Production et microscopie imageuse à vie multiparamètre en fluorescence de cellules vivantes (FLIM) de sphéroïdes multicellulaires
9 août 2024
Ici, nous décrivons différentes méthodes de formation de sphéroïdes multicellulaires pour effectuer une microscopie multiparamètre de suivi sur cellules vivantes. À l’aide de la microscopie d’imagerie à vie de fluorescence (FLIM), de l’autofluorescence cellulaire, des colorants de coloration et des nanoparticules, l’approche d’analyse du métabolisme cellulaire, de l’hypoxie et de la mort cellulaire dans le cancer tridimensionnel vivant (3D) et les sphéroïdes dérivés de cellules souches est démontrée.
Dans ce travail, nous présentons et comparons les méthodes de formation de sphéroïdes qui peuvent être utilisées pour l’analyse du métabolisme cellulaire et de la distribution de l’oxygène à l’aide de la microscopie à cellules vivantes. Ces dernières années, la microscopie d’imagerie à durée de vie de fluorescence a été largement utilisée pour étudier les biomarqueurs métaboliques tels que le NADPH et le FAD dans les cellules vivantes, et plusieurs nanoparticules fluorescentes ont été développées pour multiplexer ces mesures avec l’imagerie de l’oxygénation des cellules et des tissus. Les sphéroïdes multicellulaires, les organoïdes et les organes sur puce peuvent reproduire un microenvironnement complexe, semblable à celui d’in vivo, minimisant ainsi le besoin de recherche sur les animaux.
Pour la production de sphéroïdes, nous montrons différentes méthodes de formation, pouvant aller d’un débit faible à élevé. Ils mettent également en évidence leur accessibilité optique, leur compatibilité avec les microscopes d’imagerie à durée de vie de fluorescence et la possibilité d’inclure des composants de matrice extracellulaire. Ainsi, même si les modèles 3D in vitro fournissent un meilleur contexte que les cultures 2D, leur grande variabilité, leur faible reproductibilité et leurs rapports expérimentaux incomplets restent un problème.
Des paramètres tels que la taille du sphéroïde, la composition en nutriments, la viscosité extracellulaire et même les méthodes de formation des sphéroïdes peuvent tous conduire à une hétérogénéité cellulaire accrue. Avec ce protocole, nous visons à harmoniser et à standardiser les méthodes de production de sphéroïdes, en mettant en évidence les aspects clés importants pour l’analyse continue de la vie et multiparamétrique des sphéroïdes à l’aide de la microscopie FLIM.
Aperçu
Cet article présente différentes méthodes de formation de sphéroïdes multicellulaires afin d'analyser le métabolisme cellulaire et la distribution d'oxygène à l'aide de la microscopie en cellules vivantes. L'étude met en évidence l'utilisation de la microscopie d'imagerie de durée de vie de fluorescence (FLIM) pour examiner des biomarqueurs métaboliques dans des cellules vivantes.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Imagerie de cellules vivantes
Contexte
- Les sphéroïdes multicellulaires et les organoïdes reproduisent des microenvironnements semblables à ceux observés in vivo.
- L’imagerie microscopique de la durée de vie de la fluorescence est utilisée pour étudier des biomarqueurs métaboliques.
- La forte variabilité et la faible reproductibilité constituent des défis dans les modèles in vitro en 3D.
- Diverses méthodes de formation des sphéroïdes peuvent être utilisées selon les applications.
Objectif de l'étude
- Comparer les méthodes de formation de sphéroïdes pour la microscopie de cellules vivantes.
- Analyser le métabolisme cellulaire, l'hypoxie et la mort cellulaire dans des modèles tridimensionnels.
- Améliorer la compréhension de la distribution de l'oxygène dans les systèmes multicellulaires.
Méthodes utilisées
- Microscopie d'imagerie de durée de vie de fluorescence (FLIM)
- Analyse de l'autofluorescence cellulaire
- Utilisation de colorants de marquage et de nanoparticules fluorescentes
- Différentes techniques de formation de sphéroïdes
Résultats principaux
- Méthodes démontrées pour analyser le métabolisme cellulaire dans des sphéroïdes en 3D.
- Montré la compatibilité des sphéroïdes avec la microscopie de fluorescence à durée de vie (FLIM) pour les études métaboliques.
- Mis en évidence l'importance des composants de la matrice extracellulaire dans la formation des sphéroïdes.
- Abordé les défis liés à la reproductibilité et à la variabilité des cultures en 3D.
Conclusions
- Différentes méthodes de formation de sphéroïdes peuvent améliorer l'analyse des cellules vivantes.
- La microscopie de durée de vie de fluorescence (FLIM) fournit des informations précieuses sur les processus métaboliques dans les modèles 3D.
- Le développement continu de ces méthodes pourrait réduire la dépendance aux modèles animaux.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les professionnels
La production standardisée et l'analyse multiparamétrique par microscopie de fluorescence à durée de vie (FLIM) des sphéroïdes multicellulaires répondent à des défis critiques dans la modélisation des microenvironnements tumoraux pour la découverte de médicaments. L'harmonisation de la formation des sphéroïdes et des protocoles d'imagerie en cellules vivantes améliore la fiabilité prédictive des mesures métaboliques et liées à l'hypoxie, soutenant ainsi une prise de décision solide en phase précoce. Cette approche renforce la continuité translationnelle et réduit les risques biologiques dans les portefeuilles de recherche et développement en oncologie et en biologie des cellules souches.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet l'interrogation des voies métaboliques et des gradients d'oxygène dans des modèles tridimensionnels pertinent sur le plan physiologique.
- Permet la validation fonctionnelle de cibles en quantifiant les biomarqueurs NADPH et FAD dans des sphéroïdes vivants.
- Facilite la détection biologique des risques grâce à des mesures multiplexées du métabolisme et de l'hypoxie.
- Améliore la confiance prédictive concernant l'interaction avec la cible et la modulation de la voie dans des systèmes complexes.
Développement de tests et criblage
- Prépare des modèles reproductibles en 3D sous forme de sphéroïdes, compatibles avec les plateformes de microscopie grand champ, confocale et de microscopie à fluorescence à durée de vie en deux photons (FLIM).
- Normalise les conditions de dosage afin de réduire la variabilité et d'améliorer la fiabilité des résultats quantitatifs.
- Permet un criblage évolutif et à haut débit des effets des composés sur le métabolisme cellulaire et la viabilité.
- Facilite une évaluation robuste de l'intégration de biocapteurs et de nanocapteurs pour des lectures multiplexées.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les profils métaboliques et d'hypoxie in vitro avec les microenvironnements tumoraux pertinents pour la maladie.
- Assure une continuité allant de la découverte à la validation préclinique en réduisant la dépendance aux modèles animaux.
- Permet des décisions d'avancement ajustées au risque, fondées sur des données quantitatives et multiparamétriques.
- Facilite le développement de biomarqueurs translationnels à l'aide de données FLIM en temps réel sur cellules vivantes.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette procédure harmonisée intègre l'ensemble du processus, de la découverte précoce à l'identification de composés candidats et à la validation préclinique, en exploitant une production standardisée de sphéroïdes et des analyses FLIM.
- Découverte en biologie : Permet la vérification d'hypothèses et la clarification des voies biologiques dans des contextes tridimensionnels proches de l'organisme vivant.
- Écrantage : Fournit des mesures quantitatives reproductibles du métabolisme et de l'hypoxie pour le tri de composés.
- Analytique : Offre des mesures multiplexées de durée de vie de fluorescence permettant des comparaisons fiables entre différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Relie les résultats in vitro aux modèles précliniques en recréant des caractéristiques du microenvironnement tumoral.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme réutilisable pour divers programmes de recherche et développement en oncologie et en biologie des cellules souches.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans les systèmes de modèles 3D.
- Valeur opérationnelle : Améliore la standardisation, la reproductibilité et l'évolutivité des flux de travail d'imagerie de cellules vivantes.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'avancement ou d'abandon et l'efficacité du capital en fournissant des données quantitatives solides.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation et un développement adaptés au risque des candidats grâce à une pertinence biologique validée.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture cellulaire en 3D, en microscopie de cellules vivantes et en analyses FLIM.
- Exige un accès à un équipement FLIM en champ large, confocal ou à deux photons, ainsi qu'à un logiciel d'analyse compatible.
- Implique une standardisation interéquipes des protocoles de production des sphéroïdes et d'imagerie.
- Peut nécessiter des adaptations selon les types cellulaires, les matrices extracellulaires ou l'intégration de capteurs.
- La variabilité de la taille et de la composition des sphéroïdes peut affecter la reproductibilité et l'interprétation des données.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
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Introduction
1:51
High‐Throughput Generation of Multicellular Spheroids from Human Cancer Cell Line for Live 3D Imaging
4:15
Assessing the Impact of Spheroid Formation Methods in 3D Cell Culture Systems Using Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)
