Production et microscopie imageuse à vie multiparamètre en fluorescence de cellules vivantes (FLIM) de sphéroïdes multicellulaires
August 9th, 2024
Ici, nous décrivons différentes méthodes de formation de sphéroïdes multicellulaires pour effectuer une microscopie multiparamètre de suivi sur cellules vivantes. À l’aide de la microscopie d’imagerie à vie de fluorescence (FLIM), de l’autofluorescence cellulaire, des colorants de coloration et des nanoparticules, l’approche d’analyse du métabolisme cellulaire, de l’hypoxie et de la mort cellulaire dans le cancer tridimensionnel vivant (3D) et les sphéroïdes dérivés de cellules souches est démontrée.
Dans ce travail, nous présentons et comparons les méthodes de formation de sphéroïdes qui peuvent être utilisées pour l’analyse du métabolisme cellulaire et de la distribution de l’oxygène à l’aide de la microscopie à cellules vivantes. Ces dernières années, la microscopie d’imagerie à durée de vie de fluorescence a été largement utilisée pour étudier les biomarqueurs métaboliques tels que le NADPH et le FAD dans les cellules vivantes, et plusieurs nanoparticules fluorescentes ont été développées pour multiplexer ces mesures avec l’imagerie de l’oxygénation des cellules et des tissus. Les sphéroïdes multicellulaires, les organoïdes et les organes sur puce peuvent reproduire un microenvironnement complexe, semblable à celui d’in vivo, minimisant ainsi le besoin de recherche sur les animaux.
Pour la production de sphéroïdes, nous montrons différentes méthodes de formation, pouvant aller d’un débit faible à élevé. Ils mettent également en évidence leur accessibilité optique, leur compatibilité avec les microscopes d’imagerie à durée de vie de fluorescence et la possibilité d’inclure des composants de matrice extracellulaire. Ainsi, même si les modèles 3D in vitro fournissent un meilleur contexte que les cultures 2D, leur grande variabilité, leur faible reproductibilité et leurs rapports expérimentaux incomplets restent un problème.
Des paramètres tels que la taille du sphéroïde, la composition en nutriments, la viscosité extracellulaire et même les méthodes de formation des sphéroïdes peuvent tous conduire à une hétérogénéité cellulaire accrue. Avec ce protocole, nous visons à harmoniser et à standardiser les méthodes de production de sphéroïdes, en mettant en évidence les aspects clés importants pour l’analyse continue de la vie et multiparamétrique des sphéroïdes à l’aide de la microscopie FLIM.
Aperçu
Cet article présente diverses méthodes pour former des sphéroïdes multicellulaires afin d'analyser le métabolisme cellulaire et la distribution d'oxygène à l'aide de la microscopie de cellules vivantes. L'étude souligne l'utilisation de la microscopie d'imagerie de temps de vie de fluorescence (FLIM) pour étudier les biomarqueurs métaboliques dans les cellules vivantes.
Composants clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neuroscience
- Biologie cellulaire
- Imagerie de cellules vivantes
Contexte
- Les sphéroïdes multicellulaires et les organoïdes reproduisent des microenvironnements similaires à ceux in vivo.
- La microscopie d'imagerie de temps de vie de fluorescence est utilisée pour étudier les biomarqueurs métaboliques.
- La grande variabilité et la faible reproductibilité sont des défis dans les modèles in vitro 3D.
- Différentes méthodes de formation de sphéroïdes peuvent être employées pour diverses applications.
Objectif de l'étude
- Comparaison des méthodes de formation de sphéroïdes pour la microscopie de cellules vivantes.
- Analyse du métabolisme cellulaire, de l'hypoxie et de la mort cellulaire dans des modèles 3D.
- Amélioration de la compréhension de la distribution d'oxygène dans les systèmes multicellulaires.
Méthodes utilisées
- Microscopie d'imagerie de temps de vie de fluorescence (FLIM)
- Analyse de l'autofluorescence cellulaire
- Utilisation de colorants de coloration et de nanoparticules fluorescentes
- Différentes techniques de formation de sphéroïdes
Principaux résultats
- Méthodes démontrées pour analyser le métabolisme cellulaire dans des sphéroïdes 3D.
- Compatibilité démontrée des sphéroïdes avec la FLIM pour les études métaboliques.
- Importance soulignée des composants de la matrice extracellulaire dans la formation des sphéroïdes.
- Problèmes abordés de reproductibilité et de variabilité des cultures 3D.
Conclusions
- Différentes méthodes de formation de sphéroïdes peuvent améliorer l'analyse des cellules vivantes.
- La FLIM fournit des informations précieuses sur les processus métaboliques dans les modèles 3D.
- Le développement continu de ces méthodes peut réduire la dépendance aux modèles animaux.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Standardized production and multi-parameter FLIM analysis of multicellular spheroids address critical challenges in modeling tumor microenvironments for drug discovery. Harmonizing spheroid formation and live-cell imaging workflows enhances predictive confidence in metabolic and hypoxia-related readouts, supporting robust early-stage decision-making. This approach strengthens translational continuity and reduces biological risk across oncology and stem cell R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of metabolic pathways and oxygen gradients in physiologically relevant 3D models.
- Supports functional target validation by quantifying NADPH and FAD biomarkers in live spheroids.
- Facilitates biological de-risking through multiplexed metabolic and hypoxia measurements.
- Improves predictive confidence for target engagement and pathway modulation in complex systems.
Screening & Assay Development
- Prepares reproducible 3D spheroid models compatible with widefield, confocal, and two-photon FLIM platforms.
- Standardizes assay conditions to reduce variability and enhance quantitative output reliability.
- Enables scalable, high-throughput screening of compound effects on cell metabolism and viability.
- Supports robust evaluation of bio- and nanosensor integration for multiplexed readouts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro metabolic and hypoxia profiles with disease-relevant tumor microenvironments.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by minimizing animal model reliance.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative, multiparametric data.
- Facilitates translational biomarker development using live-cell FLIM outputs.
Pipeline & Workflow Integration
This harmonized workflow integrates from early discovery through lead identification and preclinical validation, leveraging standardized spheroid production and FLIM analytics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in 3D, in vivo-like contexts.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative metabolic and hypoxia readouts for compound triage.
- Analytics: Provides multiplexed fluorescence lifetime measurements for robust condition comparison.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by recapitulating tumor microenvironment features.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse oncology and stem cell R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in 3D model systems.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of live-cell imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust, quantitative data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of candidates with validated biological relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D cell culture, live-cell microscopy, and FLIM analytics.
- Demands access to widefield, confocal, or two-photon FLIM instrumentation and compatible analysis software.
- Necessitates cross-team standardization of spheroid production and imaging protocols.
- May require adaptation for different cell types, extracellular matrices, or sensor integration.
- Variability in spheroid size and composition can impact reproducibility and data interpretation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:51
High‐Throughput Generation of Multicellular Spheroids from Human Cancer Cell Line for Live 3D Imaging
4:15
Assessing the Impact of Spheroid Formation Methods in 3D Cell Culture Systems Using Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)
