Name: Production et microscopie imageuse à vie multiparamètre en fluorescence de cellules vivantes (FLIM) de sphéroïdes multicellulaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-09T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Découvrez les méthodes de formation de sphéroïdes multicellulaires pour l'analyse du métabolisme cellulaire et de la distribution d'oxygène par microscopie FLIM en cellules vivantes. Ces techniques permettent d'étudier les biomarqueurs métaboliques dans des modèles 3D physiologiquement pertinents.

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Ce travail a été soutenu par les subventions du Fonds spécial de recherche (BOF) de l’Université de Gand (BOF/STA/202009/003 ; BOF/IOP/2022/058), la Fondation Flandre pour la Recherche (FWO, I001922N) et l’Union européenne, fliMAGIN3D-DN Horizon Europe-MSCA-DN n° 101073507.

Formation de sphéroïdes multicellulaires pour l’analyse métabolique et de l’hypoxie basée sur FLIM

Rien à divulguer.

Les sphéroïdes multicellulaires deviennent une méthode de choix dans l’étude des microenvironnements de niche des tumeurs et des cellules souches, la découverte de médicaments et le développement des « éléments constitutifs tissulaires » pour la biofabrication. L’architecture interne hétérogène des sphéroïdes, les gradients de nutriments et l’oxygénation peuvent imiter ceux des tissus et des tumeurs in vivo dans un cadre relativement simplifié et accessible. Avec la nécessité d’une plus grande transparence méthodologique26,28 et d’une normalisation71, ces protocoles devraient aider les chercheurs à choisir la meilleure méthode de formation de sphéroïdes pour les expériences de microscopie d’imagerie quantitative à durée de vie de fluorescence en direct. Les méthodes présentées tirent parti des capteurs de nanoparticules de coloration cellulaire et de l’autofluorescence cellulaire intrinsèque, qui peuvent être facilement combinées avec la coloration de la mort cellulaire.
Les étapes les plus critiques sont le protocole de formation des sphéroïdes ; Ainsi, pour la méthode à haut débit à base d’agarose, il est essentiel d’équilibrer suffisamment les moules d’agarose pour le milieu de culture. Un temps d’équilibre insuffisant entraînera la dilution des nutriments dans le PBS restant et apportera des facteurs supplémentaires d’hétérogénéité sphéroïde 21,26,72,73. Le moule à agarose fraîchement fabriqué doit également être vérifié visuellement pour la présence de bulles d’air, de micro-fissures et d’autres défauts.
Bien qu’efficace pour l’imagerie, la suspension de nanoparticules peut présenter une auto-agrégation et provoquer la formation de sphéroïdes de forme irrégulière dans les méthodes de formation à faible attachement. Cela peut souvent être atténué par l’ajout de sérum au milieu de culture ou par une pré-coloration de la culture cellulaire monocouche avant la formation de sphéroïdes. Fréquemment, lors de la compactisation des sphéroïdes, l’ajout d’une petite quantité de nanoparticules (par exemple, 10 % de la concentration initiale de coloration) peut également aider à colorer la zone de prolifération des sphéroïdes. Enfin, il est important d’utiliser des pointes de pipette stériles « sans poussière » pour toutes les méthodes de formation.
L’impact potentiel de l’éclairage sur la viabilité cellulaire doit toujours être pris en compte lors des expériences d’imagerie. Ainsi, il est important de connaître les facteurs de risque affectant négativement chaque expérience d’imagerie en direct. En général, les photodommages impliquent plusieurs mécanismes : (1) une forte élévation locale de la température, (2) un stress mécanique et (3) un stress photochimique (réaction oxydative et des radicaux libres)74. En fonction de la modalité d’imagerie (par exemple, imagerie confocale à un photon ou multiphotonique, modes d’éclairage continu ou pulsé, sensibilité des détecteurs et puissance de la source lumineuse à différentes longueurs d’onde si l’accord d’excitation est possible), de la cellule et du type de tissu (par exemple, accumulation de pigments absorbant efficacement la lumière ou d’autres molécules d’autofluorescence en fonction du type de tissu, organisation 3D ou 2D, la croissance et la composition du milieu d’imagerie), l’origine de la sonde fluorescente (par exemple, les propriétés photosensibilisantes) Différentes combinaisons de facteurs de risque peuvent provoquer une phototoxicité pendant l’imagerie. De plus, même si aucune augmentation de la mort cellulaire n’est observée après l’éclairage, les effets antérieurs à la mort dépendants de la puissance lumineuse sur les mitochondries et le métabolisme peuvent potentiellement interférer avec l’analyse et l’interprétation de l’expérience.
Pour exclure l’impact phototoxique sur les résultats expérimentaux, le chercheur doit effectuer une surveillance générale de la viabilité cellulaire et des changements dans la morphologie cellulaire par rapport au contrôle intact ou à l’aide de sondes de mort cellulaire pour estimer l’augmentation du taux de mort cellulaire après éclairage. Si les expériences métaboliques sont réalisées, l’optimisation des paramètres d’imagerie doit être effectuée en conséquence dans les expériences pilotes afin d’estimer et de minimiser l’impact de l’imagerie sur les paramètres métaboliques mesurés. Dans le cas des sondes sensibles à l’oxygène, le surdosage de lumière peut être facilement suivi par une augmentation soudaine de la durée de vie et de l’intensité de la phosphorescence du colorant sensible à l’O2 (modifications correspondantes du rapport d’intensité par rapport au colorant sensible à l’O2) en raison de l’effet dit de « consommation d’O2 photoinduite »53,75. Cela peut être facilement fait par l’analyse de la courbe cinétique d’expériences en accéléré avec différents paramètres de puissance lumineuse en utilisant, par exemple, le protocolepublié suivant 25. En « défense » de l’éclairage pulsé (par exemple, utilisé en microscopie TCSPC-F(P)LIM), les études récentes ont démontré son impact minime sur la production de ROS et le photoblanchiment de la sonde par rapport aux mesures d’éclairage en régime permanent 76,77, soulignant l’avantage supplémentaire de TCSPC-FLIM par rapport à l’approche conventionnelle d’imagerie basée sur l’intensité.
La principale limitation des méthodes de formation de sphéroïdes présentées réside dans les applications de surveillance directe et à long terme. Les moules à agarose nécessitent un objectif à longue distance de travail (ou un microscope vertical supplémentaire ou un stéréomicroscope à fluorescence) en raison de l’épaisse couche d’agarose et le matériau de la Spheriplate 5D peut interférer avec les mesures dans les canaux fluorescents rouges (sonde O2 ). La taille des sphéroïdes produits par les méthodes à haut débit est limitée par le diamètre des micropuits et nécessite un échange fréquent de milieux pour éviter l’épuisement et l’acidification des milieux. Avec toutes ces limitations, nous recommandons les boîtes de Pétri 3D (MicroTissue) pour les expériences nécessitant un débit élevé (par exemple, pour les applications de bio-impression 3D) et les méthodes à faible attachement pour les études de base à « débit moyen », nécessitant également un nombre de cellules plus faible.
La surveillance ratiométrique de l’oxygénation et les expériences conventionnelles de microscopie à fluorescence de cellules vivantes sont abordables sur les microscopes inversés largement disponibles s’ils sont équipés d’une caméra sensible au proche infrarouge (NIR), d’une excitation basée sur des diodes électroluminescentes (LED) et d’un objectif25 approprié. Pour un sectionnement optique et un FLIM plus appropriés, il est recommandé d’utiliser des systèmes de microscope confocal commerciaux disponibles dans le commerce (tels que décrits ici). Bien que nous décrivions également une méthode de détection de l’autofluorescence NAD(P)H, nécessitant un microscope FLIM à deux photons plus coûteux, il existe de nombreuses approches différentes, compatibles et utiles pour les systèmes FLIM confocaux, équipés idéalement d’un laser à lumière blanche et de détecteurs hybrides ou SPAD. Il s’agit notamment de l’évaluation du métabolisme cellulaire, des protéines des biocapteurs FRET-FLIM, de l’imagerie de la mécanique cellulaire et tissulaire, de l’autofluorescence de types de cellules et de tissus spécifiques et des interactions récepteur-médicament visualisées via FLIM-FRET31.
Le logiciel d’acquisition et d’analyse FLIM fourni par le fournisseur peut nuire au succès de l’expérience, car il n’est pas toujours possible d’exporter l’IRF ou les images dans un format compatible avec l’analyse open source en aval. Le post-traitement est une partie importante du flux de travail de l’analyse FLIM, et il n’est pas encore universellement normalisé ou accepté. L’ajustement de la courbe nécessite un nombre plus élevé de photons et une puissance de calcul plus importante par rapport à l’approche du phaseur. FLIMfit45 (ajustement global et pixel par pixel) et Flimview78 font partie des logiciels ouverts utilisés pour l’analyse de l’ajustement des courbes, tandis que PAM79, FLUTE64 et AlliGator80 sont utilisés pour l’analyse des phaseurs. FLIMJ46 est un plugin ImageJ utile qui fonctionne avec les deux approches. Dans l’ensemble, ces options contribuent à améliorer la routine de post-traitement et à la rendre plus rapide, plus polyvalente et plus conviviale.

Les sphéroïdes multicellulaires représentent un groupe de modèles tissulaires 3D obtenus par l’auto-agrégation de cellules et présentant une forme sphérique. Ils sont largement utilisés pour imiter l’interaction cellule-cellule et cellule-matrice in vitro et pour reproduire un contexte 3D dans une multitude de constructions dérivées du cancer et des cellules souches. Plusieurs techniques sont employées pour réduire l’attachement cellulaire et favoriser l’agrégation. Il s’agit notamment de la méthode de la suspension et de la chute reposant sur la tension superficielle1 ; méthodes de repoussée de fixation des cellules telles que les plaques de fixation ultra-faibles, les micro-moules et les micropuits 2,3 ; approche basée sur les ondes acoustiques4 ; méthodes d’agrégation induites par l’écoulement (fioles tournantes, bioréacteur et dispositifs microfluidiques)5 ; formation assistée par particules magnétiques6 et utilisation des matrices et échafaudages synthétiques et ECM favorisant l’agrégation 7,8,9.
Dans la recherche sur le cancer, le développement et la validation de nouvelles thérapies médicamenteuses, les sphéroïdes sont un modèle attrayant en raison de leur capacité à récapituler les gradients limités par la diffusion spatiale des nutriments, des déchets et de l’O2, conduisant souvent à la formation d’un noyau nécrotique, typique des tumeurs solides10,11. Ces modèles in vitro plus fiables et plus sophistiqués remettent en question la nécessité d’une utilisation intensive de modèles animaux (Food and Drug Administration [FDA] Modernization Act 2.012), conformément au principe des 3R de la recherche animale (remplacement, réduction et raffinement). En plus du cancer, les sphéroïdes trouvent leur application dans la recherche sur les cellules souches. Par exemple, les cellules souches pluripotentes ont la capacité de former des corps embryoïdes (EB), qui peuvent être utilisés pour la différenciation des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) vers des types de cellules spécialisés difficiles à obtenir directement des patients, tels que les cellules précurseurs neurales13 ou les cellules de la granulosa ovarienne 13,14. De plus, la formation d’une EB est souvent la première étape dans le développement de modèles organoïdes plus complexes, par exemple, neural15, rétinien16, cardiaque17, foie18, estomac19 et organoïdes intestinaux20. Des facteurs tels que la taille, la reproductibilité, le débit et les applications en aval doivent être pris en compte lors du choix d’une méthode de formation de sphéroïdes appropriée pour les expériences.
La complexité accrue de la culture 3D peut entraîner une plus grande variabilité par rapport à la culture 2D. Des facteurs tels que la composition nutritionnelle21, l’évaporation du milieu22, la viscosité23, le contrôle du pH24, la méthode de formation des sphéroïdes et même le temps passé dans la culture25,26 peuvent entraîner l’obtention de sphéroïdes de morphologie, de taille, de viabilité et de chimiorésistance différentes27,28. Des recherches récentes ont démontré que les gradients d’oxygène sphéroïdes ne sont pas toujours statiques et sont affectés par la méthode de formation, la taille du sphéroïde et la viscosité extracellulaire, affectant l’hétérogénéité des sphéroïdes29. Pour améliorer la reproductibilité et l’accessibilité des données sur les sphéroïdes, la base de connaissances MISpheroID a été développée26, identifiant la lignée cellulaire, le milieu de culture, la méthode de formation et la taille des sphéroïdes comme les informations minimales pour un résultat reproductible. Par conséquent, une comparaison détaillée a été effectuée de plusieurs méthodes à haut débit (SphericalPlate 5D, micromoules fabriqués en laboratoire et moules à microtissus) et à faible fixation (c’est-à-dire des plaques à 96 puits recouvertes de Biofloat et de Lipidure, à la fois sans échafaudage et à base d’échafaudage) (figure 1 et tableau 1), y compris la taille du puits (compte tenu d’une estimation de la taille maximale des sphéroïdes), les consommables utilisés, le temps de préparation et la possibilité de surveiller les sphéroïdes sans les transporter vers des boîtes de microscopie. Ce dernier permet des études à long terme, tandis que les sphéroïdes produits avec des méthodes à haut débit aboutissent souvent à des expériences finales. Toutes les méthodes, à l’exception des grilles de la 5DspheriPlate, n’apportent pas d’autofluorescence indésirable, ce qui permet leur utilisation directe en microscopie.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66845/66845fig01.jpg"> Figure 1 : Explication des méthodes de formation des sphéroïdes. Des méthodes à haut débit telles que la SphericalPlate 5D, qui a intégré des micropuits brevetés dans la plaque, tandis que les micromoules produits en laboratoire et les moules MicroTissue utilisent des tampons pour fabriquer plusieurs micropuits en agarose (bleu). Les plaques à faible fixation telles que Lipidure (Amsbio) et Biofloat (Sarstedt) utilisent un revêtement non adhérent inhibant l’adhésion à la surface cellulaire et favorisant l’auto-agrégation cellulaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66845/66845fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>5D SpheriPlate</td>
			<td>Micromoules auto-produits</td>
			<td>Microtissus</td>
			<td>Méthodes de fixation faibles</td>
		</tr><tr><td>Nombre de sphéroïdes/puits</td>
			<td>750</td>
			<td>1589</td>
			<td>81</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>Diamètre puits</td>
			<td>90 μm</td>
			<td>400 μm</td>
			<td>800 μm</td>
			<td>1 millimètre</td>
		</tr><tr><td>Volume de culture</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>200 μL</td>
		</tr><tr><td>Autres consommables</td>
			<td>/</td>
			<td>7 mL d’agarose à 3 %</td>
			<td>500 μL d’agarose à 2 %</td>
			<td>/ *</td>
		</tr><tr><td>Temps de préparation</td>
			<td>Durée : 10 minutes</td>
			<td>2 h + 3 jours d’adaptation des médias</td>
			<td>0,5 h + 15 min d’adaptation du support</td>
			<td>10 à 30 min + 1 h de séchage</td>
		</tr><tr><td>Surveillance</td>
			<td>Oui</td>
			<td>Non**</td>
			<td>Oui</td>
			<td>Oui</td>
		</tr><tr><td>Autofluorescent</td>
			<td>Oui</td>
			<td>Non</td>
			<td>Non</td>
			<td>Non</td>
		</tr><tr><td>Réutilisable</td>
			<td>Non</td>
			<td>Oui</td>
			<td>Oui</td>
			<td>Non**</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Coût</td>
			<td rowspan="2">€€</td>
			<td rowspan="2">€</td>
			<td rowspan="2">€€€€</td>
			<td>€€€€ : Enrobage et Matrigel</td>
		</tr><tr><td>€€ : Plaque commerciale 96 puits</td>
		</tr><tr><td colspan="3">*Certaines lignées cellulaires nécessitent l’ajout d’ECM (c’est-à-dire 2 à 5 % de Matrigel) pour former des sphéroïdes compacts.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="5">**Le revêtement est réutilisable jusqu’à ce qu’il soit épuisé. Cependant, chaque plaque consommera une petite quantité de média et la poussière peut s’accumuler au fil du temps. Une stérilisation par filtre est régulièrement nécessaire.</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Comparaison de plusieurs méthodes de formation de sphéroïdes29. « Monitoring » : la possibilité de surveiller les sphéroïdes sans avoir besoin de les transférer dans une boîte de microscopie. € : 0-50€, €€ : 50-150€ , €€€ : 150-500€ , €€€€ : &gt;500€
La microscopie à fluorescence permet de surveiller directement les principaux aspects biologiques des sphéroïdes, notamment la mort cellulaire, la viabilité, la prolifération, le métabolisme, la viscosité et même les propriétés mécaniques30. La microscopie imageuse à durée de vie de fluorescence (FLIM) apporte une dimension quantitative supplémentaire pour l’étude des interactions des sondes fluorescentes au sein de leur (micro)environnement 31,32,33,34, permettant de résoudre les spectres d’émission qui se chevauchent en fonction de différentes durées d’émission 35,36 et sonder le métabolisme cellulaire basé sur l’autofluorescence cellulaire intrinsèque. Ainsi, des composés cellulaires autofluorescents aussi répandus que le nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NAD(P)H), la flavine mononucléotide (FMN), la flavine adénine dinucléotide (FAD), la protoporphyrine IX et d’autres peuvent être mesurés avec un FLIM à un ou deux photons et servent de « capteurs » intrinsèques du catabolisme du glucose, de la phosphorylation oxydative (OxPhos) et fournissent un aperçu général de l’état redox cellulaire. Le NAD(P)H existe sous forme cytoplasmique libre ou sous forme mitochondriale liée aux protéines37,38. De même, l’état oxydé du FAD est fluorescent avec une durée de vie plus longue de la forme libre. Les microscopies NAD(P)H et FAD impliquent généralement une FLIM excitée par deux photons, visant à prévenir les photodommages de l’échantillon39. Souvent, l’imagerie métabolique optique FLIM peut être combinée à l’utilisation de sondes à base de colorants, de biocapteurs génétiquement codés, de microscopie d’imagerie à durée de vie de phosphorescence (PLIM) et de mesures basées sur l’intensité ratiométrique afin de fournir une image plus complète du métabolisme, de l’oxygénation, de la prolifération et de la viabilité cellulairedes sphéroïdes ou des organoïdes 29,30,31 . De plus, FLIM peut également être combiné avec la méthode de transfert d’énergie par résonance de Förster (FRET) pour mesurer la variation de la durée de vie du fluorophore donneur lorsqu’il est en contact étroit avec l’accepteur afin d’étudier la liaison d’un médicament avec son domaine cible 33,40,41.
Les images FLIM acquises sont généralement analysées pour calculer la durée de vie pixel par pixel. À l’heure actuelle, il existe au moins 3 stratégies courantes utilisées pour obtenir la durée de vie de la fluorescence : le « FLIM rapide » semi-quantitatif 42 (parfois appelé « sens tau »43,44), l’ajustement de la courbe de décroissance, en utilisant un ajustement à une, deux ou trois exponentielles, et l’approche « sans ajustement » avec transformation de phase et analyse du tracé de phase. Selon le fournisseur, des logiciels fournis (LAS X, Symphotime, SPCImage, etc.) ou open source (par exemple, FLIMfit45, FLIMJ46 ou autres47) peuvent être utilisés pour traiter les données FLIM mesurées. En règle générale, les logiciels fournis par le fournisseur sont utiles pour l’analyse préliminaire des données, tandis que les solutions open source peuvent fournir des études plus précises en utilisant, par exemple, des diagrammes de phaseur et la visualisation 3D.
Malgré l’utilité et l’attrait de FLIM en tant que méthode d’étude des sphéroïdes, très peu de protocoles expérimentaux sont disponibles, et il y a un manque général de connaissances dans le choix de la méthode de formation la plus appropriée pour des expériences de microscopie multiparamétrique en direct réussies impliquant FLIM. Ici, une comparaison détaillée des protocoles de formation de sphéroïdes couramment utilisés est présentée en fonction de leur morphologie, de leur viabilité et de leur oxygénation avec le nanocapteur de détection d’oxygène rouge lointain et proche infrarouge (NIR) (MMIR1) récemment validé et caractérisé. La nanoparticule cationique est imprégnée de deux colorants rapporteurs, l’aza-BODIPY de référence insensible à l’O2 (excitation 650 nm, émission 675 nm) et la métallporphyrine sensible à l’O2 NIR, PtTPTBPF (excitation 620 nm, émission 760 nm). Le MMIR1 permet l’analyse en temps réel des gradients d’oxygène sur un microscope à fluorescence conventionnel (à l’aide de l’analyse ratiométrique) ou un microscope à durée de vie de phosphorescence (PLIM) sans introduire de toxicité cellulaire et permettant des signaux stables, une surveillance à long terme et un multiplexage25,29. En fonction de la nécessité de colorer avec des colorants ou des nanocapteurs, du débit de sphéroïdes ou du type de cellule, le protocole de formation le plus approprié peut être choisi. Étant donné que les études de viabilité et d’oxygénation des sphéroïdes sont pertinentes pour les études de cancer et de sphéroïdes dérivés de cellules souches, les protocoles présentés incluent également des exemples et des résultats typiques attendus du NAD(P)H-FLIM et du FAD-FLIM avec ces modèles. Les pipelines d’imagerie et d’analyse présentés ciblent les plateformes de microscopie FLIM basées sur le comptage de photons uniques corrélées dans le temps les plus populaires.

<table><tbody><tr><td>0,05 % Trypsine-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>Également disponible chez Sigma</td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques de 10 ml</td><td>VWR</td><td>612-3700</td><td>Des produits similaires sont également disponibles chez Sarstedt, Corning, VWR et d’autres sociétés</td></tr><tr><td>Plaques de culture cellulaire à 12 puits, stériles</td><td>Greiner bio-one</td><td>665-180</td><td>Des produits similaires sont également disponibles auprès de Sarstedt, Corning et d’autres sociétés.</td></tr><tr><td>Lame de chambre 12 puits, amovible</td><td>Ibidi</td><td>81201</td><td>Également disponible chez Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific et autres</td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger de 15 mL</td><td>Nerbe plus 02-502-3001</td><td></td><td>Des produits similaires sont également disponibles chez Sarstedt, Corning, VWR et d’autres sociétés</td></tr><tr><td>Micromoules de boîte de Pétri 3D Microtissue</td><td></td><td>Z764000-6EA</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture cellulaire 6 puits,</td><td>Greiner stérile bio-one</td><td>657160</td><td>Des produits similaires sont également disponibles chez Sarstedt, Corning, VWR et d’autres sociétés</td></tr><tr><td>70 %</td><td>éthanol ChemLab</td><td>CL02.0537.5000</td><td></td></tr><tr><td>Biofloat</td><td>Sarstedt</td><td>83.3925.400</td><td>Plaque revêtue à 96 puits disponible dans le commerce pour la formation de sphéroïdes</td></tr><tr><td>Calcein Green-AM</td><td>Tebubio</td><td>AS-89201</td><td>Appliquer en dilution 1:1000</td></tr><tr><td>Logiciel CellSens Dimension</td><td>Olympus</td><td>version 3</td><td></td></tr><tr><td>Collagène du placenta humain, type IV</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td>Pour la préparation de boîtes de microscopie à 0,07 mg/mL de collagène et de 0,03 mg/mL de poly-D-lysine</td></tr><tr><td>Microscope confocal FLIM Leica</td><td>Microsystems</td><td>N/A</td><td>Stellaris 8 Microscope inversé avec laser à lumière blanche, détecteurs HyD X, chambre de contrôle du climat / T (OkoLab), objectif 25x/0,95 W</td></tr><tr><td>D(+)-Glucose</td><td>Merck</td><td>8342</td><td>Préparer une solution mère de 1 M, 1:100 pour la préparation du milieu d’imagerie (concentration finale 10 mM)</td></tr><tr><td>Milieu d’Eagle modifié de Dulbecco (DMEM), sans rouge de phénol, sans glucose, sans pyruvate et sans glutamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5030-10X1L</td><td>Pour la préparation du milieu d’imagerie</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal&nbsp ;( FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-098</td><td>Également disponible chez Sigma. Doit être inactivé par la chaleur avant utilisation.</td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>Dilution 1/100 pour la préparation du milieu d’imagerie (concentration finale 10 mM)</td></tr><tr><td>Cellules cancéreuses du côlon humain HCT116</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>version 1.54f</td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite X (LAS X)</td><td>Leica Microsystems</td><td>version 4.6.1.27508</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td>Également disponible chez Sigma. Appliquer en dilution 1:100.</td></tr><tr><td>Lipidure-CM5206</td><td>Amsbio</td><td>AMS.52000034GB1G</td><td></td></tr><tr><td>McCoy’s 5A, besoin d’ajouter 1 mM de pyruvate de sodium et 10 mM HEPES</td><td>VWR</td><td>392-0420</td><td>Milieu de croissance standard pour cellules HCT116</td></tr><tr><td>tampons PDMS imprimés en 3D à micro-motifs</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>Fourni par le Centre de technologie des microsystèmes, Professeur Dr. Jan Vanfleteren, Université de Gand</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Chemlab</td><td>CL00.1429.100</td><td></td></tr><tr><td>Chambre de distribution Neubauer</td><td>Fisher Scientific</td><td>15980396</td><td></td></tr><tr><td>Sondes O2 : MMIR1</td><td>N/A</td><td>N/A N/A</td> La <td>caractérisation complète, la validation et certaines applications peuvent être trouvées à l’adresse suivante : https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.12.11.571110 v1</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher scientific</td><td>Gibco18912014</td><td>Dissoudre le comprimé de PBS dans 500 mL d’eau distillée.</td></tr><tr><td>Streptocoque du stylo :P énicilline (10 000 U/mL) / streptomycine (10 000 &mu ; g/mL) 100x solution</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Également disponible chez Sigma. Appliquer en dilution 1:100.</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma</td><td>P6407-5mg</td><td>Pour la préparation de 0,07 mg/mL de collagène et de 0,03 mg/mL de boîtes de microscopie enrobées de poly-D-lysine</td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25535-16-4</td><td>Coloration de la mort cellulaire, utiliser 1 &micro ; g/mL à 1h d’incubation</td></tr><tr><td>PVDF filtre seringue 0,22 & micro ; m</td><td>Novolab</td><td>A35149</td><td>Des produits similaires sont également disponibles auprès de Sarstedt, Corning, VWR et d’autres sociétés</td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>Dilution 1/100 pour la préparation du milieu d’imagerie (concentration finale 1mM)</td></tr><tr><td>SphériquePlaque 5D 24 puits</td><td>Kugelmeiers</td><td>SP5D-24W</td><td></td></tr><tr><td>pétridure stérile</td><td>Greiner bio-one</td><td>633181</td><td>Des produits similaires sont également disponibles auprès de Sarstedt, Corning, VWR et d’autres sociétés</td></tr>. <tr><td>Flacon de culture tissulaire (25 cm&sup2 ; )</td><td>VWR</td><td>734-2311</td><td>Des produits similaires sont également disponibles chez Sarstedt, Corning, VWR et d’autres sociétés</td></tr><tr><td>Flacon de culture tissulaire (75 cm&sup2 ;)</td><td>VWR</td><td>734-2313</td><td>Des produits similaires sont également disponibles chez Sarstedt, Corning, VWR et d’autres sociétés</td></tr><tr><td>Plaque à fond en U à 96 puits</td><td>VWR</td><td>10062-900</td><td>Des produits similaires sont également disponibles chez Sarstedt, Corning, Greiner Bio-one et d’autres sociétés</td></tr><tr><td>Ultrapure Agarose</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td><td>16500-500</td><td>D’autres types d’agarose tels que l’agarose à bas point de fusion (A-9414, Sigma), l’agarose à usage courant (A-9539, Sigma)</td></tr><tr><td>Le microscope inversé à fluorescence à grand champ</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td>Microscope à fluorescence inversée IX81, avec contrôle motorisé de l’axe Z, CoolLED pE4000 (16 canaux, 365-770 nm), la caméra cMOS ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu), la plaque chauffante en verre Okolab, le logiciel CellSens Dimension v.3 et les objectifs aériens 4x/0.13 UPlanFLN et 40x/0.6 LUCPlanFLN. (En option, pour l’imagerie haute résolution) 60x/1.0 LUMPLFLN eau</td></tr></tbody></table>

production et microscopie imageuse à vie multiparamètre en fluorescence de cellules vivantes (flim) de sphéroïdes multicellulaires

Production and Multi-Parameter Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) of Multicellular Spheroids

Les sphéroïdes tumoraux multicellulaires sont un modèle 3D populaire de microagrégats tissulaires pour reproduire le microenvironnement tumoral, tester et optimiser les thérapies médicamenteuses et utiliser des biocapteurs et des nanocapteurs dans un contexte 3D. Leur facilité de production, leur taille prévisible, leur croissance et les gradients de nutriments et de métabolites observés sont importants pour récapituler le microenvironnement cellulaire de type niche 3D. Cependant, l’hétérogénéité des sphéroïdes et la variabilité de leurs méthodes de production peuvent influencer le métabolisme cellulaire global, la viabilité et la réponse aux médicaments. Il est donc difficile de choisir la méthodologie la plus appropriée, compte tenu des exigences en termes de taille, de variabilité, de besoins de biofabrication et d’utilisation comme modèles tissulaires 3D in vitro en biologie des cellules souches et cancéreuses. En particulier, la production de sphéroïdes peut influencer leur compatibilité avec les microscopies quantitatives en direct, telles que l’imagerie métabolique optique, la microscopie d’imagerie à vie de fluorescence (FLIM), la surveillance de l’hypoxie sphéroïde avec des nanocapteurs ou la viabilité. Ici, un certain nombre de protocoles conventionnels de formation de sphéroïdes sont présentés, mettant en évidence leur compatibilité avec la microscopie à grand champ en direct, confocale et à deux photons. Le pipeline d’imagerie de suivi à l’analyse avec l’autofluorescence multiplexée FLIM et, en utilisant divers types de cancer et de sphéroïdes de cellules souches, est également présenté.

Ici, nous décrivons différentes méthodes de formation de sphéroïdes multicellulaires pour effectuer une microscopie multiparamètre de suivi sur cellules vivantes. À l’aide de la microscopie d’imagerie à vie de fluorescence (FLIM), de l’autofluorescence cellulaire, des colorants de coloration et des nanoparticules, l’approche d’analyse du métabolisme cellulaire, de l’hypoxie et de la mort cellulaire dans le cancer tridimensionnel vivant (3D) et les sphéroïdes dérivés de cellules souches est démontrée.

Production et microscopie imageuse à vie multiparamètre en fluorescence de cellules vivantes (FLIM) de sphéroïdes multicellulaires

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug ...

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Imagerie de vie de fluorescence (FLIM) a émergé comme une technique essentielle pour l'image de l'environnement et l'interaction des protéines spécifiques et des colorants dans les cellules vivantes. FLIM des rotors moléculaires fluorescents permet de cartographier de la viscosité dans les cellules vivantes.

Imagerie de vie de fluorescence des rotors moléculaires dans les cellules vivantes

Présenté ici est un protocole pour la fabrication d’un dispositif d’imagerie sphéroïde. Ce dispositif permet l’imagerie dynamique ou longitudinale de fluorescence des sphéroïdes de cellules cancéreuses. Le protocole offre également une procédure simple de traitement d’image pour l’analyse de l’invasion des cellules cancéreuses.

Imagerie et analyse de fluorescence résolues dans le temps de l’invasion des cellules cancéreuses dans le modèle sphéroïde 3D

Le protocole décrit la génération de sphéroïdes à haut débit pour la bio-impression à l’aide de l’analyse multiparamétrique de leur oxygénation et de leur mort cellulaire sur un microscope à fluorescence standard. Cette approche peut être appliquée pour contrôler la viabilité des sphéroïdes et effectuer une normalisation, ce qui est important dans la modélisation des tissus 3D, le microenvironnement tumoral et la biofabrication réussie des (micro)tissus.

Biofabrication assistée par microscopie à oxygène abordable de sphéroïdes multicellulaires

Une méthode pour l'assemblage des gradients adhésives et soluble dans une chambre microscopique direct des études sur la migration des cellules est décrite. L'environnement technique combine des surfaces adhésives anti-salissures et les pistes de solutions avec des dégradés et permet donc de déterminer l'importance relative des signaux de guidage.

Création de dégradés et adhésifs solubles pour la migration des cellules d&#39;imagerie par microscopie à fluorescence

Ce protocole décrit comment utiliser la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale pour visualiser et suivre des récepteurs uniques à la surface de cellules vivantes et ainsi analyser la mobilité latérale des récepteurs, la taille des complexes récepteurs, ainsi que pour visualiser les interactions transitoires récepteur-récepteur. Ce protocole peut être étendu à d’autres protéines membranaires.

Haute résolution spatio-temporelle d&#39;analyse de la dynamique des récepteurs par simple molécule microscopie de fluorescence

La distribution spatiale et la dynamique temporelle des protéines et des lipides de la membrane plasmique sont un sujet brûlant en biologie. Ici, cette question est abordée par une analyse de fluctuation d’image spatio-temporelle qui fournit conceptuellement les mêmes quantités physiques de suivi de particules uniques, mais elle utilise de petits marqueurs moléculaires et des configurations de microscopie standard.

De Fluorescence Imaging rapide à moléculaire loi Diffusion sur les membranes cellulaires en direct dans un microscope commercial

Un nouveau protocole d’imagerie a été développé à l’aide d’un actionneur mécanique motorisé personnalisé pour permettre la mesure des réponses en temps réel à la déformation mécanique dans les cellules vivantes. Pertinent pour la mécanobiologie, le système peut appliquer des contraintes allant jusqu’à 20 % tout en permettant une imagerie en temps quasi réel avec la microscopie confocale ou à force atomique.

Imagerie sur cellule vivante pendant stretch mécanique

Un microscope perfectionné permettant de rapides et de haute résolution d’imagerie de la membrane plasmique isolée et le volume intracellulaire environnant, est présenté. L’intégration de la filature de microscopie de fluorescence de réflexion interne disque et total dans un seul montage permet de vivre des expériences d’imagerie à des vitesses d’acquisition élevée jusqu'à 3,5 s par la pile de l’image.

Visualiser la Formation d’adhérences dans les cellules par le biais de pointe tourne disque-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Nous présentons un dispositif microfluidique centrifuge à moteur qui peut cultiver des sphéroïdes cellulaires. À l'aide de cet appareil, les sphéroïdes de types de cellules simples ou multiples pourraient être facilement cocultivés dans des conditions de haute gravité.

Plateforme Lab-on-a-CD pour générer des sphéroïdes multicellulaires tridimensionnels

La méthode présentée implique l’étirement uniaxial des hydrogels mous 3D incorporés dans le caoutchouc de silicone tout en permettant la microscopie confocale vivante. La caractérisation des souches externes et internes d’hydrogel ainsi que l’alignement des fibres sont démontrés. Le dispositif et le protocole développés peuvent évaluer la réponse des cellules à divers régimes de déformation.

Souche contrôlée d’hydrogels 3D sous imagerie par microscopie dynamique

Découvrez les méthodes de formation de sphéroïdes multicellulaires pour l'analyse du métabolisme cellulaire et de la distribution d'oxygène par microscopie FLIM en cellules vivantes. Ces techniques permettent d'étudier les biomarqueurs métaboliques dans des modèles 3D physiologiquement pertinents.

Production et microscopie imageuse à vie multiparamètre en fluorescence de cellules vivantes (FLIM) de sphéroïdes multicellulaires (Vidéo) | JoVE Journal

Production et microscopie imageuse à vie multiparamètre en fluorescence de cellules vivantes (FLIM) de sphéroïdes multicellulaires

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