole, le tissu ovarien se transforme en un état vitreux d’agrégation, ce qui facilite des taux de survie élevés après un réchauffement rapide, comme le confirme la microscopie à fluorescence.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66801/66801fig01.jpg"> 
Figure 1 : Conception de l’étude. Des échantillons de corticale ovarienne de 50 patientes ont été examinés avant et après la vitrification et le réchauffement rapide pour déterminer le nombre de follicules viables. Pour chaque groupe, deux morceaux de tissu de 2 mm de diamètre ont été cultivés pendant 24 h avant l’évaluation de la numération folliculaire. Le tissu a été digéré avec de la collagénase et coloré avec de la calcéine pour évaluer la viabilité. Le nombre de follicules viables a été déterminé à l’aide d’un microscope. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66801/66801fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66801/66801fig02.jpg"> 
Figure 2 : Préparation des dispositifs de chargement. Des grilles métalliques ont été découpées à une taille de 8 mm x 25 mm (A). Les grilles métalliques personnalisées ont été stérilisées par autoclave (B). Les grilles métalliques stérilisées ont ensuite été insérées dans des bouchons de flacons de 1,8 mL, prêts à l’emploi (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66801/66801fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66801/66801fig03.jpg"> 
Figure 3 : Préparation des solutions de vitrification. Des solutions de vitrification (VS) ont été préparées et transférées sur une plaque à 6 puits. Les puits indiquent le volume de chaque solution et les temps d’incubation individuels utilisés dans le protocole de vitrification. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66801/66801fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66801/66801fig04.jpg"> 
Figure 4 : Traitement et vitrification du cortex ovarien. Le tissu du cortex ovarien a été traité pour la cryoconservation en retirant la moelle et en coupant le tissu en morceaux de 5 mm x 10 mm (A). Après l’incubation dans les solutions de vitrification illustrées à la figure 3, le tissu a été chargé sur le dispositif de charge de vitrification (B,C). Pour la vitrification verticale rapide d’échantillons de cortex ovarien, les capuchons contenant le tissu chargé ont été rapidement insérés dans de l’azote liquide stérilisé (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66801/66801fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66801/66801fig05.jpg"> 
Figure 5 : Préparation de solutions de réchauffement rapide. Une solution de réchauffement rapide (RWS), une solution d’équilibrage (ES) et des solutions de rinçage (RS) 1 et 2 ont été préparées et transférées sur une plaque à 6 puits. Les récipients et les puits indiquent le volume de chaque solution et les temps d’incubation correspondants. Notez que le RWS est maintenu à 37,2 °C sur une plaque chauffante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66801/66801fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66801/66801fig06.jpg"> 
Figure 6 : Nombre de viabilité. Pour évaluer le nombre de follicules viables, des morceaux de tissu de 2 mm de diamètre ont été digérés avec de la collagénase et colorés avec de la calcéine. Les images représentatives montrent (A) une coloration à la calcéine de 3 follicules récupérés avant la vitrification. (B) Un follicule viable récupéré après vitrification et réchauffement rapide. (C) Un follicule viable récupéré avant une congélation lente. (D) Follicules viables récupérés après congélation et décongélation lentes. La viabilité folliculaire est indiquée par la calcéine, un colorant fluorescent vert qui émet une fluorescence verte lorsqu’il est converti enzymatiquement par des cellules viables à 495 nm. Barre d’échelle = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66801/66801fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>VS 1 (15 ml)</td>
			<td>Éthylène glycol</td>
			<td>10%</td>
			<td>1,5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SSS</td>
			<td>10%</td>
			<td>1,5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>G-MOPS+</td>
			<td></td>
			<td>12 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VS 2 (15 ml)</td>
			<td>Éthylène glycol</td>
			<td>20%</td>
			<td>3 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SSS</td>
			<td>10%</td>
			<td>1,5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>G-MOPS+</td>
			<td></td>
			<td>10,5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VS 3 (15 ml)</td>
			<td>Éthylène glycol</td>
			<td>35%</td>
			<td>5,25 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SSS</td>
			<td>10%</td>
			<td>1,5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Saccharose</td>
			<td>0,5 mol/L</td>
			<td>2,57 grammes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>PVP</td>
			<td>5 % (p/v)</td>
			<td>0,75 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>G-MOPS+</td>
			<td></td>
			<td>ad 15 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 1 : Composition des solutions de vitrification (VS).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>RWS (30 ml)</td>
			<td>Saccharose</td>
			<td>0,8 mol/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>8,22 grammes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SSS</td>
			<td>10%</td>
			<td>3 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>G-MOPS+</td>
			<td></td>
			<td>ad 30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ES (15 ml)</td>
			<td>Saccharose</td>
			<td>0,4 mol/L</td>
			<td>2,05 grammes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SSS</td>
			<td>10%</td>
			<td>1,5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>G-MOPS+</td>
			<td></td>
			<td>ad 15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RS 1 et 2 (15 ml)</td>
			<td>SSS</td>
			<td>10%</td>
			<td>1,5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>G-MOPS+</td>
			<td></td>
			<td>ad 15 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 2 : Composition de la solution de réchauffement rapide (RWS), de la solution d’équilibrage (ES) et des solutions de rinçage (RS). Ce tableau fournit les composants et les concentrations de la solution de réchauffement rapide (RWS), de la solution d’équilibre (ES) et des solutions de rinçage (RS) utilisées dans le traitement de post-vitrification.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Paramètre</td>
			<td>Frais</td>
			<td>Intervalle</td>
			<td>Réchauffement rapide après vitrification</td>
			<td>Intervalle</td>
			<td>n</td>
			<td>*Valeur P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SD</td>
			<td></td>
			<td>SD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nombre de viabilité folliculaire [n]</td>
			<td>77.98</td>
			<td>0-386</td>
			<td>62.99</td>
			<td>0.5-349</td>
			<td>50</td>
			<td>0.130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>77.95</td>
			<td></td>
			<td>80.02</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*Test de Wilcoxon</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 3 : Résultats représentatifs de la viabilité folliculaire. Ce tableau présente les résultats des évaluations de la viabilité folliculaire avant la cryoconservation et après un réchauffement rapide. Deux morceaux de tissu de 2 mm de diamètre par patient ont été utilisés pour compter le nombre de follicules viables avant et après vitrification/réchauffement rapide. Des échantillons de tissus appariés provenant de 50 patients ont été analysés à l’aide du test de Wilcoxon.

Vitrification du tissu du cortex ovarien pour obtenir un état vitreux d’agrégation

Ovarian tissue cryopreservation (OTC) is an important option for fertility preservation. For patients whose gonadotoxic treatments cannot be postponed or ...

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