Name: Transformation mitochondriale chez Baker (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-07T14:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Découvrez la transformation mitochondriale chez la levure Saccharomyces cerevisiae pour étudier la synthèse protéique et l'assemblage des complexes respiratoires. Cette méthode révèle les mécanismes moléculaires essentiels à la phosphorylation oxydative.

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Cette publication a bénéficié du soutien du Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), de l’UNAM [IN223623 à XP-M]. L’UPD est un boursier CONAHCYT (CVU :883299). Nous tenons à remercier le Dr Ariann Mendoza-Martínez pour son aide technique avec les images au microscope optique. Licences Biorender : DU26OMVLUU (Figure 2) ; BK26TH9GXH (figure 3) ; GD26TH80R5 (figure 4) ; PU26THARYD (figure 7) ; ML26THAIFG (figure 9).

REMARQUE : Nous recommandons d’effectuer six transformations pour chaque construction, car l’efficacité de la transformation mitochondriale est généralement faible. La composition des différents milieux de croissance est indiquée au tableau 2.
1. Préparation des particules de tungstène
<ol><li>Peser 30 mg de particules de tungstène de 0,7 μm (WP, microsupports) dans un microtube. Ajouter 1,5 mL d’éthanol à 70 % (EtOH) pour stériliser. Vortex les WP et laissez-les reposer 10 min à température ambiante.</li>
	<li>Centrifugeuse à 13 200 x g pendant 15 min à température ambiante. Lavez les WP en ajoutant 1,5 mL d’eau stérile aux particules, en les faisant tourbillonner et en les centrifugeant à 13 200 × g pendant 15 min à température ambiante. Jetez le surnageant.</li>
	<li>Ajouter 500 μL de glycérol stérile à 50 % (la concentration finale est de 60 μg de WP/μL). REMARQUE : Les WP peuvent être conservés à -20 °C pendant au moins 6 mois. De ce stock, prélever la quantité nécessaire pour six transformations (100 μL).</li>
</ol>2. Revêtement ADN des WP
<ol><li>Ajoutez 5 g du plasmide de 2 μ et 15 g du plasmide bactérien contenant la séquence mitochondriale dans un microtube sur de la glace. REMARQUE : Le volume final ne doit pas dépasser 50 μL pour éviter de diluer davantage les réactifs nécessaires au revêtement de l’ADN.</li>
	<li>Ajouter 100 μL de suspension WP et vortex pendant 5 s (6 mg de WPs).</li>
	<li>Ajouter 4 μL de spermidine 1 M. Brièvement vortex.</li>
	<li>Ajouter 100 μL de CaCl2 glacé de 2,5 M, brièvement vortex. Incuber sur glace pendant 10 min ; Agiter brièvement le mélange toutes les 3 min. REMARQUE : La solution de CaCl2 est stérilisée par filtre et ne doit pas être autoclave.</li>
	<li>Centrifuger les WP pendant 30 s à 13 200 × g à 4 °C et jeter le surnageant. Lavez les particules en les remettant doucement en suspension dans 200 μL de 100% EtOH à -20 °C.</li>
	<li>Centrifuger les WP pendant 30 s à 13 200 × g à 4 °C et jeter le surnageant. Répétez le lavage.</li>
	<li>Remettre les WP en suspension dans 60-70 μL de 100 % EtOH à température ambiante à l’aide d’une pointe de pipette ; Ne pas vortex. REMARQUE : Pour garantir la qualité des plasmides, l’enrobage de l’ADN doit être effectué le même jour que la transformation biolistique.</li>
</ol>3. Préparation du matériel biolistique
<ol><li>Avant le bombardement, stérilisez six supports de macroporteurs (Figure 5) dans un autoclave et séchez-les soigneusement. Vous pouvez également les tremper dans de l’EtOH et les stériliser à l’aide d’une flamme à l’aide d’une pince. Placez-les sur une plaque de verre stérile.</li>
	<li>Pendant la précipitation de l’ADN (incubation de 10 minutes sur glace à l’étape 2.4), insérez six macroporteurs (ou disques volants) dans chacun des six supports de macrotransporteurs à l’aide de pinces stériles. REMARQUE : Ne stérilisez pas les macro-supports.</li>
	<li>Mélangez les WP enrobés d’ADN avec la pipette. Ajoutez 10 μL de WPs sur chaque surface de macroporteur et répartissez-les sur toute la surface avec la pointe de la pipette. Si nécessaire, ajoutez quelques microlitres supplémentaires de 100% EtOH à la surface du macroporteur pour obtenir une répartition uniforme des WP. Laissez sécher la suspension à température ambiante pendant ~20 min.</li>
</ol>4. Préparation des cellules de levure et des plaques de bombardement
<ol><li>Inoculer la souche du récepteur rho0 sur 2 mL de milieu YPR (tableau 2). Cultivez pendant une nuit à 30 °C dans une roue rotative.</li>
	<li>Diluer 300 μL de la culture dans 30 mL de milieu YPR frais. Cultiver à 30 °C et 200 tr/min sur un agitateur rotatif pendant deux nuits jusqu’à ce que la culture soit saturée.</li>
	<li>Centrifuger les cellules de levure à 600 × g pendant 5 min à température ambiante. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules de levure dans 600 μL de milieu YPD (tableau 2).</li>
	<li>À l’aide d’une poignée en verre stérile, étalez 100 μL de suspension de cellules de levure sur une plaque de support de bombardement solide. REMARQUE : Le milieu de bombardement ne doit pas contenir le marqueur de sélection du plasmide de 2 μ qui sera utilisé pour la transformation.</li>
	<li>Répétez l’étape 4.4 pour les cinq autres plaques.</li>
	<li>Incuber pendant 1 à 3 h à température ambiante avant de bombarder pour s’assurer que le milieu liquide est complètement absorbé à la surface de la plaque.</li>
</ol>5. Génération d’une souche rho-souche synthétique par transformation biolistique
REMARQUE : Avant de commencer, assurez-vous de lire le manuel d’utilisation de l’équipement biologique. Nous décrirons le protocole de l’équipement référencé (Tableau des matériaux et Figure 5).
<ol><li>Nettoyez la chambre du système d’administration de particules biologiques avec de l’éthanol à 70 % pour éviter la contamination et laissez-le reposer pendant au moins 10 minutes. Juste avant le bombardement, essuyez la surface avec une serviette en papier propre.</li>
	<li>Ouvrez les vannes du réservoir d’hélium pour régler environ 2 000 psi.</li>
	<li>Mettez l’équipement sous tension et allumez la source d’aspiration.</li>
	<li>À l’aide d’une pince, placez le macroporteur face vers le bas sur le support de macroporteur. REMARQUE : N’utilisez pas l’écran d’arrêt fourni avec l’équipement.</li>
	<li>Vissez le couvercle du macro-support sur le dessus du macro-porteur. Toutes les pièces constituent ensemble le système de lancement du microporteur (Figure 5).</li>
	<li>Placez le système de lancement de microporteurs à l’intérieur de la chambre à vide, au cinquième niveau à partir du bas.</li>
	<li>Placez l’une des plaques contenant la pelouse de souche rho0 au deuxième niveau à partir du bas de la chambre. Assurez-vous que la plaque est tournée vers le haut et qu’elle n’est pas couverte par le couvercle.</li>
	<li>À l’aide d’une pince stérile, placez un disque de rupture sur le capuchon de retenue. Vissez le capuchon de retenue sur le tube d’accélération ; Assurez-vous que le capuchon de retenue est bien ajusté. REMARQUE : Ne traitez pas les disques rompus avec de l’isopropanol comme suggéré dans le manuel car nous avons observé que l’efficacité de la transformation diminue.</li>
	<li>Fermez la porte de la chambre à vide.</li>
	<li>Mettez l’interrupteur VAC/VENT/HOLD en position VAC . Lorsque le vide de 25-28 inHg est atteint, mettez l’interrupteur VAC/VENT/HOLD en position HOLD . REMARQUE : Sachez que le vide réalisable peut varier en fonction du niveau de la mer. Nous avons réussi à atteindre 25 inHg.</li>
	<li>Attendez que la pression s’accumule dans le tube d’accélération jusqu’à ce qu’elle atteigne 1 300 psi, lorsque le disque de rupture se brisera en émettant un bruit sec.</li>
	<li>Immédiatement après la rupture du disque de rupture, l’interrupteur FIRE et le vide sont libérés en mettant l’interrupteur VAC/VENT/HOLD en position VENT .</li>
	<li>Avec précaution, à l’aide d’une pince stérile, retirez tous les débris du disque de rupture présents à la surface de la plaque et recouvrez la plaque avec son couvercle.</li>
	<li>Répétez la procédure pour les cinq plaques restantes, en plaçant un nouveau disque de rupture et un macrosupport dans chaque tour.</li>
	<li>À la fin, fermez la vanne principale du réservoir d’hélium.</li>
	<li>Fermez la chambre et créez un vide en mettant l’interrupteur VAC/VENT/HOLD en position VAC . Relâchez le système de toute pression d’hélium en appuyant et en relâchant l’interrupteur FIRE plusieurs fois. Répétez l’opération avec la porte ouverte.</li>
	<li>Éteignez la pompe à vide et l’équipement de bombardement.</li>
	<li>Nettoyez le système de distribution avec 70% d’EtOH. Lavez les supports de macro-supports avec une solution SDS à 0,1 % ; rincer à l’eau distillée stérile et à 100 % d’EtOH.</li>
</ol>6. Sélection synthétique de la rho-colonie
<ol><li>Incuber les plaques de bombardement pendant 5 à 7 nuits à 30 °C. REMARQUE : Il est important de vérifier quotidiennement que les plaques ne sont pas contaminées. Si nécessaire, la région contaminée peut être découpée à l’aide d’une spatule stérile pour éviter toute contamination supplémentaire.</li>
	<li>Inoculer la souche d’essai du type d’accouplement opposé dans 2 mL de milieu YPD pendant la nuit (voir l’exemple spécifique à la figure 2D,E).</li>
	<li>Inoculer 150 μL de la culture de souche testrice sur une plaque YPD. À l’aide d’une poignée en verre stérile, étalez le testeur uniformément sur la surface de la plaque. Laissez sécher la plaque pendant au moins 5 min.</li>
	<li>Réalisez des répliques des plaques de bombardement à l’aide de tampons de réplication en velours et d’un tampon de réplicateur.<ol><li>Répliquer sur une plaque de milieu de décrochage correspondant au marqueur d’auxotrophie plasmidique transformé de 2 μ. La croissance dure une nuit d’incubation à 30 °C. Ensuite, conserver à 4 °C jusqu’à nouvel ordre. Cette plaque est la plaque maîtresse.</li>
		<li>Répétez la réplique de l’étape 6.3 sur la plaque YPD contenant la pelouse du testeur. Incuber à 30 °C pendant deux nuits. Par la suite, répliquez cette plaque sur le milieu sélectif pour détecter la présence du gène mitochondrial d’intérêt, par exemple, milieu respiratoire ou milieu dépourvu d’arginine, et incubez une nuit à 30 °C. Seules les cellules qui ont hébergé le plasmide bactérien synthétique dans les mitochondries se développeront sur le milieu sélectif après l’accouplement avec la souche testeuse.</li>
	</ol></li>
	<li>Identifiez sur la plaque maîtresse (étape 6.4.1) les colonies correspondantes qui ont poussé à l’étape 6.4.2. REMARQUE : Étant donné que la plaque de bombardement (et donc la plaque maîtresse) est encombrée de colonies transformantes, il peut être difficile d’identifier les colonies positives observées sur la plaque d’accouplement du testeur. Pour cette raison, il est fortement recommandé de tracer quelques petites lignes de chaque côté de toutes les plaques avec un marqueur permanent. Tracez des lignes similaires sur l’anneau du tampon réplicatif. Ces lignes seront utiles pour orienter et localiser les colonies positives sur la plaque maîtresse (voir l’exemple de la figure 2D).</li>
	<li>Purifier les colonies positives en les striant de la plaque maîtresse vers une deuxième plaque de chute sélective, comme à l’étape 6.4.1. Incuber pendant deux nuits à 30 °C. REMARQUE : Il est essentiel que le stries permette la croissance de colonies uniques pour assurer une souche pure.</li>
	<li>Répétez le processus de sélection (étapes 6.2 à 6.5) pour confirmer la présence du plasmide bactérien dans les mitochondries. REMARQUE : Habituellement, ce processus peut être répété deux fois de plus pour sélectionner des souches synthétiques stables.</li>
	<li>Une fois que la souche synthétique rho- maintient de manière stable l’ADN plasmidique dans les mitochondries, sélectionnez 3 à 5 colonies positives différentes et inoculez-les dans 2 ml de YPD. Utilisez cette culture pour préparer un stock cryofial (en mélangeant 600 μL de culture et 600 μL de glycérol à 50 % pour conserver à -70 °C) et pour insérer la séquence plasmidique dans l’ADNmt d’intérêt par cytoduction (étape 6.7). REMARQUE : Comme il n’y a pas de pression sélective pour maintenir le plasmide transformé dans les mitochondries à partir de la souche synthétique rho-stendue , le plasmide peut être facilement perdu. Par conséquent, nous vous recommandons d’effectuer la cytoduction dès que possible.</li>
</ol>7. Intégration de la construction présente dans la souche rho-souche synthétique dans le site cible du génome mitochondrial par cytoduction
<ol><li>Inoculer deux tubes avec 3 mL de milieu YPD, l’un avec les cellules donneuses (rho-cellules synthétiques) et l’autre avec les cellules accepteuses (cellule de levure où la construction finale est attendue). Incuber toute la nuit à 30 °C.</li>
	<li>Mélangez 750 μL de la souche donneuse et 250 μL de la souche réceptrice dans un microtube stérile (rapport 3:1).</li>
	<li>Centrifuger le mélange pendant 1 min à 13 200 × g ; Jetez le surnageant. À l’aide d’une pointe de pipette de 1 mL avec l’extrémité coupée, prélevez une goutte de la pastille de cellule et placez-la sur une plaque YPD. Incuber à 30 °C pendant 2 à 4 h. REMARQUE : Pour éviter la contamination croisée, ne mettez pas plus de deux suspensions de cellules dans une seule plaque (voir l’exemple de la figure 4A).</li>
	<li>Prélever une petite quantité du mélange de cellules, le remettre en suspension dans 15 μL d’eau stérile sur une lame et placer une lamelle. Vérifier au microscope optique la présence de shmoos avec un objectif 40x ou 100x ; cette forme caractéristique se manifeste lorsque deux types d’accouplement sont présents (figure 3B).</li>
	<li>S’il y a des shmoos, remettre en suspension une petite quantité (~0,5 mm3) de la masse cellulaire dans 2 mL de milieu YPD. Incuber pendant 2 h à 30 °C dans une roue tournante pour permettre aux zygotes binucléaires de récupérer.</li>
	<li>Mélangez et diluez 10 μL de suspension cellulaire dans 990 μL d’eau stérile (dilution 1:100). À l’aide de billes de verre ou d’une poignée en verre stérile, étalez 100 μL de dilution cellulaire sur un milieu de chute où seule la souche accepteur (et les diploïdes sporadiques) se développe. Incuber pendant 2-3 nuits à 30 °C.</li>
	<li>Répliquez les colonies résultantes sur les milieux sélectifs nécessaires, comme expliqué dans l’introduction (étape 4 ; voir la figure 4C pour un exemple spécifique).</li>
	<li>Après l’identification des colonies positives, réinstallez-les sur le même milieu sélectif pour purifier la souche haploïde porteuse de l’ADNmt d’intérêt.</li>
	<li>Sélectionnez au moins deux colonies positives et cultivez-les sur 2 mL de milieu YPD à 30 °C pendant la nuit. Faites une sauvegarde cryogénique en mélangeant 600 μL de glycérol à 50 % avec 600 μL de culture YPD saturée. Conserver à -70 °C.</li>
	<li>Isoler l’ADN des souches résultantes 31,32. Amplifier la région souhaitée par PCR et séquençage pour confirmer la présence de la mutation mitochondriale. REMARQUE : Chaque colonie positive est une réplique technique qui doit être confirmée indépendamment pour garantir la séquence correcte dans le génome mitochondrial.</li>
</ol>

Transformation biolistique des mitochondries de levure pour l’analyse mutagénétique

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</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Le présent travail a décrit comment transformer avec succès les mitochondries de la levure S. cerevisiae . Le processus, depuis le bombardement de microprojectiles à grande vitesse jusqu’à la purification de la souche de levure prévue, prend ~8 à 12 semaines, selon le nombre de cycles de purification de la souche synthétique rho-soutin nécessaires. Certaines des étapes critiques de la méthode sont les suivantes. Tout d’abord, plus les régions flanquantes ajoutées autour du site de mutation dans la construction du gène mitochondrial sont grandes, plus la probabilité d’intégration réussie de la mutation cible est élevée. La taille minimale des régions flanquantes est de ~100 nt ; Cependant, il est fortement recommandé d’utiliser plus de 500 NT de chaque côté de la mutation. Deuxièmement, lors de la sélection des rho-colonies synthétiques après transformation, il est recommandé de ne pas procéder à plus de 3-4 cycles de purification ; Sinon, il y a un risque élevé que la construction mitochondriale finisse par être perdue, car il n’y a pas de pression sélective pour maintenir le plasmide dans les mitochondries. Troisièmement, pour éviter de blesser l’utilisateur ou l’équipement, vous devez lire attentivement le manuel de la machine à bombardement avant de commencer la procédure. Cet équipement est délicat et utilise la haute pression et le vide.
L’une des limites de cette procédure est que jusqu’à présent, seules la levure et l’algue verte C. reinhardtii sont candidates pour transformer les mitochondries avec cette méthode. Il serait pertinent si nous pouvions introduire des mutations dirigées vers le site sur le génome mitochondrial à partir d’autres organismes. Une autre limitation est qu’il est difficile de transformer de nombreuses constructions différentes au cours d’une même session. Il est recommandé d’effectuer six transformations pour chaque construction, chacune d’entre elles devant être testée, sélectionnée et purifiée. Il en résulte plus de 50 plaques de milieux pour obtenir des rho-colonies pures d’une seule mutation mitochondriale.
Malgré ces limitations, la capacité de manipuler le génome mitochondrial de la levure a contribué de manière significative à la compréhension de nombreuses voies de biogenèse des complexes respiratoires. Cette approche peut être utilisée pour introduire des gènes rapporteurs afin de surveiller et de quantifier la traduction mitochondriale 1,7,36,37, d’interrompre les gènes mitochondriaux 38, d’identifier les chaperons d’assemblage des complexes respiratoires39, de mieux comprendre les mécanismes de traduction et d’assemblage mitochondriaux couplés 7,11,12,36, et rechercher des suppresseurs lors de l’expression d’un gène mitochondrial40 muté. Jusqu’à présent, bien que certaines approches de manipulation du génome mitochondrial chez les mammifères aient étésignalées plus tôt, il n’existe aucune méthode répandue pour transformer l’ADN mitochondrial pour ces organismes.

<table><tbody><tr><td>1 mL pointes de pipette</td><td>Axygen</td><td>T-1000-B</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Microtube</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu ; Pointes de pipette L</td><td>Axygen</td><td>T-10-C</td><td></td></tr><tr><td>15 mL tube à fond conique&nbsp ;</td><td>Axygen</td><td>SCT-25ML-25-S</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu ; Pointes de pipette en L</td><td>Axygen</td><td>T-200-Y</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tube à fond conique</td><td>Axygen</td><td>SCT-50ML-25-S</td><td></td></tr><tr><td>AfiII</td><td>New England BioLabs</td><td>R0520S</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>SeaKem</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Balance analytique</td><td>OHAUS</td><td>ARA520</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>TOMY</td><td>ES-315</td><td></td></tr><tr><td>Gélose Bacto</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Bacto peptone</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Support de macroporteur biolisitique&nbsp ;</td><td>Bec Bunsen BIO-RAD</td><td>1652322</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>89038-528</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>CSM -ADE</td><td>Formedium</td><td>DCS0049</td><td></td></tr><tr><td>CSM -ARG</td><td>Formedium</td><td>DCS0059</td><td></td></tr><tr><td>CSM -LEU</td><td>Formedium</td><td>DCS0099</td><td></td></tr><tr><td>CSM -URA</td><td>Formedium</td><td></td><td></td>DCS0169</tr><tr><td>Flacon de culture en verre</td><td>KIMAX KIMBLE</td><td>25615</td><td></td></tr><tr><td>Tube en verre de culture</td><td>Pyrex</td><td>9820</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>BD</td><td>215520</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>JT Baker&nbsp ;</td><td>9000</td><td></td></tr><tr><td>Pince</td><td>Millipore</td><td>620006</td><td></td></tr><tr><td>Perles de verre</td><td>Sigma</td><td>Z265926</td><td></td></tr><tr><td>Poignée en verre</td><td>Sigma</td><td>S4647</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>JT BAKER</td><td>2136-01</td><td></td></tr><tr><td>Réservoir d’hélium grade 5 (99,99 %)</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>HSTaq&nbsp ; Kit</td><td>PCR BIO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>022620100</td><td></td></tr><tr><td>NdeI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0111L</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur orbital</td><td>New Brunswick scientific</td><td>NB-G25</td><td></td></tr><tr><td>Tubes PCR</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-C</td><td></td></tr><tr><td>PDS-1000/He TM Système de distribution de particules biolistiques</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2257</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri (100X10)</td><td>BD</td><td>252777</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>Raffinose</td><td>Formedium</td><td>RAF03</td><td></td></tr><tr><td>Réplique</td> plateau <td>Scienceware</td><td>Z363391</td><td></td></tr><tr><td>Disques de rupture 1350 Psi</td><td>BIO-RAD</td><td>1652330</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma</td><td>S7547</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma</td><td>S0266</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Thermo Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>Rotateur de culture tissulaire</td><td>Thermo Scientific</td><td>88882015</td><td></td></tr><tr><td>Microtransporteurs en tungstène M10</td><td>BIO-RAD</td><td>1652266</td><td></td></tr><tr><td>Pompe à vide d’une capacité de 100L/min</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Tampons en velours</td><td>Bel-Art</td><td>H37848-0002</td><td></td></tr><tr><td>Vortex&nbsp ;</td><td>Scientifc Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Bâtonnet d’applicateur à bois</td><td>PROMA</td><td>1820060</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Base d’azote de levure sans acides aminés</td><td>BD</td><td>291920</td><td></td></tr></tbody></table>

transformation mitochondriale chez baker

Mitochondrial Transformation in Baker&#39;s Yeast to Study Translation and Respiratory Complex Assembly

La levure de boulanger Saccharomyces cerevisiae est largement utilisée pour comprendre la biologie mitochondriale depuis des décennies. Ce modèle a fourni des connaissances sur les voies mitochondriales essentielles et conservées chez les eucaryotes et les voies spécifiques aux champignons ou aux levures. L’une des nombreuses capacités de S. cerevisiae est la capacité de manipuler le génome mitochondrial, ce qui n’est jusqu’à présent possible que chez S. cerevisiae et l’algue unicellulaire Chlamydomonas reinhardtii. La transformation biolistique des mitochondries de levure nous permet d’introduire des mutations dirigées vers le site, de faire des réarrangements génétiques et d’introduire des rapporteurs. Ces approches sont principalement utilisées pour comprendre les mécanismes de deux processus hautement coordonnés dans les mitochondries : la traduction par les mitoribosomes et l’assemblage de complexes respiratoires et d’ATP synthase. Cependant, la transformation mitochondriale peut potentiellement être utilisée pour étudier d’autres voies. Dans le présent travail, nous montrons comment transformer les mitochondries de levure par bombardement de microprojectiles à grande vitesse, sélectionner et purifier le transformant prévu, et introduire la mutation souhaitée dans le génome mitochondrial.

Ce travail explique comment transformer les mitochondries de levure à l’aide d’une méthode biolistique. Nous montrons également comment sélectionner et purifier les transformants et comment introduire la mutation souhaitée dans la position cible dans le génome mitochondrial.

Transformation mitochondriale chez Baker

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