Name: Méthode basée sur l’extraction Apoplast pour améliorer la pureté d’une protéine recombinante produite par une plante (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-05T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 33 s
Description: Découvrez l'extraction de protéines recombinantes à partir de l'apoplaste de Nicotiana benthamiana par infiltration sous vide et centrifugation. Cette méthode améliore significativement la pureté des protéines et réduit les coûts de purification.

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Ce travail est soutenu par l’Association pour la promotion de l’innovation des jeunes CAS (2021084) et le Fonds de soutien aux projets de déploiement clé du Plan d’action triennal de l’Institut de microbiologie de l’Académie chinoise des sciences.

1. Préparation des plantes de N. benthamiana 
<ol><li>Placez les blocs de semis dans un plateau, ajoutez 1 L d’eau et laissez tremper pendant environ 2 h jusqu’à ce qu’ils soient complètement saturés.</li>
	<li>Saupoudrez uniformément les graines de N. benthamiana de type sauvage sur les blocs de semis, couvrez avec un couvercle et faites germer pendant 1 semaine. Cultivez N. benthamiana dans une serre avec une photopériode de 18 h, 24 °C, 45% d’humidité relative, et fertilisez toutes les 2 semaines.</li>
	<li>Une fois que les graines ont germé, utilisez une pince à épiler pour retirer délicatement un semis, en prenant soin de ne pas endommager ses racines. Creusez un petit noyau au centre d’un nouveau plateau, placez-y le semis et recouvrez légèrement les racines de terre. Couvrir avec un couvercle et continuer à pousser.</li>
	<li>Cultivez jusqu’à ce que les semis aient trois feuilles, avec le couvercle. Retirez le couvercle lorsque la 4ème vraie feuille émerge.</li>
	<li>Laissez les plantes continuer à pousser pendant deux semaines de plus avant l’agroinfiltration.</li>
</ol>2. Construction de la GFP-His recombinante
<ol><li>Effectuer l’optimisation des codons de N. benthamiana et la synthèse de la GFP et de la PR1a (MGFVLFSQLPSFLLVSTLLLLFLVISHSCRAG) sur la base des séquences de gènes.</li>
	<li>Effectuer une double digestion du vecteur pCAMBIA1300 à l’aide des enzymes Xba I et Sac I (voir Tableau des Matériaux).</li>
	<li>Effectuer l’amplification de PR1a à l’aide d’amorces en amont (TTGGAGAACACGGGGGACTCTAGAATGGGATT TGTTCTCTTTTC) et les amorces en aval (TCCTCG CCCTTGCTCACCATGTCGACCCCGGCACGGCAAGA GTGGG), l’amplification de la GFP à l’aide d’amorces en amont (CCCACTCTTGCCGTGCGCGGGGGTCGACATGGTGAG CAAGGGCGAGGA) et les amorces en aval (GGGGAAATTCGAGCTCTCAGTGGTGATGGTGGTG GTGAGATCTTCCGGACTTGT).</li>
	<li>En utilisant la recombinaison homologue, clonez PR1a et GFP dans le vecteur d’expression végétale pCAMBIA1300. Après le transfert dans E. coli, sélectionnez des clones uniques et envoyez-les à l’entreprise pour séquençage. La comparaison des résultats de séquençage et du plasmide droit est le plasmide recombinant pCAMBIA1300-PR1a-GFP-His, appelé p35s-PR1a-GFP-His.</li>
</ol>3. Production de GFP-His chez N. benthamiana
<ol><li>Ajouter 1 μL de plasmide GFP dans 50 μL de cellules réceptrices Agrobacterium GV3101, mélanger doucement et ajouter dans la coupelle de l’électrode, retirer après électrocution sur l’électrochoceur.</li>
	<li>Étaler Agrobacterium tumefaciens transformé sur une plaque de milieu solide LB contenant 50 μg/mL de kanamycine (Kan) et 50 μg/mL de rifampicine (Rif). Incuber à l’envers à 28 °C pendant 48 h. Le vecteur pCAMBIA1300 est résistant au kan et Agrobacterium est résistant au rif ; seul l’Agrobacterium correct peut se développer sur des plaques avec kan et rif. Les clones monoclonaux étaient les transformants positifs, nommés A. tumefaciens GV3101-p35s-PR1a-GFP-His (AtGPG).</li>
	<li>Utilisez un cure-dent stérilisé pour prélever une quantité appropriée d’AtGPG et l’inoculer dans 4 mL de LB liquide avec du Kan et du Rif. Culture à 28 °C, 220-300 tr/min pendant 24 h.</li>
	<li>Sous-culture de bactéries dans des LB fraîches (50 μg/mL de Kan, 10 mM d’acide éthanesulfonique (NE-Morpholino), 20 μM d’acétosyringone (AS)) et incuber à 28 °C, 220-300 tr/min pendant 10-12 h.</li>
	<li>Récolter les bactéries par centrifugation à 1500 x g pendant 10 min et remettre en suspension la pastille avec 1 mL de MMA (10 mM MgCl2, 10 mM MES pH 5,6, 100 μM AS).</li>
	<li>Mesurez et ajustez la densité optique (DO) d’AtGPG àOD 600 = 0,8 à l’aide de MMA. Incuber les bactéries pendant encore 2 à 4 h à température ambiante. Prélevez la solution bactérienne à l’aide d’une seringue sans aiguille, pressez-la légèrement contre l’arrière des feuilles et exercez une pression pour faire pénétrer la solution dans les feuilles. Injectez uniquement les 3-4 feuilles du milieu par plante.</li>
	<li>Continuez à cultiver N. benthamiana dans la serre pendant 3-4 jours avant de récolter les feuilles pour l’extraction des protéines.</li>
</ol>4. Observation de la localisation subcellulaire de la GFP
<ol><li>Après 48 h d’agroinfiltration, sélectionnez une feuille plate et utilisez une perforatrice de 6 mm pour serrer la lame pour le poinçonnage.</li>
	<li>Versez une solution de saccharose à 30 % sur une lame de verre, placez l’échantillon de feuille avec le dos vers le haut et couvrez-le d’un verre de protection.</li>
	<li>Réglez la longueur d’onde d’excitation sur 488 nm et détectez la fluorescence verte à 490-550 nm après un grossissement de 400x. Prenez la première photo une fois la diapositive préparée et une autre 10 min plus tard.</li>
</ol>5. Extraction de la GFP de la plante
<ol><li>Extraction AWF<ol><li>Prélever les feuilles fraîches intactes de N. benthamiana exprimant la GFP recombinante 3 jours après l’agroinfiltration. Traitez la feuille avec douceur et maintenez l’intégrité de la feuille pour éviter l’efflux de protéines intracellulaires. Utilisez immédiatement les feuilles collectées pour l’étape suivante afin d’éviter la dégradation des protéines.</li>
		<li>Rincer la lame des feuilles avec du ddH2O stérilisé pré-refroidi pour éliminer les débris.</li>
		<li>Peser les feuilles fraîches et les immerger (côté abaxial vers le bas) dans 100 mL de tampon phosphate pré-refroidi de 100 mM (PB 100 mM Na2, HPO4 et 100 mM NaH2PO4 ont été configurés séparément et mélangés à un rapport de 2,2:1 pH 7,0) dans un bécher à large ouverture de 200 mL. Couvrez les feuilles avec du fil de nylon à mailles fines de 100 mailles (voir tableau des matériaux) et une assiette en plastique. REMARQUE : Le pré-refroidissement empêche la dégradation des protéines. Les volumes de tampon peuvent être ajustés en fonction de l’échelle expérimentale. Assurez-vous que toutes les feuilles sont immergées.</li>
		<li>Placez le bécher dans une pompe à vide. Appliquez un vide de 0,8 MPa pendant 1 min, puis rétablissez rapidement la pression atmosphérique.</li>
		<li>Retirez les feuilles du tampon et séchez-les doucement avec du papier absorbant. Enroulez les feuilles, enveloppez-les de fil à maille et placez 5 g de feuilles dans chaque tube à centrifuger de 50 ml. Pour recueillir l’AWF, placez les feuilles roulées côté tête vers le haut dans des tubes avec du fil de maille fixé par les capuchons des tubes.</li>
		<li>Centrifugeuse à 4 °C, 500 x g pendant 5 min. Retirez les feuilles et récupérez l’AWF au fond du tube à l’aide d’une pipette. Environ 5 mL d’AWF peuvent être obtenus à partir de chaque tube. REMARQUE : Afin de minimiser les interférences des protéines intracellulaires et d’extraire le maximum de protéines AWF, l’extraction peut être répétée 2x-3x, mais pas plus de 3x.</li>
	</ol></li>
	<li>Extraction totale des protéines solubles<ol><li>Broyer 20 g de feuilles en poudre fine dans de l’azote liquide. Ajouter le tampon d’extraction (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 10 % de glycérol, 1 % de Triton X-100, 0,034 % de β-mercaptoéthanol (voir le tableau des matériaux)) dans un rapport de 1:2.</li>
		<li>Agiter l’homogénat dans un mélangeur vertical pendant 30 min à 4 °C. Centrifugeuse homogéner à 13 000 x g pendant 15 min à 4 °C.</li>
		<li>Transférez le surnageant dans un nouveau tube et répétez la centrifugation pendant 15 min. Transférez le surnageant éliminé dans un autre tube.</li>
		<li>Filtrer le surnageant à travers un filtre de 0,22 μm (voir tableau des matériaux) pour obtenir un extrait total de protéines solubles.</li>
	</ol></li>
</ol>  
6. Purification de GFP-His par chromatographie d’affinité nickel (Ni)
REMARQUE : Effectuez toutes les étapes à 4 °C.
<ol><li>Ajouter la résine Ni sepharose excel (voir le tableau des matières) dans un tube dans un rapport de 1:1000 par rapport au volume de l’extrait protéique de l’étape 5.1.6. Le volume de résine équivaut à 1/1000e du volume de l’extrait de protéines.</li>
	<li>Laver la résine Ni 3x avec 10x le volume de résine ddH, 2O et PB (pH 7,0) séparément et retirer le surnageant.</li>
	<li>Incuber l’extrait protéique avec de la résine Ni pendant 2 h pour permettre une liaison complète. Centrifuger à 500 x g pendant 5 min pour éliminer les protéines non liées dans le surnageant. Laver 3x avec 20x le volume de résine de PB. Centrifuger à 500 x g pendant 5 min et retirer le surnageant.</li>
	<li>Éluer GFP-His en ajoutant 10 fois le volume de résine de 250 mM d’imidazole (50 mM de Tris-HCl pH 7,4, 150 mM de NaCl, 10 % de glycérol, 250 mM d’imidazole) et recueillir le surnageant.</li>
</ol>7. Coloration au bleu de Coomassie des protéines
<ol><li>Ajouter 10 μL de tampon de chargement 5x SDS à 40 μL d’échantillons de protéines, faire bouillir pendant 10 min, puis fonctionner avec 15% SDS-PAGE à 110 V pendant 60 min.</li>
	<li>Colorer les gels protéiques avec la solution de bleu de Coomassie (0,1% R-250, 25% d’isopropanol, 10% d’acide acétique glacial) pendant 2 h.</li>
	<li>Videz la solution et lavez avec une solution décolorante pendant 2 h. Observez le gel ; Les protéines sur le gel seront colorées en bleu.</li>
</ol>8. Transfert Western des protéines
<ol><li>Ajouter 10 μL de tampon de chargement 5x SDS à 40 μL d’échantillons de protéines, faire bouillir pendant 10 min, puis fonctionner avec 15% SDS-PAGE à 110 V pendant 60 min.</li>
	<li>Transférez les protéines dans une membrane de nitrocellulose de 0,45 μm à 280 mA. Bloquer la membrane avec du lait écrémé à 5 % pendant 1 h.</li>
	<li>Diluez les anticorps anti-His-tag à 1:5000 et incubez la membrane avec les anticorps pendant 1 h. À l’aide de la solution saline et tween 20 (TBST) tris-buffered, laver la membrane 4x pendant 5 min.</li>
	<li>Diluez les anticorps anti-souris à 1:10000 et incubez la membrane avec les anticorps pendant 1 h. Utilisez TBST pour laver la membrane 4x pendant 5 min.</li>
	<li>Mélangez le révélateur (voir tableau des matériaux) dans un rapport de 1:1. Ajouter 400 μL à la membrane et laisser réagir pendant 1 min. Prenez des photos après 1 min d’exposition avec un visualiseur.</li>
</ol>9. Dosage de la concentration en protéines
<ol><li>Ajouter 5 μL de protéines à 1 mL de réactif de colorant Bradford 1x et réagir pendant 5 min.</li>
	<li>Déterminez la valeur OD595 après la mise à zéro et calculez la concentration en protéines à partir de la courbe standard.</li>
</ol>10. Quantification des protéines 31
<ol><li>Effectuer le Western blot d’échantillons de protéines avec des étalons.</li>
	<li>Effectuez la quantification de la GFP par rapport aux normes à l’aide de l’analyse en niveaux de gris ImageJ 1.5.0.</li>
</ol>

Extraction et purification efficaces de GFP-His à partir de feuilles de N. benthamiana

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<li>Streatfield, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+achieve+high-level+heterologous+protein+production+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Approaches to achieve high-level heterologous protein production in plants.</a> Plant Biotechnol J. 5 (1), 2-15 (2007).</li>
<li>Yamamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+the+transient+expression+system+for+production+of+recombinant+proteins+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Improvement of the transient expression system for production of recombinant proteins in plants.</a> Sci Rep. 8 (1), 4755(2018).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wheat+Apoplast-localized+lipid+transfer+protein+TaLTP3+enhances+defense+responses+against+Puccinia+triticina%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Wheat Apoplast-localized lipid transfer protein TaLTP3 enhances defense responses against Puccinia triticina.</a> Front Plant Sci. 12, 771806(2021).</li>
<li>Venkataraman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+expression+and+purification+strategies+for+plant+made+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Recent advances in expression and purification strategies for plant made vaccines.</a> Front Plant Sci. 14, 1273958(2023).</li>
<li>Witzel, K., Shahzad, M., Matros, A., Mock, H. P., Mühling, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+extraction+methods+for+apoplastic+proteins+from+maize+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Meth%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of extraction methods for apoplastic proteins from maize leaves.</a> Plant Meth. 7, 48(2011).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

L’utilisation de plantes pour produire des protéines thérapeutiques s’est rapidement développée ces dernières années 1,2,3,4,5,6. Les gènes codant pour des protéines sont clonés en vecteurs d’expression et délivrés dans les tissus végétaux par agroinfiltration. Après leur production par les cellules végétales, les protéines sont purifiées pour des applications en aval. En règle générale, les protéines recombinantes sont purifiées à partir d’extraits de TSP. Cependant, l’abondance de protéines végétales et de cytochromes libérés par les cellules végétales lors de l’extraction peut entraver la purification33. D’une part, les cytochromes végétaux peuvent obstruer les colonnes de séparation, ralentissant le traitement17 ; d’autre part, les protéines très abondantes comme RuBisCO sont difficiles à éliminer, ce qui réduit la pureté18,19. Ces problèmes deviennent plus problématiques lorsque les protéines cibles sont exprimées à de faibles niveaux. La purification à partir de l’AWF contourne ces problèmes, ce qui permet une plus grande pureté (Figure 2J).
Bien que l’extraction par AWF ait été largement utilisée en biologie végétale 24,25,26,27, elle est rarement exploitée dans les pipelines d’agriculture moléculaire. Ici, nous utilisons un modèle GFP fabriqué à partir d’une plante pour démontrer la purification des protéines basée sur l’AWF. L’extraction de la GFP de l’AWF a été réalisée en ajoutant un peptide signal pour permettre la sécrétion de GFP dans l’espace apoplaste. Cette méthode permet d’extraire des protéines avec une plus grande homogénéité et de réduire les coûts de traitement des protéines en aval. Plusieurs considérations méritent d’être étudiées pour la mise en œuvre de la purification de la FA dans les bioréacteurs d’usine. Tout d’abord, une sécrétion efficace nécessite la fusion de peptides signaux N-terminaux spécifiques. Deuxièmement, pour préserver la qualité de l’AWF, les feuilles intactes doivent être traitées rapidement après la récolte sans congélation, ce qui libère du contenu intracellulaire. Troisièmement, la PB extrait efficacement les protéinesAWF 34, mais le pH tampon et la concentration en sel doivent être adaptés à chaque protéine recombinante (Figure 2C-D). Quatrièmement, nous avons obtenu des protéines purifiées à partir de 200 g de N. benthamiana à plusieurs reprises dans des conditions de laboratoire avec une pureté et un rendement stables. Pour être mis à l’échelle pour une utilisation en usine, des cuves et des pompes à vide plus grandes et une méthode de purification plus efficace sont demandées, et des conditions telles que la durée du vide, le nombre de récupérations, etc., peuvent devoir être optimisées.
Cette méthode est limitée par le fait que des protéines exogènes sont sécrétées dans l’AWF et que les protéines à l’intérieur de la membrane plasmique sont désertées (Figure 2H-I). Il apporte l’avantage d’obtenir des protéines purifiées plus élevées avec une modification correcte mais à un coût de rendement plus élevé. Le principal goulot d’étranglement technique pour la purification basée sur l’AWF est l’amélioration du niveau de protéine cible à l’intérieur de l’AWF. Le couplage avec des promoteurs puissants et des systèmes de sécrétion optimisés améliorera les plateformes d’expression végétale pour une grande pureté et des rendements plus élevés. Pour surmonter ce goulot d’étranglement, un système de production plus élevé et un système de sécrétion plus efficace sont nécessaires dans les travaux futurs.

De nos jours, diverses protéines thérapeutiques recombinantes produites par des plantes sont à l’étude, notamment des anticorps, des vaccins, des protéines bioactives, des enzymes et de petits polypeptides 1,2,3,4,5,6. Les plantes deviennent une plate-forme de plus en plus utilisée pour produire des protéines thérapeutiques en raison de leur sécurité, de leur faible coût et de leur capacité à augmenter rapidement la production 7,8. L’expression et la modification des protéines dans les systèmes végétaux, ainsi que la purification des protéines, sont des facteurs critiques déterminant la productivité des bioréacteurs végétaux 9,10. L’amélioration de la productivité des plantes et l’obtention de protéines cibles de haute pureté sont les principaux défis auxquels sont confrontés les systèmes de production à base de plantes11,12.
La localisation subcellulaire et la modification des protéines recombinantes dépendent du peptide signal spécifique codé à l’extrémité N-terminale, qui cible la protéine vers sa destination finale d’organite lors de l’expression génique. Les protéines recombinantes sont conçues pour se localiser dans l’apoplaste, le réticulum endoplasmique (RE), le chloroplaste, la vacuole ou le cytoplasme, en fonction de leurs propriétés uniques13. Pour les antigènes et les anticorps, les protéines sécrétées sont préférées. Avant la sécrétion, les protéines progressent à travers le RE et Golgi pour un repliement correct et des modifications post-traductionnelles 14,15,16.
Après la production dans les plantes, les protéines recombinantes doivent être purifiées à partir d’extraits de plantes. En règle générale, les protéines sont purifiées à partir d’extraits de plantes solubles totaux, qui contiennent d’abondantes protéines intracellulaires, des produits mal repliés et non modifiés et des cytochromes17. Pour éliminer les impuretés, les extraits de plantes subissent un fractionnement important, y compris la chromatographie d’affinité spécifique de la ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygénase (RuBisCO), la précipitation des phytates, la précipitation du polyéthylène glycol et l’ajustement de la température et du pH18,19. Ces étapes d’élimination des impuretés sont laborieuses et peuvent compromettre la qualité des protéines.
Le compartiment cellulaire végétal au-delà de la membrane plasmique est défini comme l’apoplaste, englobant la paroi cellulaire, les espaces intercellulaires et le xylème20. La phase aqueuse est communément appelée liquide de lavage apoplast (AWF). L’AWF contient des molécules sécrétées par les cellules pour réguler de nombreux progrès biologiques tels que le transport, le métabolisme de la paroi cellulaire et les réponses au stress21,22. Contrairement à la TSP, les constituants moléculaires de l’AWF sont moins complexes. L’extraction de protéines recombinantes de l’AWF peut éviter la contamination par des protéines intracellulaires, des produits mal repliés et des restes cytoplasmiques. En bref, le lipide d’extraction pénètre dans les feuilles par les stomates sous pression négative, et l’AWF est collecté par centrifugation douce23. Bien que l’isolement de l’AWF soit largement utilisé pour étudier les progrès biologiques à l’intérieur de l’apoplast 24,25,26,27, il n’a pas été exploité dans les systèmes de production à base de plantes.
L’amélioration de la productivité des plantes et l’obtention de protéines cibles de haute pureté sont des défis centraux pour les systèmes de production végétale28. En règle générale, les protéines sont purifiées à partir d’extraits de plantes solubles contenant de grandes quantités de protéines intracellulaires, de produits mal repliés et non modifiés, et de cytochromes29, qui nécessitent des coûts élevés pour la purification ultérieure30. L’utilisation de méthodes d’extraction de protéines AWF pour l’extraction de protéines recombinantes exogènes sécrétées dans l’apoplast peut améliorer efficacement l’homogénéité des protéines recombinantes et réduire le coût de la purification des protéines. Ici, nous utilisons un peptide signal PR1a pour permettre la sécrétion de protéines exogènes dans l’espace de l’appoplast et introduisons une méthode détaillée pour la purification des protéines recombinantes de l’AWF de N. benthamiana.

<table><tbody><tr><td>100 maille nylon fil à mailles fines</td><td>Guangzhou Huayu Trading limited company</td><td>hy-230724-2</td><td>Pour l’extraction de protéines AWF</td></tr><tr><td>50 ml tubes à centrifuger</td><td>Vazyme</td><td>TCF00150</td><td>Pour centrifugeuse</td></tr><tr><td>ClonExpress II kit de clonage en une étape</td><td>Vazyme</td><td>C112-02</td><td>Pour clone</td></tr><tr><td>FastDigest Sac1</td><td>NEB</td><td>R3156S</td><td>Pour clone</td></tr><tr><td>FastDigest XbaI</td><td>NEB</td><td>FD0685</td><td>Pour clone</td></tr><tr><td>ImageJ 1.5.0</td><td>/</td><td>/Pour</td> <td>l’analyse en niveaux de gris</td></tr><tr><td>Grand filtre</td><td>Thermo Fisher</td><td>NEST</td><td>Pour le filtrage</td></tr><tr><td>Microscopie confocale à balayage laser</td><td>Leica SP8</td><td></td><td>Pour la localisation subcellulaire</td></tr><tr><td>Ni sepharose excel</td><td>Cytiva</td><td>10339806</td><td>Pour la purification des protéines</td></tr><tr><td>Protéine prémoulée plus gel</td><td>YEASEN</td><td>36246ES10</td><td>Pour SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Petit filtre</td><td>Nalgene</td><td>1660045</td><td>Pour filtrer</td></tr><tr><td>SuperSignal West Femto Substrate Trial Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>34076</td><td>Pour western blot</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>SCR</td><td>30188928</td><td>Pour configurer le tampon d’extraction</td></tr><tr><td>Type Pompe à vide rotaryvang</td><td>Zhejiang taizhouqiujing pompe à vide société</td> <td>limitée2XZ-2</td><td>Pour l’infiltration</td></tr><tr><td>sous vide Mélangeur vertical</td><td>Haimen Qilinbel Instrument Manufacturing société anonyme</td><td>BE-1200</td><td>Pour le mélange</td></tr><tr><td>&beta ;-mercaptoéthanol</td><td>SIGMA</td><td>BCBK8223V</td><td>Pour configurer le tampon d’extraction</td></tr></tbody></table>

méthode basée sur l’extraction apoplast pour améliorer la pureté d’une protéine recombinante produite par une plante  

Apoplast-Extraction Based Method to Improve the Purity of Plant Produced Recombinant Protein

Les plantes sont un système d’expression eucaryote en cours d’exploration pour produire des protéines thérapeutiques. La purification des protéines recombinantes des plantes est l’une des étapes les plus critiques du processus de production. En règle générale, les protéines ont été purifiées à partir de protéines solubles totales (TSP), et la présence de protéines intracellulaires et de cytochromes divers pose des défis pour les étapes ultérieures de purification des protéines. De plus, la plupart des protéines thérapeutiques comme les antigènes et les anticorps sont sécrétées pour obtenir une glycosylation correcte, et la présence de protéines incomplètement modifiées conduit à des structures d’antigènes ou d’anticorps incohérentes. Ce travail introduit une méthode plus efficace pour obtenir des protéines recombinantes hautement purifiées à partir de l’espace apoplasique des plantes. La protéine fluorescente verte recombinante (GFP) est conçue pour être sécrétée dans l’apoplast de Nicotiana benthamiana et est ensuite extraite à l’aide d’une méthode d’infiltration-centrifugation. Le GFP-His de l’apoplaste extrait est ensuite purifié par chromatographie d’affinité au nickel. Contrairement aux méthodes traditionnelles de TSP, la purification à partir de l’apoplast produit des protéines recombinantes hautement purifiées. Il s’agit d’une amélioration technologique importante pour les systèmes de production végétale.

GFP-His est ciblé pour sa sécrétion dans l’espace apoplasique de N. benthamiana La GFP a été clonée dans le plasmide pCAMBIA1300 avec un peptide signal N-terminal PR1a pour la sécrétion et un marqueur C-terminal His-tag pour la purification, générant p35s-PR1a-GFP-His (Figure 1A). La protéine recombinante a été exprimée transitoirement chez N. benthamiana, et une bande de 30 kDa a été détectée par transfert Western à l’aide d’anticorps anti-His 3 jours après l’agro-infiltration (figure 1B). La plasmolyse est le traitement des feuilles à l’aide d’une solution hypertonique pour séparer la paroi cellulaire de la membrane cellulaire32. Pour déterminer si la GFP est située dans l’apoplaste, nous avons utilisé 30% de saccharose pour faire la plasmolyse des feuilles. La microscopie à fluorescence a mis en évidence la présence de GFP-His dans l’apoplast (Figure 1C). Les protéines AWF extraites par infiltration-centrifugation sous vide contenaient également de la GFP-His (Figure 1D). Ces résultats démontrent la sécrétion de GFP-His dans l’AWF des feuilles de N. benthamiana, à partir desquelles il peut être extrait pour une purification en aval.
Purification des protéines à partir de l’AWF L’efficacité de l’extraction par l’AWF influence fortement le rendement final en GFP. En nous appuyant sur les protocoles d’extraction AWFpubliés 24,25,26,27, nous avons testé diverses solutions pour optimiser la récupération des GFP-His sécrétés. Huit solutions d’extraction y ont été analysées : 25 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 100 mM de NaH2PO4 (pH de 4,5), 50 mM de NaCl (pH de 7,1), 40 mM de KCl (pH de 7,0), 20 mM de CaCl2 (pH de 5,7), 100 mM de PB (pH de 7,0), 10 mM de MES (pH de 5,6) et de ddH2O (pH de 7,0). PB a extrait la plus grande quantité d’AWF et de GFP-His, dépassant de plus de 4 fois les autres solutions (Figure 2A, B). La comparaison de la PB à pH variable a révélé une amélioration de l’extraction de l’AWF et de la GFP-His dans des conditions neutres à légèrement alcalines (pH 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 et 8,0 ; Figures 2C, D). De plus, l’efficacité de l’extraction a été comparée à des concentrations de PB de 50 mM, 100 mM et 150 mM. Les résultats ont indiqué que 100 mM PB ont montré une efficacité maximale pour la récupération de l’AWF et de la GFP-His (Figure 2E,F).
Sur la base de ces expériences d’optimisation, 100 mM PB, pH 7,0, ont été sélectionnés pour l’extraction à grande échelle de la FSE de N. benthamiana. À l’aide de ce tampon, 495 μg de protéines AWF totales par gramme de matière foliaire fraîche ont été récupérés de l’apoplast (figure 2G). L’AWF extrait contenait 10 μg de GFP-His (figure 2H), ce qui correspondait à environ 18 % de la GFP-His totale dans le TSP (figure 2I). Après chromatographie d’affinité Ni, la pureté de la GFP-His a atteint 84,3 % à partir de l’extraction AWF, ce qui est nettement supérieur à la pureté de 44,9 % obtenue lors de l’extraction des protéines solubles totales (Figure 2J).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66852/66852fig01.jpg"> Figure 1 : GFP-His est ciblé pour la sécrétion dans l’apoplast de N. benthamiana. (A) Schéma de la construction de PR1a-GFP-His dans le vecteur d’expression végétale pCAMBIA1300. (B) Western blot détectant la production de GFP-His chez N. benthamiana. Ici, 10 μL d’échantillons de protéines ont été chargés et détectés. Les feuilles de N. benthamiana injectées simultanément avec du MMA ont été utilisées comme contrôle négatif. Le même volume d’échantillons a été examiné et coloré à l’aide de grandes sous-unités végétales comme contrôle de charge (C) Microscopie confocale montrant la localisation subcellulaire de GFP-His (vert). Les feuilles de N. benthamiana ont été plasmolysées avec 30% de saccharose. Des lignes pointillées blanches indiquent la membrane plasmique. Les flèches rouges indiquent l’accumulation de GFP-His dans l’apoplaste. (D) Transfert Western démontrant la présence de GFP-His dans le liquide apoplasique extrait. Ici, 10 μL d’échantillons de protéines ont été chargés et détectés. Les feuilles de N. benthamiana injectées simultanément avec du MMA ont été utilisées comme contrôle négatif. Abréviations : 35s = 2x promoteur du virus de la mosaïque du chou-fleur 35s ; PR1a = peptide signal de la protéine 1a liée à la pathogenèse du tabac ; Son = 6x Son balise ; Nos = terminateur nopaline synthase. BS = avant la plasmolyse ; PS = post-plasmolyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66852/66852fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66852/66852fig02.jpg"> Figure 2 : Optimisation de la méthode d’extraction des protéines de l’AWF. (A-B) Extraction des protéines de l’AWF à l’aide de différents tampons. Huit solutions ont été testées pour l’extraction des protéines à partir de l’AWF : 25 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 100 mM de NaH2PO4 (pH de 4,5), 50 mM de NaCl (pH de 7,0), 40 mM de KCl (pH de 7,0), 20 mM de CaCl2 (pH de 5,7), 100 mM de PB (pH de 7,0), 10 mM de MES (pH de 5,6) et de ddH2O (pH de 7,0). L’efficacité d’extraction a été analysée par SDS-PAGE (A), et la GFP-His a été détectée par western blot à l’aide d’un anticorps anti-His (B). (C-D) Extraction à l’aide de PB à différentes valeurs de pH. Du PB avec des pH de 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 et 8,0 a été utilisé pour l’extraction de l’AWF. L’efficacité de l’extraction a été détectée par SDS-PAGE (C), et la GFP-His a été détectée par western blot avec un anticorps anti-His (D). (E-F) Extraction à l’aide de PB à différentes concentrations. Des PB à 50 mM, 100 mM et 150 mM ont été utilisés pour l’extraction de l’AWF. L’efficacité d’extraction a été analysée par SDS-PAGE (E), et la GFP-His a été détectée par western blot avec un anticorps anti-His (F). (G-H) Analyse quantitative des protéines extraites. Les protéines ont été extraites à l’aide de 100 mM de PB (pH 7,0). La protéine soluble totale (G) et la GFP-His (H) ont été quantifiées à des fins d’analyse statistique. (I) Analyse statistique de la proportion de la GFP de la FAE par rapport à la GFP totale. (J) Purification de la GFP-His à partir des protéines solubles totales de N. benthamiana ou AWF. Les protéines ont été extraites à l’aide de 100 mM de PB (pH 7,0), et la GFP-His a été purifiée par chromatographie d’affinité Ni. La purification a été analysée par SDS-PAGE. La voie la plus à droite est la norme BSA de 1 μg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66852/66852fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

La purification des protéines recombinantes des systèmes végétaux est généralement contestée par les protéines végétales. Ce travail fournit une méthode pour extraire et purifier efficacement une protéine recombinante sécrétée à partir de l’apoplast de Nicotiana benthamiana.

Méthode basée sur l’extraction Apoplast pour améliorer la pureté d’une protéine recombinante produite par une plante  

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