Name: Traitement systémique des souris adultes postnatales, juvéniles et avortées par injection dans le sinus rétrobulbaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 2 min 39 s
Description: Découvrez l'injection dans le sinus rétrobulbaire pour la thérapie génique chez les souris juvéniles. Cette méthode permet la livraison systémique d'AAV pour l'étude des acidémies organiques et le développement de traitements.

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Nous apprécions l’aide du personnel de l’installation de souris du NHGRI, du laboratoire de pathologie moléculaire du NCI et surtout d’Andrew Warner. R.J.C. est soutenu par le programme de recherche intra-muros du NHGRI par le biais de 1ZIAHG200318-16 et ce travail a été partiellement financé par le National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS). La figure 2C a été créée avec BioRender.

Ce protocole et la vidéo qui l’accompagne concernent l’espace d’injection rétrobulbaire des souris postnatales, juvéniles et adultes runées par injection dans le sinus rétrobulbaire ; le protocole a été approuvé par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (ACUC) de l’Institut national de recherche sur le génome humain sous le numéro de protocole G-03-4. D’autres établissements peuvent avoir des exigences et des restrictions différentes, et ce protocole peut devoir être modifié pour être approuvé par votre institut. Obtenez l’approbation de l’ACUC de votre établissement avant d’effectuer cette procédure ou toute autre procédure sur les animaux.
1. Préparation pré-injection
<ol><li>Diluer l’AAV au volume et à la concentration d’injection souhaités avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 mL pour chaque injection. Ajoutez un volume supplémentaire de 50 % pour chaque injection afin de permettre un remplissage précis de la seringue stérile à usage unique. REMARQUE : Ici, nous diluons un rapporteur AAV8-CAG-eGFP pour délivrer une dose de 1 × 1013génomes viraux par kg de masse corporelle (vg/kg) dans un volume de 50 μL. La quantité d’AAV dans les 50 μL à injecter est calculée à partir du poids de l’animal au moment de l’injection. Dans cette vidéo, l’AAV est injecté par la voie rétrobulbaire pour reproduire l’administration systémique chez l’homme. D’autres vecteurs de thérapie génique (c’est-à-dire lentivirus, adénovirus), des thérapies à ARN et de petites molécules peuvent être administrés par voie systémique à l’aide de cette procédure.</li>
	<li>Assurez-vous que le système d’anesthésie des animaux de laboratoire (LAAS) de table est correctement configuré et fonctionne correctement conformément aux instructions du fabricant. REMARQUE : Si une autre méthode d’anesthésie est utilisée, assurez-vous que l’anesthésie est préparée avant de commencer les injections. La procédure d’injection rétrobulbaire doit être compatible avec la plupart des anesthésies (par exemple, une contrainte chimique injectable comme la kétamine et la xylazine).</li>
	<li>Avant de remplir la seringue stérile à usage unique (ici, une seringue à insuline, 31 G, 8 mm de long, capacité de 3/10 ml), déplacez le piston de haut en bas plusieurs fois pour vous assurer qu’il peut être enfoncé en douceur. Ensuite, remplissez la seringue au volume souhaité, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de bulles d’air. REMARQUE : Des volumes allant jusqu’à 150 μL peuvent être injectés ; notre laboratoire injecte généralement un volume de 50 μL.</li>
</ol>2. Sédation chez la souris par l’administration de gaz isoflurane avec un système d’anesthésie animale de laboratoire (LAAS)
<ol><li>Assurez-vous que le gaz ne s’écoule que vers la chambre d’induction. Fermez le robinet d’arrêt bidirectionnel du circuit de non-réinspiration (NRB).</li>
	<li>Allumez le bouton vert du débit d’oxygène à l’avant du débitmètre de manière à ce qu’il y ait un débit de 1 L/min.</li>
	<li>Réglez l’isoflurane à ≤4 % en appuyant sur le levier situé en haut du vaporisateur et en tournant le cadran à la concentration souhaitée.</li>
	<li>Placez la souris dans la chambre d’induction transparente. Observez attentivement la respiration et les mouvements de l’animal. Une fois que l’animal est allongé, tournez le bouton du vaporisateur vers le bas à 2-2,5% d’isoflurane.</li>
	<li>Ouvrez le robinet d’arrêt bidirectionnel du circuit NRB fixé au masque facial et fermez le flux de gaz vers le boîtier d’induction.</li>
	<li>Retirez l’animal et placez-le dans le masque facial du circuit NRB.</li>
	<li>Baissez la concentration d’isoflurane à 1,5 % à 1,75 %, selon la réaction aux stimuli (p. ex., pincement des orteils ou pression de la patte).</li>
	<li>Surveillez toujours en permanence la respiration de la souris et la couleur de ses muqueuses (si possible). Si la respiration de l’animal devient laborieuse ou si la couleur de la muqueuse n’est pas rose, baissez la concentration de l’anesthésique.</li>
	<li>Gardez l’animal au chaud tout au long de la procédure. Utilisez un chauffe-mains enveloppé dans une serviette en papier qui est placée sous le sous-matelas et située directement sous la souris.</li>
	<li>Éteignez l’oxygène et le vaporisateur une fois la procédure terminée.</li>
</ol>3. Injection de l’animal
<ol><li>Si vous êtes droitier, injectez l’œil droit de la souris et positionnez la souris sur son côté gauche, le museau pointant vers la main droite. Si vous êtes gaucher, injectez l’œil gauche de la souris et positionnez la souris sur son côté droit, le museau pointant vers la main gauche.</li>
	<li>Appliquez une ou deux gouttes d’anesthésique ophtalmique sur le globe oculaire à injecter. Ensuite, retirez tout excès de solution anesthésique ophtalmique à l’aide d’un tampon de gaze absorbant stérile. Appliquez une légère pression du bout des doigts sur la peau dorsale et ventrale de l’œil pour faire ressortir partiellement le globe oculaire de la souris de l’orbite (Figure 2A,B). REMARQUE : Veillez à ne pas appliquer une pression excessive sur les vaisseaux cervicaux environnants lorsque vous faites saillie de l’œil, car cela entraverait la circulation sanguine et l’injection. De plus, l’application d’une pression sur la trachée pourrait empêcher la souris de respirer. Assurez-vous que la souris peut respirer tout au long de la procédure.</li>
	<li>Maintenez l’aiguille en position biseautée vers le bas à un angle d’environ 30° et placez-la dans le canthus médian (Figure 2C). REMARQUE : La profondeur de placement de l’aiguille pour atteindre le sinus rétrobulbaire variera en fonction de la taille de l’animal. Le fait d’avoir l’aiguille en position biseautée vers le bas pendant l’injection diminue le risque de lésions oculaires. Attention à ne pas placer l’aiguille trop profondément et à ne pas percer l’orbite. L’injection devrait prendre moins d’une minute.</li>
	<li>Appliquez lentement et doucement une pression sur le piston de la seringue pour administrer l’injectat. Cela réduira le risque d’extravasation.</li>
	<li>Retirez l’aiguille lentement et en douceur.</li>
	<li>Retirez le masque facial de la souris pour permettre la récupération de l’anesthésie.</li>
</ol>4. Après l’injection
<ol><li>Éteignez l’oxygène et le vaporisateur une fois la procédure terminée.</li>
	<li>Utilisez de la gaze stérile pour évacuer le sang en cas de saignement résiduel.</li>
	<li>Assurez-vous que la souris se trouve dans un endroit chaud (environ 37 °C), mais pas excessivement chaud, pour éviter l’hypothermie pendant la récupération de l’anesthésie.</li>
	<li>Observez la souris isolée jusqu’à ce qu’elle soit complètement rétablie avant de la remettre dans la cage et le support. REMARQUE : L’isolation de la souris pendant la récupération empêche les compagnons de cage de blesser la souris sous sédation pendant la récupération.</li>
</ol>

Administration systémique efficace chez la souris à l’aide de la technique d’injection rétrobulbaire

<ol><li>Perlman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+human+disease%3A+An+evolutionary+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Evol+Med+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Mouse models of human disease: An evolutionary perspective.</a> Evol Med Public Health. 2016 (1), 170-176 (2016).</li>
<li>Samelson-Jones, B. J., George, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+gene+therapy+for+hemophilia%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus gene therapy for hemophilia.</a> Annu Rev Med. 74, 231-247 (2023).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrobulbar+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Retrobulbar injections in mice.</a> Lab Anim (NY). 40 (5), 155-160 (2011).</li>
<li>Chandler, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+gene+therapy+for+methylmalonic+acidemia+using+the+novel+adeno-associated+viral+vector+44.9%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Systemic gene therapy for methylmalonic acidemia using the novel adeno-associated viral vector 44.9.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 61-72 (2022).</li>
<li>Chandler, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+aav9+gene+therapy+improves+the+lifespan+of+mice+with+niemann-pick+disease%2C+type+c1%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Systemic aav9 gene therapy improves the lifespan of mice with niemann-pick disease, type c1.</a> Hum Mol Genet. 26 (1), 52-64 (2017).</li>
<li>Venturoni, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+advantage+of+corrected+hepatocytes+in+a+juvenile+model+of+methylmalonic+acidemia+following+liver+directed+adeno-associated+viral+mediated+nuclease-free+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+Metab%22%5BJournal%5D)">Growth advantage of corrected hepatocytes in a juvenile model of methylmalonic acidemia following liver directed adeno-associated viral mediated nuclease-free genome editing.</a> Mol Genet Metab. 137 (1-2), 1-8 (2022).</li>
<li>Ilyinskii, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immtor+nanoparticles+enhance+aav+transgene+expression+after+initial+and+repeat+dosing+in+a+mouse+model+of+methylmalonic+acidemia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Immtor nanoparticles enhance aav transgene expression after initial and repeat dosing in a mouse model of methylmalonic acidemia.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 22, 279-292 (2021).</li>
<li>Davidson, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+systemic+aav+gene+therapy+with+a+neurotrophic+capsid+in+niemann-pick+disease+type+c1+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci+Alliance%22%5BJournal%5D)">Improved systemic aav gene therapy with a neurotrophic capsid in niemann-pick disease type c1 mice.</a> Life Sci Alliance. 4 (10), e202101040(2021).</li>
<li>Chandler, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+gene+therapy+using+an+aav44.9+vector+rescues+a+neonatal+lethal+mouse+model+of+propionic+acidemia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Systemic gene therapy using an aav44.9 vector rescues a neonatal lethal mouse model of propionic acidemia.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 30, 181-190 (2023).</li>
<li>Rocha-Ferreira, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neonatal+rodent+model+of+retroorbital+vein+injection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A neonatal rodent model of retroorbital vein injection.</a> J Vis Exp. (204), e65386(2024).</li>
<li>Bohnert, B. N., Artunc, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+nephrotic+syndrome+in+mice+by+retrobulbar+injection+of+doxorubicin+and+prevention+of+volume+retention+by+sustained+release+aprotinin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Induction of nephrotic syndrome in mice by retrobulbar injection of doxorubicin and prevention of volume retention by sustained release aprotinin.</a> J Vis Exp. (135), e57642(2018).</li>
<li>Bohnert, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrobulbar+sinus+injection+of+doxorubicin+is+more+efficient+than+lateral+tail+vein+injection+at+inducing+experimental+nephrotic+syndrome+in+mice%3A+A+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Retrobulbar sinus injection of doxorubicin is more efficient than lateral tail vein injection at inducing experimental nephrotic syndrome in mice: A pilot study.</a> Lab Anim. 53 (6), 564-576 (2019).</li>
<li>Meijer, M. K., Spruijt, B. M., Van Zutphen, L. F., Baumans, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+restraint+and+injection+methods+on+heart+rate+and+body+temperature+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Effect of restraint and injection methods on heart rate and body temperature in mice.</a> Lab Anim. 40 (4), 382-391 (2006).</li>
<li>Nohara, M., Tohei, A., Sato, T., Amao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+response+to+restraint+stress+by+salivary+corticosterone+levels+in+adult+male+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vet+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Evaluation of response to restraint stress by salivary corticosterone levels in adult male mice.</a> J Vet Med Sci. 78 (5), 775-780 (2016).</li>
<li>Schoch, A., Thorey, I. S., Engert, J., Winter, G., Emrich, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+lateral+tail+vein+and+the+retro-orbital+venous+sinus+routes+of+antibody+administration+in+pharmacokinetic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus routes of antibody administration in pharmacokinetic studies.</a> Lab Anim (NY). 43 (3), 95-99 (2014).</li>
<li>Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+lateral+tail+vein+and+the+retro-orbital+venous+sinus+as+routes+of+intravenous+drug+delivery+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model.</a> Lab Anim (NY). 37 (1), 26-32 (2008).</li>
<li>Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+aav+serotypes+1-9+mediated+gene+expression+and+tropism+in+mice+after+systemic+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Analysis of aav serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection.</a> Mol Ther. 16 (6), 1073-1080 (2008).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer en rapport avec cette publication.

Bien que l’injection rétrobulbaire soit une méthode fiable pour administrer de petites molécules, des protéines et des thérapies génomiques, la pratique de la technique avec un colorant est nécessaire pour garantir une administration systémique fiable et reproductible. L’utilisation d’un colorant est fortement recommandée pour pratiquer les injections rétrobulbaires chez la souris avant d’utiliser cette voie d’administration dans des expériences. Les colorants peuvent être vérifiés visuellement dans les tissus de souris pour assurer une administration systémique constante.
Dans notre démonstration de la technique d’injection rétrobulbaire, du gaz isoflurane a été utilisé pour anesthésier les souris avant la procédure. D’autres formes d’anesthésie peuvent être utilisées avant la procédure, mais il est important de s’assurer que la souris ne se remet pas de la sédation avant la fin de l’injection. Heureusement, l’injection proprement dite prend généralement moins d’une minute et le temps pendant lequel la souris doit être complètement anesthésiée est bref. La souris doit être complètement sous sédation pendant l’injection, et l’anesthésie doit être réadministrée si la souris devient consciente avant l’injection. Comme il existe des risques associés à l’utilisation de l’anesthésie, la durée de la sédation de la souris doit être minimisée. Nous n’avons pas eu de problèmes avec l’utilisation de l’isoflurane pour calmer les petites souris malades souffrant d’acidémie méthylmalonique et propionique. Cependant, certains modèles de souris peuvent être plus sensibles à la sédation et à certaines anesthésies. Ce problème potentiel doit être pris en compte avant d’essayer d’utiliser la sédation dans une étude. Enfin, l’utilisation de la sédation en combinaison avec l’injection rétrobulbaire réduit considérablement la détresse apparente de la souris pendant le processus d’injection par rapport à l’IVT où la sédation n’est pas couramment utilisée.
Nous n’avons observé aucun problème lié à la post-injection, bien que l’infection soit un risque potentiel avec n’importe quelle injection. Pour réduire le risque d’infection, une seringue stérile à usage unique et un PBS stérile pour diluer l’AAV purifié sont utilisés. Toutes les souris de notre animalerie sont vérifiées quotidiennement pour détecter des signes de problèmes de santé potentiels et reçoivent des soins vétérinaires pour résoudre tout problème de santé lorsque cela est justifié.
L’alternative à l’injection dans le sinus rétrobulbaire et la méthode d’administration systémique la plus largement utilisée chez les souris juvéniles et adultes est l’IVT. L’injection dans le sinus rétrobulbaire et l’injection dans le sinus rétrobulbaire entraînent une biodistribution similaire dans le cas des petites molécules et des anticorps, et par extrapolation, on s’attendrait à la même chose pour les vecteurs viraux15,16. Cependant, aucun exemple comparant l’administration systémique de vecteurs de thérapie génique par TVI et l’injection dans le sinus rétrobulbaire n’a pu être trouvé dans la littérature. À notre avis, les injections dans le sinus rétrobulbaire sont plus faciles à réaliser chez les souris présentant un phénotype de croissance diminué et/ou une létalité précoce.
L’IVT est souvent considérée comme plus analogue à l’accouchement systémique chez l’homme, bien que les humains aient un sinus rétrobulbaire mais n’aient pas de queue. D’un côté, l’injection dans le sinus rétrobulbaire est comme l’administration systémique humaine en ce sens que l’injectant pénètre dans le système veineux supérieur de la même manière que si un injectant était délivré à un humain par un cathéter central inséré par voie périphérique (CCIP) ou un cathéter intraveineux placé dans le bras. À l’inverse, l’injectant pénètre dans le système veineux inférieur d’une souris après l’injection dans la veine de la queue. Malheureusement, aucune de ces méthodes ne reproduit exactement la ou les méthodes utilisées pour l’administration systémique chez l’homme, mais les deux sont des méthodes efficaces d’administration systémique chez la souris.

Des modèles murins de maladies génétiques sont couramment utilisés pour démontrer l’efficacité des thérapies à petites molécules, génétiques et cellulaires1. Chez la souris, la méthode la plus largement utilisée pour reproduire l’administration systémique à l’homme est l’injection dans la veine de la queue (IVT), qui est généralement effectuée chez les souris adultes à l’âge de 6 à 8 semaines environ pour s’assurer que la veine est suffisamment grande pour y accéder. TVI a été utilisé avec succès dans de nombreuses études précliniques de preuve de principe de maladies génétiques, telles que l’hémophilie, qui ont soutenu des essais cliniques humains pour la thérapie génique2. Cependant, de nombreux modèles murins de maladie génétique présentent des phénotypes de croissance et/ou de létalité précoce, ce qui les empêche d’atteindre l’âge ou la taille d’une souris adulte (figure 1). Le traitement de ces souris via TVI peut être extrêmement difficile, voire impossible, en fonction de l’âge de létalité et/ou de la taille maximale que les animaux peuvent atteindre.
En revanche, l’administration systémique d’un agent thérapeutique par injection rétrobulbaire dans le sinus (souvent et à tort appelée rétro-orbitaire) peut être effectuée assez facilement chez les souris, quel que soit leur âge ou leur taille3. Les injections rétrobulbaires de virus adéno-associé (AAV) ont été utilisées avec succès dans des modèles murins jeunes de maladies génétiques présentant un retard de croissance, tels que l’acidémie méthylmalonique (MMA) et la maladie de Niemann-Pick de type C 4,5,6,7,8. (Cette procédure peut également être utilisée pour injecter les nouveau-nés3, 4, 9, 10 ; cependant, cette technique n’est pas détaillée dans ce protocole ou dans la vidéo qui l’accompagne.) Même les substances hautement toxiques comme la doxorubicine peuvent être administrées en toute sécurité par injection rétrobulbaire11,12. Contrairement à l’ITV, les souris sont anesthésiées lors des injections du sinus rétrobulbaire, ce qui rend la procédure moins stressante pour la souris et plus facile pour l’opérateur qui n’a pas à retenir physiquement la souris13,14. Une autre préoccupation est que TVI utilise fréquemment une lampe chauffante pour dilater la veine de la queue, ce qui pourrait potentiellement provoquer une déshydratation chez les jeunes souris et pourrait être problématique dans les modèles murins de maladie génétique qui sont plus suspects au stress lié à la chaleur. Un autre problème qui peut survenir lors de l’utilisation de TVI est que la veine de la queue peut être particulièrement difficile à visualiser sur les souris très pigmentées. Cependant, comme l’IVT, les injections dans le sinus rétrobulbaire entraînent une large biodistribution systémique15,16.

<table><tbody><tr><td>AAV8-CAG-eGFP</td><td>Univ. Penn. Vector Core Des</td><td></td><td>sources alternatives spéciales de rapporteurs AAV et des rapporteurs AAV alternatifs sont disponibles</td></tr><tr><td>Barrier (Filter) Tips, 20 &mu ; </td><td>ThermoFisher</td><td>AM12645</td> de taille L <td>pour diluer l’AAV afin de désirer le volume et la concentration d’injection</td></tr><tr><td>Embouts barrières (filtres), 100 &mu ; Taille L (stérile)</td><td>AM12648</td><td>ThermoFisher pour diluer l’AAV afin de désirer le volume et la concentration d’injection</td><td></td></tr> <tr><td>Circuit de production double&nbsp ;</td>La <td>méthode d’anesthésie alternative</td> <td>VetEquip</td><td>921400</td> peut être utilisée</tr><tr><td>Gilsen PIPETTEMAN Classic P20 Pipette</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td>pour diluer l’AAV afin de réduire le volume et la concentration de l’injection</td></tr><tr><td>Gilsen PIPETTEMAN Classic&nbsp ; Pipette P100</td><td>Gilson</td><td>F123615</td><td>pour diluer l’AAV afin de dissiper le volume et la concentration de l’injection</td></tr><tr><td>Chauffe-mains (HOTHANDS)</td><td>ULINE</td><td>S-1497B</td><td>pour garder la souris au chaud pendant l’anesthésie</td></tr><tr><td>Seringues à insuline, 31 G, 8 mm de longueur, capacité 3/10 mL</td><td>Becton Dickson</td><td>328438</td><td>utilisé en vidéo ; une seringue par injection</td></tr><tr><td>Isoflurane (Fluriso)</td><td>VETONE</td><td>502017</td><td>une anesthésie alternative peut être utilisée</td></tr><tr><td>Medline Protection Plus Coussinets jetables</td><td>ThermoFisher</td><td>23-666-062</td><td>pour placer la souris pendant l’injection</td></tr><tr><td>Oak Ridge Phlebotomie Conteneur pour objets tranchants avec couvercle transparent</td><td>ThermoFisher</td><td>22-730-434</td><td>pour l’élimination des aiguilles</td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate PBS, pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>Pour diluer l’AAV à la concentration et au volume souhaités</td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation à faible rétention Snap Cap (stériles)</td><td>ThermoFisher</td><td>3451</td><td>pour diluer l’AAV afin de dissiper le volume et la conentration d’injection</td></tr><tr><td>Éponge de gaze stérile 4"x"4</td><td>Covidien</td><td>3033</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de trépaine Ophtalmique (0,5 %)</td><td>Océnanside Pharmaceuticals</td><td>AK102D5DS</td><td>anesthésique local</td></tr><tr><td>Seringue à tuberculine avec un 27,0 g (ou moins)</td><td>N’importe lequel</td><td>N/A</td><td>alternative à la seringue à insuline utilisée en vidéo</td></tr><tr><td>VetEquip' s Guide de l’utilisateur et manuel d’utilisation pour le système d’anesthésie des animaux de laboratoire sur table et mobile.&nbsp ;</td><td>VetEquip</td><td>chrome-extension ://efaidnbmnnibpcajpcglclefindmkaj/https ://www.vetequip.com/pdfs/LAAS%20Manual.pdf</td><td>lien vers le guide d’utilisation et le manuel</td></tr></tbody></table>

traitement systémique des souris adultes postnatales, juvéniles et avortées par injection dans le sinus rétrobulbaire

Systemic Treatment for Postnatal, Juvenile, and Runted Adult Mice by Retrobulbar Sinus Injection

Alors que les injections dans la veine de la queue sont fréquemment utilisées comme voie d’administration systémique chez les souris adultes, les injections rétrobulbaires sont une méthode alternative pour l’administration systémique avec moins de limitations. Tout d’abord, les injections dans la veine de la queue (IVT) sont limitées aux souris adultes où la taille de la veine de la queue est adaptée à l’accès. Être limité au traitement des souris adultes peut être problématique lorsqu’il s’agit de modèles de souris qui ne survivent pas jusqu’à l’âge adulte. Deuxièmement, les TVI ne sont pas réalisables pour les modèles murins avec des phénotypes de retard de croissance où les souris n’atteignent jamais la taille des souris adultes de type sauvage. Par conséquent, les injections rétrobulbaires peuvent être utilisées avec succès pour traiter les souris adultes jeunes et petites. Enfin, les injections rétrobulbaires sont effectuées sous anesthésie, ce qui est moins stressant pour les souris que les TVI qui sont généralement effectuées sans anesthésie. Cet article présente un protocole et des instructions détaillées pour les injections rétrobulbaires qui peuvent être utilisées pour l’administration systémique aux souris petites et jeunes.

L’injection dans le sinus rétrobulbaire a été utilisée avec succès pour délivrer systématiquement de petites molécules, des anticorps et des virus adéno-associés (AAV)4,5,9,15,16. La figure 3 montre le foie d’une souris traitée par PBS (véhicule) et le foie d’une souris traitée par AAV8 à titre d’exemple d’injection et d’expression d’AAV après une injection rétrobulbaire. L’AAV8, comme de nombreux vecteurs AAV naturels, est trophique hépatique. Par conséquent, une transduction hépatique importante est attendue chez une souris ayant reçu une dose systémique de 5 × 1012vg/kg17. Le grand nombre d’hépatocytes exprimant l’ARN de la méthylmalonyl-CoA mutase (MMUT) observé sur la figure 3, qui est exprimé par le transgène AAV, indique une injection rétroorbitaire réussie.
<img alt="Comparaison entre l’acidémie propionique et la souris de type sauvage, différence de poids, 4 semaines, résultat de la recherche." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66809/66809fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figure 1 : Une souris souffrant d’un retard de croissance et d’acidémie propionique. C’est un exemple du retard de croissance extrême qui peut se produire dans les modèles murins de maladie génétique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66809/66809fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Procédé d’injection dans l’œil de souris ; Le schéma illustre la configuration de l’injection oculaire dans une expérience de laboratoire." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66809/66809fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figure 2 : Images et schéma de l’injection du sinus rétrobulbaire. (A) Image du placement du doigt sur la fourrure pour faire saillir le globe oculaire (indiqué par une flèche blanche). (B) Image d’une protrusion du globe oculaire (indiquée par une flèche blanche) après l’application d’une pression vers le bas sur la fourrure avant la mise en place et l’injection de l’aiguille. (C) Schéma de l’orientation du biseau de l’aiguille (biseau vers le bas par rapport au globe oculaire), de l’angle de l’aiguille (30°) et du placement de l’aiguille du sinus rétrobulbaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66809/66809fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Image microscope, analyse de la structure cellulaire ; immunohistochimie ; détection de l’expression des protéines." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66809/66809fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figure 3 : Hybridation in situ de l’ARN après injection d’AAV8 dans le sinus rétrobulbaire. Images de (A) 10 foies traités par véhicule, (B) 10 foies traités par AAV8, (C) 20 foies traités par véhicule et (D) 20 foies traités par AAV8 colorés pour l’ARN MMUT. À l’âge de 1 mois, des souris atteintes d’acidémie méthylmalonique ont reçu une dose de 5 × 10 à12 vg/kg d’AAV8-LPS-MMUT ou d’un témoin de véhicule (PBS). Le tissu hépatique a été prélevé 1 mois après le traitement. MMUT Coloration à l’ARN brune (les flèches noires indiquent les zones de coloration positive). Foie contre-coloré à l’hématoxyline. Barres d’échelle = 100 μm 10x pour les images, 50 μm pour les images 20x (B). Abréviations : AAV = virus adéno-associé ; LPS = Promoteur spécifique du foie ; MMUT = méthylmalonyl-CoA mutase. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66809/66809fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Cet article fournit un protocole et une vidéo d’accompagnement pour l’injection dans le sinus rétrobulbaire jusqu’à un volume total de 150 μL pour les souris postnatales, juvéniles et adultes. Cette procédure est particulièrement bien adaptée à l’injection de petites souris (15 g) lorsque l’injection dans la veine de la queue n’est pas réalisable.

Traitement systémique des souris adultes postnatales, juvéniles et avortées par injection dans le sinus rétrobulbaire

While tail vein injections are frequently used as a systemic route of delivery in adult mice, retrobulbar injections are an alternative method for ...

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Research

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JoVE Journal

Genetics

Génétique

Cette technique chirurgicale illustre l'injection de vecteurs de thérapie génique et les cellules souches dans l'espace sous-rétinien de l'oeil de la souris.

Injection sous-rétinien de vecteurs de thérapie génique et les cellules souches dans l&#39;œil de la souris

Ici, nous démontrons une technique de transduction neuronale généralisée par injection intraventriculaire d’un virus adéno-associé dans le cerveau de souris néonatale.  Cette méthode offre un moyen rapide et facile d’obtenir l’expression à vie des transgènes délivrés par le virus.

Injection virale intracérébro du cerveau de souris nouveau-né pour la transduction neuronale persistante et généralisée

Les modèles animaux de la maladie pédiatrique peuvent éprouver précoce et la progression de la maladie agressive. Cliniquement l'administration du traitement pertinent de jeunes modèles de souris peut être techniquement difficile. Ce protocole décrit une méthode d'injection intraveineuse non-invasive pour les souris nouveau-nés dans les deux premiers jours après la naissance de la vie.

Les injections intraveineuses de souriceaux nouveau-nés

Ici, nous décrivons une méthode simple d’injection intraventriculaire et intravasculaire de particules virales ou de microbilles fluorescentes dans le cerveau de souris néonatale. Le modèle de localisation du virus et des nanoparticules a pu être détecté par évaluation microscopique ou par hybridation in situ.

Intracérébroventriculaire et intravasculaire Injection de particules virales et fluorescentes microbilles dans le cerveau néonatal

Les injections sous-rétiniennes sont la technique la plus courante pour administrer de grands agents thérapeutiques tels que des protéines et des vecteurs viraux aux photorécepteurs et à l’épithélium pigmentaire rétinien. Une méthode alternative chez la souris qui cible avec succès l’espace sous-rétinien avec des dommages collatéraux minimaux et des temps de récupération rapides est décrite ici.

Une méthode alternative et Validé Injection pour l&#39;accès à l&#39;espace sous-rétinien<i&gt; via</i&gt; Une approche transclérale Postérieur

Nous décrivons ici l’induction de syndrome néphrotique expérimental chez la souris 129S1/SvImJ par injection rapide rétrooculaire de la doxorubicine. Nous traitons également néphrotiques souris avec des boulettes de libération prolongée contenant aprotinine pour inhiber l’activité de la protéase sérine urinaire et prévenir la rétention sodée.

Induction de Syndrome néphrotique chez la souris par Injection rétrooculaire de la doxorubicine et la prévention de la rétention de Volume par LIBERATION PROLONGEE aprotinine

Ce protocole démontre une nouvelle méthode d’application de thérapies géniques à des sous-populations de cellules chez des rats néonatals âgés de 5 à 10 jours après la naissance en injectant un modificateur chimiogénétique antérograde dans le cortex somatomoteur et une Cre recombinase rétrogradablement transportable dans la moelle épinière cervicale.

Cibler le tractus corticospinal chez les rats néonatals avec un vecteur double viral à l’aide d’une chirurgie combinée du cerveau et de la colonne vertébrale

Ce protocole vise à démontrer une voie d’administration veineuse reproductible qui peut être utilisée chez le rat et la souris tout au long de la période néonatale. Cette procédure est importante pour les études précliniques sur les rongeurs qui souhaitent refléter l’administration de médicaments dans les unités de soins néonatals, principalement par voie intraveineuse.

Un modèle d’injection veineuse rétroorbitaire chez un rongeur néonatal

Une intervention chirurgicale est décrite pour effectuer des injections dans la citerne lombaire du rat juvénile. Cette approche a été utilisée pour l’administration intrathécale de vecteurs de thérapie génique, mais on s’attend à ce qu’elle puisse être utilisée pour une variété de traitements, y compris les cellules et les médicaments.

Administration intrathécale de vecteurs chez des rats juvéniles par injection dans une citerne lombaire

Cette étude présente une méthodologie pour l’administration de produits thérapeutiques dans la rétine et les nerfs optiques du rat adulte. De plus, une méthode unique de prélèvement tissulaire est introduite pour une collecte descendante en bloc du nerf optique et de la rétine chez un rat adulte.

Administration thérapeutique oculaire et prélèvement tissulaire avancé chez le rat adulte

Découvrez l'injection dans le sinus rétrobulbaire pour la thérapie génique chez les souris juvéniles. Cette méthode permet la livraison systémique d'AAV pour l'étude des acidémies organiques et le développement de traitements.

Traitement systémique des souris adultes postnatales, juvéniles et avortées par injection dans le sinus rétrobulbaire

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