Name: Perfusion hépatique de rat et isolement des hépatocytes primaires : une procédure ancienne cruciale pour la culture d’organoïdes 3D de pointe (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-22T13:20:00.000+00:00
Duration: 13 min 9 s
Description: Découvrez la perfusion hépatique chez le rat et l'isolement d'hépatocytes primaires pour créer des organoïdes 3D fonctionnels. Cette méthode optimise la culture longue durée des cellules hépatiques.

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<li>Queral, A. E., DeAngelo, A. B., Garrett, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+different+collagenases+on+the+isolation+of+viable+hepatocytes+from+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Effect of different collagenases on the isolation of viable hepatocytes from rat liver.</a> Anal Biochem. 138 (1), 235-237 (1984).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>A83-01- Inhibiteur d’ALK5 IV</td><td>Twin Helix</td><td>&nbsp ; T3031</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>0080085SA</td><td></td></tr><tr><td>CFX Connect Système de détection PCR en temps réel&nbsp ;</td><td>&nbsp ; Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Twin Helix</td><td>T2310</td><td></td></tr><tr><td>Click EdU Alexa 488 kit d’imagerie</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>C10499</td><td></td></tr><tr><td>Collagène, Type I, solution de queue de rat</td><td>Merck</td><td>C3867-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Dexaméthasone&nbsp ;</td><td>Merck</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Merck</td><td>&nbsp ; E9644</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Euroclone</td><td>ECS0180L</td><td></td></tr><tr><td>GELTREX LDEV FREE RGF BME</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A1413202</td><td></td></tr><tr><td>Héparine Sodique 25000 UI/5 ml</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>B01AB01</td><td></td></tr><tr><td>HGF</td><td>Peprotech</td><td>&nbsp ; 100-39H&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Solution insuline-transferrine-sélénium 100x&nbsp ;</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>41400045</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine solution</td><td>Euroclone</td><td>ECB3000D</td><td></td></tr><tr><td>Liver Digest Medium&nbsp ;</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>&nbsp ; 17703-034</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de perfusion hépatique</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>17701038</td><td></td></tr><tr><td>supplément N2</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-acétylcystéine</td><td>Merck</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Merck</td><td>&nbsp ; N-0636</td><td></td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels</td><td>Merck</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>Normocin</td><td>Aurogene</td><td>ant-nr-1</td><td></td></tr><tr><td>Tampon PBS 1X</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A0964,9050</td><td></td></tr><tr><td>Solution de pénicilline-streptomycine 100x</td><td>Euroclone</td><td>ECB3001D</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-296039A</td><td></td></tr><tr><td>Pompe péristaltique</td><td>Ismatec&commerce ; &nbsp ;</td><td>MS-4/12 Pompe</td><td></td>Numérique Reglo</tr><tr><td>TNFa</td><td>Peprotech</td><td>&nbsp ; 300-01A</td><td></td></tr><tr><td>TRI Réactif</td><td>Merck</td><td>T9424</td><td></td></tr><tr><td>Tube&nbsp ;</td><td>Ismatec&commerce ; &nbsp ;</td><td>&nbsp ; ID.2,79mm</td><td></td></tr><tr><td>Williams' E Medium, sans glutamine</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>31415029</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Twin Helix</td><td>T1725</td><td></td></tr></tbody></table>

perfusion hépatique de rat et isolement des hépatocytes primaires : une procédure ancienne cruciale pour la culture d’organoïdes 3d de pointe

Rat Liver Perfusion and Primary Hepatocytes Isolation: An Old Procedure Crucial for Cutting-Edge 3D Organoids Culture

À la fin des procédures de mise en place (étape 6.13), nous avons obtenu un rendement cellulaire allant jusqu’à 1 x 108 cellules par isolement à partir du foie d’environ 300 g d’un rat. La viabilité cellulaire entre 78 % et 97 % a été établie par comptage au bleu de trypan.
Comme déjà décrit dans des études précédentes 1,18,19, les hépatocytes primaires en culture perdent leur morphologie, leurs fonctions hépatiques spécifiques et meurent en quelques jours.
Il est bien connu dans la littérature23,24 que les hépatocytes adultes primaires perdent rapidement la morphologie cuboïdale-hexagonale, se transforment en une forme de « fibroblaste » en quelques jours et meurent. La figure 1 représente les différentes phases : 4 h après le placage sur une plaque recouverte de collagène, les hépatocytes adhèrent à la surface, s’étalent en une monocouche typique montrant une morphologie cuboïde, les bords des cellules sont définis, les jonctions entre les cellules sont linéaires et la surface des cellules est lisse (Figure 1A). Au jour 1, les hépatocytes primaires acquièrent leur forme hexagonale typique et les gouttelettes lipidiques deviennent visibles (Figure 1B). Les jours 2 et 3, les gouttelettes lipidiques augmentent (Figure 1C-1D), tandis que les jours 4 et 5, les cellules accumulent des fibres de stress d’actine (Figure 1E-F). Nous avons également évalué le pourcentage de cellules viables en culture primaire 2D du jour 1 au jour 5 et l’avons comparé à la viabilité avant le placage au jour 0 (Figure 2). Il est possible d’observer une réduction drastique de la viabilité dès les premiers jours de la culture, atteignant 49,5 % (ET 12,7) le jour 1, qui tombe à 45,2 % (ET 18,2) le jour 2 et 33,5 % (ET 0,77) au jour 3. Le pourcentage de cellules viables au jour 4 est déjà de 16,9 % (ET 5,4), tandis qu’au jour 5, il atteint 9,1 % (ET 0,38). Par conséquent, il est évident que la perte de morphologie accompagne une mort cellulaire progressive rapide des hépatocytes adultes en culture 2D.
Des hépatocytes isolés, avant le placage (jour 0), ont montré une expression élevée de l’ARNm des gènes marqueurs hépatiques (ABCD3, ALB, KRT18, PCK1, SERPIN, TDO2) évalués par RT-qPCR (Figure 3). Tous les gènes analysés montrent une diminution de l’expression en fonction du temps de culture dès le jour 1 en culture. Les niveaux d’expression de l’ARNm mettent en évidence la perte fonctionnelle et de viabilité des hépatocytes primaires au cours de la période.
Des hépatocytes isolés ont été placés dans des gouttelettes matricielles 3D et des structures cellulaires organoïdes 3D ont été suivies au fil du temps. Au jour 1 de la culture, des hépatocytes uniques sont en suspension dans les gouttelettes matricielles (Figure 4A). La concentration cellulaire est maintenue intentionnellement faible pour fournir aux hépatocytes suffisamment d’espace pour se développer. De plus, cela nous permet de suivre visuellement la croissance des organoïdes. Les hépatocytes primaires ont montré une division cellulaire dans les premiers jours de culture (Figure 4C). De plus, alors qu’au jour 0, les Hep-Orgs étaient mesurés à 30 μm, le jour 2, les Hep-Org ont presque doublé leurs dimensions, soulignant la croissance de la taille qui s’est maintenue jusqu’au jour 15 (33,08 μm le jour 1 ; 64,86 μm le jour 2 ; 45,06 μm le jour 5 ; 55,19 μm le jour 7 ; 51,93 μm le jour 10 ; 62,90 μm le 15). En ce qui concerne la forme d’Hep-Orgs, alors que le jour 1 ils étaient de forme ronde, ils ont atteint la « forme de grappe de raisin » (typique des organoïdes hépatiques) les jours suivants.
Les hépatocytes mis en plaques dans une matrice 3D restent vivants en culture pendant des semaines, montrant une viabilité de 23 % ±10 % après 15 jours en utilisant le dosage du bleu de trypan (Figure 4B, première rangée). Pour valider la prolifération des souches hépatérologiques chez le rat, un test EdU a été effectué le jour 15 (figure 4D). Néanmoins, la coloration de Hoechst a montré un nombre élevé de cellules uniques plutôt que d’Hep-Orgs, une activité proliférative des hépatocytes (cellules vertes) était présente, même si l’incorporation d’EdU était faible (9% ± 7%) (Figure 4B, deuxième rangée).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66857/66857fig01.jpg"> Figure 1 : Culture 2D d’hépatocytes primaires sur des plaques recouvertes de collagène au fil du temps. Les images ont été prises à un grossissement de 20x avec (A) microscopie à contraste de phase 4 h après le placage, (B) Jour 1, (C) Jour 2, (D) Jour 3, (E) Jour 4, (F) Jour 5. Une barre d’échelle correspondant à 50 μm est signalée dans chaque image. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66857/66857fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66857/66857fig02.jpg"> Figure 2 : Cellules primaires viables en culture 2D sur des plaques recouvertes de collagène. Le graphique montre le pourcentage de cellules viables du jour 1 au jour 5, par rapport aux cellules viables plaquées au jour 0, considérées comme 100 %. Les résultats sont présentés sous forme de répétitions uniques, de moyennes et d’écarts-types de 3 expériences différentes (* valeur p ≤ 0,05 ; ** valeur p ≤ 0,005). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66857/66857fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66857/66857fig03.jpg"> Figure 3 : Expression de l’ARNm des marqueurs hépatiques mesurée par RT-qPCR dans les hépatocytes primaires. Les résultats ont été normalisés sur la β-actine et/ou le GAPDH (gènes de maintien en interne) et sont exprimés par rapport aux hépatocytes primaires prélevés avant l’ensemencement au jour 0, considéré comme 1. Les résultats sont rapportés sous forme de moyenne ± ET d’au moins 3 expériences différentes (**+ valeur p ≤ 0,001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66857/66857fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66857/66857fig04.jpg"> Figure 4 : Culture 3D d’hépatocytes en gouttelettes matricielles au fil du temps. (A) Hépatocytes isolés plaqués dans des gouttelettes matricielles pour les Hep-Org à long terme : sur l’image, les gouttelettes matricielles sont visibles à la surface du puits (cercle rouge = une gouttelette). (B) Pourcentage de cellules viables par le bleu de trypan et de cellules prolifératives par EdU au jour 15 avant le passage. La quantification des cellules positives EdU a été réalisée par le logiciel ImageJ2. Les résultats sont exprimés en pourcentage sous forme de moyenne±ET d’au moins 3 expériences différentes. (C) Images en contraste de phase de la culture 3D du rat Hep-Orgs à différents jours de croissance dans la culture 3D : jour 1, 2, 5, 7, 10, 15. Grossissement de l’image 20X. Une barre d’échelle correspondant à 50 μm est signalée dans chaque image. (D) Essai d’incorporation EdU des Hep-Orgs chez le rat le jour 15. Grossissement de l’image 20X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66857/66857fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Tableau 1 : Tampons et composition des supports Le tableau indique le nom et les composants (avec leur concentration finale) de tous les tampons et des milieux cellulaires utilisés dans le protocole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66857/2024.05.08_Table%201.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau 2 : Liste des amorces pour rats. Le tableau présente la liste des amorces utilisées pour les expériences RT-qPCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66857/2024.05.08%20Table%202.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>

Perfusion hépatique de rat et isolement des hépatocytes primaires : une procédure ancienne cruciale pour la culture d’organoïdes 3D de pointe

Primary hepatocytes are a commonly used tool for in vitro liver-related studies. However, the maintenance of these cells has always been a challenge due ...

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Le but du présent protocole est d’obtenir la grande viabilité et à haut rendement des hépatocytes et des cellules endothéliales sinusoïdales du foie. Ceci est accompli en perfusant le foie avec une solution de collagènase de type IV via la veine porte, suivie d’une centrifugation différentielle afin d’obtenir des hépatocytes et des cellules endothéliales sinusoïdales.

Purification des hépatocytes et des cellules endothéliales sinusoïdales foie de souris Perfusion

Présenté ici est un protocole pour l'isolement des hépatocytes de souris des foies adultes de souris utilisant une technique modifiée de perfusion de collagène. On décrit également la culture à long terme des hépatocytes dans un arrangement 3D de sandwich de collagène aussi bien que l'immunolabeling des composants cytosquelettiques pour étudier la formation canaliculaire biliaire et sa réponse au traitement.

Isolement et 3D Collagen Sandwich Culture of Primary Mouse Hepatocytes to Study the Role of Cytoskeleton in Bile Canalicular Formation In Vitro

Les hépatocytes primaires sont un outil précieux pour étudier la réponse hépatique et le métabolisme in vitro. En utilisant des réactifs disponibles dans le commerce, un protocole amélioré d’efficacité en termes de temps et de main-d’œuvre pour l’isolement des hépatocytes primaires chez la souris a été développé.

Un protocole amélioré d’efficacité en termes de temps et de main-d’œuvre pour l’isolement des hépatocytes primaires chez la souris

Ce protocole détaille l’utilisation d’un cathéter intraveineux spécial, d’un tube jetable stérile standardisé, d’un contrôle de la température complété par une surveillance en temps réel et d’un système d’alarme pour la procédure de perfusion de collagénase en deux étapes afin d’améliorer la cohérence de la viabilité, du rendement et de la fonctionnalité des hépatocytes primaires isolés chez le rat.

Isolement des hépatocytes primaires de rat avec contrôle de perfusion multiparamétrique

Un système de culture organoïde 3D ex vitro à long terme a été établi à partir d’hépatocytes de souris. Ces organoïdes peuvent être passés et génétiquement manipulés par l’infection à lentivirus de la construction shRNA/ectopique, la transfection de siRNA et l’ingénierie CRISPR-Cas9.

Établissement et manipulation génétique d’organoïdes d’hépatocytes murins

Nous présentons ici une méthode robuste de perfusion in situ du foie de souris pour étudier la régulation aiguë et directe du métabolisme hépatique sans perturber l’architecture hépatique mais en l’absence de facteurs extra-hépatiques.

La production hépatique de glucose, l’uréagénèse et la lipolyse quantifiées à l’aide du modèle de foie de souris perfusé

Découvrez la perfusion hépatique chez le rat et l'isolement d'hépatocytes primaires pour créer des organoïdes 3D fonctionnels. Cette méthode optimise la culture longue durée des cellules hépatiques.

Perfusion hépatique de rat et isolement des hépatocytes primaires : une procédure ancienne cruciale pour la culture d’organoïdes 3D de pointe (Vidéo) | JoVE Journal

Perfusion hépatique de rat et isolement des hépatocytes primaires : une procédure ancienne cruciale pour la culture d’organoïdes 3D de pointe

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