Name: Séquençage de l’ARN unicellulaire d’embryons entiers de souris mutantes : de l’épiblaste à la fin de la gastrulation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T14:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Découvrez un protocole de séquençage ARN unicellulaire pour embryons de souris mutantes durant la gastrulation. Cette méthode permet d'analyser les décisions précoces de destin cellulaire et facilite l'étude des mutations de lignée.

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Nous remercions le centre de génomique du Fox Chase Cancer Center et les membres du laboratoire du Dr Johnathan Whetstine, Zach Gray, Madison Honer et Benjamin Ferman, pour leur soutien technique aux expériences de séquençage. Nous remercions les membres du laboratoire du Dr Estaras et d’Alex Morris, un étudiant diplômé en rotation qui a contribué à l’analyse initiale des études sur cellule unique. Ce travail est financé par les subventions des NIH R01HD106969 et R56HL163146 à Conchi Estaras. De plus, Elizabeth Abraham a été soutenue par la subvention de formation T32 5T32HL091804-12.

Isolement et génotypage d’un embryon de souris gaztrulateur pour le séquençage unicellulaire

<ol><li>Arias, A. M., Marikawa, Y., Moris, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastruloids%3A+Pluripotent+stem+cell+models+of+mammalian+gastrulation+and+embryo+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Gastruloids: Pluripotent stem cell models of mammalian gastrulation and embryo engineering.</a> Dev Biol. 488, 35-46 (2022).</li>
<li>Kim, Y., Kim, I., Shin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+era+of+stem+cell+and+developmental+biology%3A+from+blastoids+to+synthetic+embryos+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">A new era of stem cell and developmental biology: from blastoids to synthetic embryos and beyond.</a> Exp Mol Med. 55 (10), 2127-2137 (2023).</li>
<li>Pijuan-Sala, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+molecular+map+of+mouse+gastrulation+and+early+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single-cell molecular map of mouse gastrulation and early organogenesis.</a> Nature. 566 (7745), 490-495 (2019).</li>
<li>Mittnenzweig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-embryo%2C+single-cell+time-resolved+model+for+mouse+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A single-embryo, single-cell time-resolved model for mouse gastrulation.</a> Cell. 184 (11), E22 P2825-P2842 (2021).</li>
<li>Bardot, E. S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+gastrulation%3A+Coordination+of+tissue+patterning%2C+specification+and+diversification+of+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Mouse gastrulation: Coordination of tissue patterning, specification and diversification of cell fate.</a> Mech Dev. 163, 103617(2020).</li>
<li>Argelaguet, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-omics+profiling+of+mouse+gastrulation+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multi-omics profiling of mouse gastrulation at single-cell resolution.</a> Nature. 576 (7787), 487-491 (2019).</li>
<li>Chan, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+recording+of+mammalian+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular recording of mammalian embryogenesis.</a> Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).</li>
<li>Mohammed, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+landscape+of+transcriptional+heterogeneity+and+cell+fate+decisions+during+mouse+early+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Single-cell landscape of transcriptional heterogeneity and cell fate decisions during mouse early gastrulation.</a> Cell Rep. 20 (5), 1215-1228 (2017).</li>
<li>Lescroart, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+earliest+step+of+cardiovascular+lineage+segregation+by+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Defining the earliest step of cardiovascular lineage segregation by single-cell RNA-seq.</a> Science. 359 (6380), 1177-1181 (2018).</li>
<li>Scialdone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+early+mesoderm+diversification+through+single-cell+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Resolving early mesoderm diversification through single-cell expression profiling.</a> Nature. 535 (7611), 289-293 (2016).</li>
<li>Chromium Next GEM single cell 3' reagent kits v3.1: User guide. 10X Genomics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-single-cell-3-reagent-kits-user-guide-v-3-1-chemistry">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-single-cell-3-reagent-kits-user-guide-v-3-1-chemistry</a> (2024).</li>
<li>NextSeq 1000/2000 Sequencing v2.0 Protocol. Illumina. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://support-docs.illumina.com/SW/ClarityLIMS-INT/Content/SW/ClarityLIMS/Integrations/NextSeq10002000Intv20Config.htm">https://support-docs.illumina.com/SW/ClarityLIMS-INT/Content/SW/ClarityLIMS/Integrations/NextSeq10002000Intv20Config.htm</a> (2024).</li>
<li>Dai, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET-mediated+DNA+demethylation+controls+gastrulation+by+regulating+Lefty-Nodal+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TET-mediated DNA demethylation controls gastrulation by regulating Lefty-Nodal signalling.</a> Nature. 538, 528-532 (2016).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((editing-mediated+one-step+inactivation+of+the+Dnmt+gene+family+reveals+critical+roles+of+DNA+methylation+during+mouse+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">editing-mediated one-step inactivation of the Dnmt gene family reveals critical roles of DNA methylation during mouse gastrulation.</a> Nat Commun. 14 (1), 2922(2023).</li>
<li>Saga, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MesP1+is+expressed+in+the+heart+precursor+cells+and+required+for+the+formation+of+a+single+heart+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">MesP1 is expressed in the heart precursor cells and required for the formation of a single heart tube.</a> Development. 126 (15), 3437-3447 (1999).</li>
<li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+single-cell+RNA+sequencing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods.</a> Mol Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Cet article présente un pipeline robuste pour l’obtention de suspensions de cellules uniques et de noyaux de haute qualité à partir d’embryons de souris gaztrulants, spécialement conçues pour faciliter les études sur les mécanismes de spécification du destin cellulaire dans le développement précoce. Cette méthode comble une lacune cruciale dans le domaine de la gastrulation en optimisant l’analyse des embryons nécessitant des génotypes, tels que le sexe ou les gènes somatiques. En utilisant des modèles de souris à mutation génétique et en utilisant le séquençage unicellulaire à haute résolution sur des embryons de souris entiers, ce pipeline peut encore améliorer la compréhension des profils d’expression génique de la gastrula précoce de la souris. Cette méthode démontre la faisabilité de l’utilisation d’un modèle murin de mutation génétique par un système de recombinase Cre pour obtenir des cellules et des noyaux de haute qualité à des moments de développement précoces pour les omiques unicellulaires. Cette méthode a évolué à la suite de multiples tentatives, au cours desquelles les échantillons ne répondaient pas aux normes de qualité requises pour la préparation et le séquençage des banques. La méthodologie expliquée génère suffisamment de cellules/noyaux à partir d’embryons inférieurs à E8 grâce à l’optimisation de trois étapes critiques : (1) des grossesses synchronisées pour augmenter le nombre d’embryons, (2) le génotypage le jour même pour éviter la congélation/décongélation, et (3) l’évaluation de la viabilité des cellules/noyaux pour éviter le séquençage des cellules mourantes. Ce protocole donne des résultats positifs avec l’ARNASeq unicellulaire, mais les suspensions de cellules ou de noyaux obtenues dans ce protocole peuvent être traitées dans d’autres plateformes de séquençage, où la viabilité cellulaire est le facteur limitant, telles que smart-seq, drop-seq et cel-seq16.
Au niveau de l’embryon E7, le nombre de cellules peut varier en fonction de la souche et du génotype du mutant. En règle générale, un embryon E7 peut aller de centaines à quelques milliers de cellules, et l’obtention d’embryons avec le génotype souhaité est un défi, avec seulement 1 ou 2 embryons par mère enceinte répondant aux critères. Ce protocole permet de capturer environ 300 cellules viables par embryon E7 pour l’analyse sur cellule unique. Les tentatives d’augmenter la taille du pool d’embryons en congelant des embryons de mères enceintes à des jours différents se sont avérées infructueuses, car la viabilité cellulaire a été gravement compromise après la décongélation, même avec l’ajout d’agents de cryoconservation. Pour relever ce défi, la stratégie d’élevage et de synchronisation des mères gestantes a été optimisée. Pour augmenter les risques d’isolements multiples, il est recommandé d’utiliser des souris femelles qui ont mis bas 1 à 2 fois avant de se reproduire pour l’isolement, car elles sont plus susceptibles d’avoir des portées plus grandes. La surveillance du cycle œstral de la femelle est cruciale ; L’accouplement est plus susceptible de se produire pendant les stades du proestrus et de l’œstrus. Si des difficultés de reproduction surviennent, il sera également utile de changer de partenaire de reproduction après quatre jours si aucun bouchon n’est produit.
Il est important de noter que cette méthode a une limite : elle repose sur des plugs observés, et même si un plug est observé, il ne garantit pas la grossesse mais indique uniquement une activité sexuelle. Par conséquent, l’augmentation du nombre de bouchons observés par jour augmentera la probabilité d’avoir plus d’une mère gestante par jour et plus de génotypes positifs. Ce protocole a démontré la faisabilité d’utiliser des stades embryonnaires allant de E7 à E7.75 comme preuve de concept lors de la gastrulation. Cependant, ce pipeline peut être appliqué des embryons E6.5 à E8. Pour les embryons E6.5, il est recommandé d’augmenter le nombre de grossesses synchronisées pour obtenir au moins 7 embryons avec le génotype souhaité à regrouper. Au lieu de cela, pour les embryons E8, augmentez la quantité de trypsine utilisée pour dissocier chaque embryon à ~ 40 μL au lieu de 20 μL. L’objectif est d’obtenir une suspension cellule/noyaux dans une plage de concentration de 700 à 1200 cellules par μl avant de procéder au partitionnement.
Avoir une bonne viabilité cellulaire est essentiel pour le succès du séquençage unicellulaire. Dans la conception de la puce microfluidique fournie par les fabricants, les cellules individuelles sont partitionnées en billes de gel en émulsion (GEM) au sein d’une puce contenant des billes de gel à code-barres connues11. Cependant, une limitation notable de ce processus est que les cellules uniques de haute et de mauvaise qualité peuvent être partitionnées. Même avec un nombre adéquat de cellules vivantes (c’est-à-dire 1000 cellules/μL), si la viabilité de la suspension est faible (c’est-à-dire 1000 cellules vivantes et 1000 cellules mortes, ce qui donne une viabilité de 50%), l’expérience de séquençage échouera probablement. Pour des résultats optimaux, il est recommandé de viser une viabilité d’environ 90%. Si la viabilité cellulaire se situe entre 60 % et 89 %, des mesures spécifiques peuvent être prises pour améliorer la viabilité de l’expérience. Cependant, si la viabilité cellulaire est inférieure à 60 %, il est fortement déconseillé de poursuivre l’expérience. La raison en est que les cellules mourantes seront « capturées » dans le gel de partitionnement, et que la préparation ultérieure de la banque et les contrôles de qualité se dérouleront sans problème notable. Cependant, l’expérience de séquençage proprement dite peut échouer complètement, car la plupart des lectures de séquençage cartographieront les gènes mitochondriaux, ribosomals ou d’apoptose, indiquant des signes de faible viabilité cellulaire dès le départ. Les données présentées dans cet article illustrent un pipeline pour le séquençage unicellulaire d’embryons de souris gaztrulants avec des cellules de haute qualité. Cette méthodologie peut être appliquée à la compréhension de nombreux modèles murins de mutation génétique différents au cours du développement.

La gastrulation est un processus fondamental nécessaire au développement normal. Ce processus rapide et dynamique se produit lorsque les cellules pluripotentes se transforment en précurseurs spécifiques à la lignée qui définissent la formation des organes. Pendant des années, la gastrulation a longtemps été définie comme la formation de trois populations largement homogènes : le mésoderme, l’ectoderme et l’endoderme. Cependant, les technologies à haute résolution et un nombre émergent de modèles de cellules souches embryonnaires 1,2 révèlent une hétérogénéité sans précédent parmi les couches germinales précoces 3,4. Cela suggère qu’il reste encore beaucoup à découvrir sur les mécanismes régulant les populations cellulaires distinctes de la gastrula. Le développement embryonnaire de souris a été l’un des meilleurs modèles pour étudier les décisions précoces du destin cellulaire pendant la gastrulation 3,5. La gastrulation chez la souris est rapide, car l’ensemble du processus de gastrulation se produit dans les 48 heures, du jour embryonnaire E6.5 à E85.
Les progrès récents des technologies unicellulaires ont permis une cartographie détaillée du développement embryonnaire de souris de type sauvage, fournissant un aperçu complet des paysages cellulaires et moléculaires des embryons pendant la gastrulation 3,4,6,7,8. Cependant, l’analyse des embryons mutants à ces stades est moins fréquente et souvent limitée aux populations triées par FACS 9,10. La rareté de la littérature reflète les défis techniques associés à la manipulation et à la préparation de cellules uniques d’embryons gastrulants qui nécessitent un génotypage. La capture du processus dynamique de gastrulation peut poser des défis en raison de sa nature rapide, en particulier pour comprendre les embryons mutants. Le moment et la synchronisation des grossesses sont essentiels, car même de légères différences entre les grossesses programmées peuvent être interprétées à tort comme un phénotype développemental résultant du gène mutant. Cela devient particulièrement important lorsque le gène mutant influence le processus de gastrulation13,14. Dans cette étude, des lignes directrices sont établies pour obtenir des grossesses synchronisées par la visualisation des bouchons vaginaux (c’est-à-dire la masse de liquide séminal coagulé formée dans le vagin de la femelle après l’accouplement). De plus, une stratégie est conçue pour obtenir des données unicellulaires robustes à partir d’embryons gastrulants mutants de E6.5 à E8. Cette stratégie est conçue pour surmonter les contraintes liées au faible nombre d’embryons avec le génotype souhaité par grossesse et à la diminution de la viabilité causée par la congélation-décongélation d’embryons ou de cellules.
Cet article décrit une méthodologie optimisée depuis l’établissement de grossesses programmées via des bouchons vaginaux jusqu’au séquençage final de cellules uniques/noyaux. Cette méthode explique comment augmenter le nombre de grossesses synchronisées pour obtenir un plus grand nombre d’embryons avec le génotype souhaité, des isolements de cellules/noyaux pour améliorer la viabilité des cellules et un protocole de génotypage le jour même. Ce manuscrit décrit également le processus d’isolement des embryons à différents points temporels de la gastrulation. La méthodologie permet d’augmenter le nombre de cellules/noyaux embryonnaires viables finaux pour le séquençage, garantissant ainsi des données de séquençage de haute qualité. Par conséquent, cette méthode ouvrira la porte à des études unicellulaires d’embryons gaztrulants nécessitant un génotypage.

<table><tbody><tr><td>Boîte de Pétri 10 cm</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-202</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro ; L Reach Barrier Tip</td><td>Genesee Scientific</td><td>23-430</td><td></td></tr><tr><td>20 &micro ; L Reach Barrier Tip</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-404</td><td></td></tr><tr><td>300 &micro ; L Reach Barrier Tip</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-415</td><td></td></tr><tr><td>37 &micro ; m Passoire réversible, petite</td><td>cellule souche</td><td>27215</td><td></td></tr><tr><td>6 cm Boîte de Pétri</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-260</td><td></td></tr><tr><td>Tubes PCR à 8 bandelettes</td><td>Genesee Scientific</td><td>27-125U</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Apex Bioresearch Product</td><td>20-102</td><td></td></tr><tr><td>Benchmark Scientific BSH300 MyBlock Mini Bain Sec</td><td>Genesee</td><td>31-437</td><td></td></tr><tr><td>Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK Hermle Microcentrifugeuse réfrigérée</td><td>Genesee</td><td>33-759R</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Contrôleur de chrome</td><td>10X</td><td>PN-1000127</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1</td><td>10X</td><td>PN-1000269</td><td></td></tr><tr><td>Countess 3 Compteur de cellules automatisé</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>AMQAX2000</tr><tr><td>Countess Cell Couning Chamber Lames</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>D1000 Réactifs</td><td>Agilent</td><td>5067-5583</td><td></td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BN2006</td><td></td></tr><tr><td>DirectPCR sac vitellin</td><td>Viagen</td><td>201-Y</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol ( DTT)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0861</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind Tube 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Dubecco’s Modificiation of Eagle’s Medium (DMEM, 1x)</td><td>CORNING</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s PBS</td><td>GenClone</td><td>25-508</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Fine Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5SF Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Koptec</td><td>V1401</td><td></td></tr><tr><td>EVOS M7000 Système d’imagerie</td><td>Invitrogen</td><td>AMF7000</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux fins - Sharp</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-11</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq G2 Green Master Mix</td><td>Promega</td><td>M7823</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11049-10</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AC223211000</td><td></td></tr><tr><td>MiniAmp Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>A37834</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq 1000/2000 P2 Reagents (100 cycles) v3</td><td>Illumina</td><td>20046811</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq2000</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon SMZ 1000 Stéréomicroscope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nondiedt P40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Eau sans nucléase</td><td>GenClone</td><td>25-511</td><td></td></tr><tr><td>Tube optique 8x bande (401428)</td><td>Agilent</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>Capuchon de tube optique 8x bande (401425)</td><td>Agilent</td><td>401425</td><td></td></tr><tr><td>Poséidon 31-511, HS24 Microcentrifugeuse, avec 24 rotors de 1,5/2,0 ml, 1 centrifugeuse/unité</td><td>Genesee</td><td>31-511</td><td></td></tr><tr><td>Protéinase K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6556</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA Kits de dosage</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Flex 3</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de RNase</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-141-368</td><td></td></tr><tr><td>Pince à motif standard</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Station de bande Conseils de chargement</td><td>Agilent</td><td>5067-5598</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation 4150</td><td>Agilent</td><td>G2992AA</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCL (Ph7)</td><td>Qualité Biologique</td><td>351-007-101</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain 0.4 %</td><td>Theromo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Tryple Express</td><td>Gibco</td><td>12604-021</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bio-Rad</td><td>1662404</td><td></td></tr><tr><td>Mélangeur Vortex IKA MS3 avec adaptateur de plaque d’échantillonnage à 96 puits</td><td>IKA</td><td>3617000</td><td></td></tr></tbody></table>

séquençage de l’arn unicellulaire d’embryons entiers de souris mutantes : de l’épiblaste à la fin de la gastrulation

Single-Cell RNA Sequencing of Mutant Whole Mouse Embryos: From the Epiblast to the End of Gastrulation

Au cours de la dernière décennie, les approches unicellulaires sont devenues la référence pour l’étude de la dynamique de l’expression des gènes, de l’hétérogénéité cellulaire et des états cellulaires au sein des échantillons. Avant les progrès de la cellule unique, la faisabilité de capturer le paysage cellulaire dynamique et les transitions cellulaires rapides au cours du développement précoce était limitée. Dans cet article, un pipeline robuste a été conçu pour effectuer l’analyse de cellules uniques et de noyaux sur des embryons de souris du jour embryonnaire E6.5 à E8, correspondant au début et à la fin de la gastrulation. La gastrulation est un processus fondamental au cours du développement qui établit les trois couches germinales : mésoderme, ectoderme et endoderme, qui sont essentielles à l’organogenèse. Il existe une littérature abondante sur les omiques unicellulaires appliquées aux embryons périgastrulants de type sauvage. Cependant, l’analyse unicellulaire d’embryons mutants est encore rare et souvent limitée aux populations triées par FACS. Cela est dû en partie aux contraintes techniques associées à la nécessité du génotypage, aux grossesses programmées, au nombre d’embryons avec les génotypes souhaités par grossesse et au nombre de cellules par embryon à ces stades. Nous présentons ici une méthodologie conçue pour surmonter ces limites. Cette méthode établit des lignes directrices en matière de reproduction et de grossesse chronométrée afin d’augmenter les chances de grossesses synchronisées avec les génotypes souhaités. Les étapes d’optimisation du processus d’isolement des embryons couplées à un protocole de génotypage le jour même (3 h) permettent de réaliser des cellules uniques à base de microgouttelettes le même jour, garantissant ainsi une grande viabilité des cellules et des résultats robustes. Cette méthode comprend en outre des lignes directrices pour l’isolement optimal des noyaux à partir d’embryons. Ainsi, ces approches augmentent la faisabilité des approches unicellulaires d’embryons mutants au stade de la gastrulation. Nous prévoyons que cette méthode facilitera l’analyse de la façon dont les mutations façonnent le paysage cellulaire de la gastrula.

La méthodologie conçue dans cet article est spécifiquement destinée à améliorer la préparation d’échantillons d’embryons pour les omiques unicellulaires de E6.5 à E8. Ce pipeline robuste se compose de cinq étapes principales : les grossesses synchronisées, les isolements d’embryons, le génotypage le jour même, la dissociation cellulaire et l’évaluation de la viabilité cellulaire (Figure 1A). Bien que les données présentées se concentrent sur des points temporels de E7 à E7.5, elles peuvent être appliquées à des embryons jusqu’à E8 (Figure 1B) avec de petites variations dans la procédure (voir les notes tout au long du protocole). Des grossesses synchronisées ont été obtenues en plaçant deux souris femelles dans une cage avec une souris mâle. Les bouchons vaginaux ont été vérifiés tous les matins avant 10 heures, et si un bouchon était observé, il était considéré comme E0,5 à midi ce jour-là (figure 2A). Dans cette étude, les conditions optimales pour les mottes nécessitaient qu’une souris femelle au stade de l’œstrus ou du proestrus soit accouplée à un mâle ayant déjà placé plusieurs mottes lors d’une reproduction antérieure (figure 2B). Seuls les bouchons évidents ont été envisagés pour l’isolement des embryons (figure 2C).
Le calendrier de développement a été estimé selon le calendrier de la figure 2A. Pour E7.5, le curage embryonnaire a débuté à 12 h le 7e jour suivant le jour de la détection d’un bouchon. La figure 3 illustre un isolement embryonnaire réussi à E7.5. Après l’euthanasie de la mère enceinte, la corne utérine a été disséquée, le gonflement décidual a été coupé individuellement, révélant l’embryon, et le sac vitellin a été isolé pour le génotypage (Figure 3).
Le génotypage le jour même a été effectué dans les 3 heures suivant l’isolement de l’embryon en suivant les étapes de la figure 4A. Les embryons ont été conservés sur glace pendant le processus de génotypage afin de préserver leur intégrité. Ne congelez pas les embryons, car cela diminuerait le nombre de cellules viables par embryon. Les figures 4B et C montrent le sac vitellin viscéral, le sac endodermique pariétal et le cône ectoplacentaire avec le sang maternel associé. Le sac vitellin viscéral a été utilisé pour le génotypage (Figure 4C). Après avoir digéré le sac vitellin, le mélange PCR a été préparé et la réaction PCR a été exécutée. Le produit PCR résultant a ensuite été séparé sur un gel d’agarose. La figure 4D montre les tailles de fragments attendues pour les allèles LoxP et de type sauvage (597 pb et 498 pb, respectivement) et l’allèle Cre (650 pb). La figure 4E présente un exemple de génotypage du sac vitellin à partir de 6 embryons obtenus à partir de couples reproducteurs porteurs des allèles Cre et LoxP (flox). Les gels représentent les produits PCR des allèles Cre et LoxP dans les 6 embryons analysés. Les embryons numéros 2 et 5 portent 2 allèles flox et 1 allèle cre ; par conséquent, ils sont considérés comme des embryons KO conditionnels (Figure 4E, points rouges). Les embryons 1 et 3 ont 2 allèles flox mais sont négatifs pour Cre ; Par conséquent, ils sont considérés comme des témoins de flox. L’embryon 4 a 2 allèles flox et une faible bande pour l’allèle Cre, ce qui donne un génotype « incertain ». Cet embryon n’a pas fait l’objet d’un traitement ultérieur (l’expérimentateur peut également envisager de répéter le génotypage ou de procéder à une validation secondaire du KO conditionnel à l’aide de cellules exprimant Cre). Il est important de noter que le pilote Cre utilisé dans cette expérience n’est pas exprimé dans le sac vitellin viscéral15 ; par conséquent, les allèles LoxP n’apparaissent pas décalés sur le gel des embryons Cre-positifs par rapport aux embryons Cre-négatifs.
Le nombre de cellules et une bonne viabilité sont nécessaires à la réussite d’une expérience sur cellule unique. Les suspensions à faible viabilité cellulaire, avec un pourcentage élevé de cellules mortes, d’agglomération ou de débris importants ne conviennent pas à un traitement ultérieur. Les conditions optimales sont de 700 à 1200 cellules vivantes par microlitre et une viabilité de &gt;90%. La figure 5A présente un panel illustrant à la fois une viabilité cellulaire bonne et sous-optimale. Les mêmes critères peuvent également être appliqués pour l’isolement des noyaux, comme le montre la figure 5B. Cependant, il est crucial de noter que l’évaluation du bleu de trypan diffère de celle des cellules et des noyaux : les cellules viables n’incorporent pas le bleu de trypan, contrairement aux noyaux viables. Si la suspension des cellules/noyaux est optimale (viabilité de &gt;90 %), procéder au partitionnement des cellules uniques à l’aide d’une puce microfluidique en suivant les procédures du fabricant11. Des options de dépannage sont fournies pour les suspensions où la viabilité des cellules/noyaux est comprise entre 60 % et 89 %, comme le montre la figure 5C. Si la viabilité, quel que soit le nombre total de cellules, tombe en dessous de 60 %, envisagez d’arrêter l’expérience.
L’ensemble du pipeline, de l’abattage du barrage à la construction de la bibliothèque, prend un total de 8 heures le même jour (c.-à-d. que les étapes 2 à 6 du protocole doivent être effectuées le même jour). Suivant les procédures décrites dans les procédures des fabricants de cellules uniques11, des constructions de banques ont été préparées pour le séquençage de l’ARN unicellulaire à l’aide de cellules obtenues à partir d’embryons E7, avec une viabilité cellulaire allant de conditions sous-optimales à optimales, visant une récupération cible estimée de 2000 cellules (Figure 6). La figure 6A illustre une distribution représentative de la taille des fragments des banques de scRNAseq dans des conditions sous-optimales et optimales, indiquant que la viabilité cellulaire n’affecte pas de manière significative l’ensemble du processus de partitionnement d’une seule cellule. La distribution de la taille des fragments variait entre 400 et 500 pb. Cela indique que des conditions sous-optimales n’affectent pas le processus de préparation de la bibliothèque. La figure 6B montre les résultats d’expériences de RNAseq sur cellule unique réussies et sous-optimales. Après le séquençage, des contrôles de qualité ont été effectués sur les échantillons et ont permis d’observer que, dans les cas où la viabilité cellulaire n’était pas optimale, seulement 10 % des cellules ont été séquencées avec succès. En revanche, les échantillons optimaux présentaient un pourcentage plus élevé, avec 91 % du total des cellules séquencées. Ceci est encore prouvé par les graphiques à code-barres, indiquant que les conditions sous-optimales ont un bruit de fond plus important par rapport aux conditions optimales. Une analyse de clustering a été effectuée pour les deux expériences et a révélé que 9 clusters étaient dans les conditions optimales et 4 dans les conditions sous-optimales. L’annotation des grappes à l’aide de marqueurs connus3 a révélé les types de cellules attendus dans les embryons E7, y compris l’épiblaste et la strie primitive (Figure 6B). Les annotations de grappes dans l’expérience sous-optimale n’ont pas été possibles en raison du manque d’enrichissement en marqueurs connus pour chaque grappe. Cela souligne l’importance de cellules de haute qualité nécessaires à la représentation correcte des données au cours de ces étapes de développement.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig1v2.jpg"> Figure 1 : Optimisation de la gastrulation d’embryons entiers de souris pour le séquençage de l’ARN unicellulaire. (A) Schéma de flux de travail pour l’obtention de cellules et/ou de noyaux de haute qualité à partir d’embryons en cours de gaztrulation. (B) Images représentatives en fond clair et schéma3 adapté d’embryons de souris lors de la gastrulation de E7 à E8. Barre d’échelle : 125 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig1v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig2v2.jpg"> Figure 2 : Stratégie pour des grossesses synchronisées efficaces pour l’isolement des embryons pendant la gastrulation. (A) Schéma de principe indiquant le pipeline pour les grossesses programmées et un calendrier décrivant les délais entre la détection du bouchon et l’isolement de l’embryon pour l’analyse de phases spécifiques de la gastrulation. (B) Images représentatives des phases du cycle de l’œstrus chez les souris femelles. Les phases les plus réceptives à la reproduction sont indiquées. (C) Schéma illustrant comment vérifier la présence de bouchons vaginaux et exemples d’ouvertures vaginales sans bouchon, de plug-in partiel ou d’un bon bouchon, à prendre en compte pour l’isolement des embryons. Les ouvertures vaginales sont zoomées sous chaque image. Le plug (sperme coagulé dans l’ouverture du vagin) est mis en évidence par une flèche rouge pointant vers lui. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig2v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig03.jpg"> Figure 3 : Dissection et génotypage d’embryons E7.5 pour le séquençage de l’ARN unicellulaire. Diagrammes schématiques et images du processus d’isolement des embryons E7.5 et de dissection du sac vitellin viscéral. La flèche jaune indique l’utérus de la mère enceinte, et le cercle pointillé jaune indique l’emplacement de l’embryon. Les lignes pointillées représentent les zones qui ont été coupées lors de la dissection. « M » désigne l’extrémité mésométriale, tandis que « AM » désigne l’extrémité anti-mésométriale. Les barres d’échelle dans les images stéréoscopiques sont de 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig04.jpg"> Figure 4 : Génotypage le jour même des sacs vitellins à partir d’embryons de souris en gastrulation. (A) Schéma du flux de travail pour le génotypage le jour même des sacs vitellins. (B) Image représentative du sac endodermique pariétal et du cône ectoplacentaire avec le sang maternel associé. (C) Sac vitellin viscéral chez les embryons E7.5 mis en évidence par la ligne pointillée. Barre d’échelle : 200 μm. (D) Gels représentatifs de type sauvage (+/+), hétérozygote (Flox/+) et flox homozygote (Flox/Flox), et génotypage Cre (Mesp1cre15) avec tailles de fragments d’ADN observées. (E) Les résultats du génotypage le jour même pour les allèles Cre et flox des sacs vitellins de 6 embryons (1-6) sont fournis. Les deux embryons avec un génotypage flox/flox et Cre négatif (-) sont des témoins flox (points bleus), tandis que ceux avec un génotypage flox/flox et Cre positif (+) sont des KO conditionnels (points rouges). L’embryon 4 n’est pas optimal en raison de la faible bande Cre (flox/flox et Cre-unclear) et est donc exclu du traitement ultérieur. Les embryons ayant le même génotype sont regroupés et traités pour le séquençage de l’ARN sur cellule unique. Notez que la présence de l’allèle Cre dans le sac vitellin n’affecte pas la taille des bandes de flox, car le Cre utilisé (Mesp1cre) n’est pas exprimé dans le sac vitellin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig05.jpg"> Figure 5 : Évaluation de la qualité cellulaire et de la viabilité des noyaux. (A) Images représentatives des conditions optimales et sous-optimales de viabilité cellulaire à partir d’embryons E7.5. (B) Images représentatives des conditions optimales et sous-optimales de viabilité des noyaux à partir d’embryons E8 (C) Schéma de dépannage indiquant des solutions potentielles pour aider à augmenter la viabilité des cellules avant de commencer le partitionnement unicellulaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig06.jpg"> Figure 6 : Séquençage de l’ARN unicellulaire d’embryons de souris E7. (A) Trace représentative de la distribution de la taille des fragments pour les banques de séquençage d’ARN unicellulaire d’embryons de souris E7 pour des conditions de viabilité cellulaire sous-optimales et optimales, le pic principal se situant près de 400-500 pb. Notez que les traces sont similaires entre ces conditions, ce qui indique que la viabilité cellulaire n’affecte pas les contrôles de qualité de la bibliothèque. (B) Analyse des résultats du séquençage de l’ARN unicellulaire pour les embryons de souris E7 dans des conditions sous-optimales et optimales montrant la récupération des cibles observée, le classement des codes-barres et le regroupement des types de cellules par le biais d’une distribution UMAP (Uniform Manifold Approximation and Projection). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="4">Tampon de lyse</td>
		</tr><tr><td>Nom du réactif</td>
			<td>Concentration des actions</td>
			<td>Concentration finale</td>
			<td>Volume total 1 mL</td>
		</tr><tr><td>Tris-HCL (Ph7)</td>
			<td>1 M</td>
			<td>10 millions d’euros</td>
			<td>10 μL</td>
		</tr><tr><td>NaCl</td>
			<td>5 M</td>
			<td>10 millions d’euros</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr><tr><td>MgCl2</td>
			<td>0,1 M</td>
			<td>3 millions d’euros</td>
			<td>3 μL</td>
		</tr><tr><td>Préadolescent-20</td>
			<td>20%</td>
			<td>0.10%</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>Non diedt P40</td>
			<td>10%</td>
			<td>0.10%</td>
			<td>10 μL</td>
		</tr><tr><td>Digitonine</td>
			<td>5%</td>
			<td>0.01%</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr><tr><td>La TNT</td>
			<td>1 M</td>
			<td>1 million d’euros</td>
			<td>1 μL</td>
		</tr><tr><td>Inhibiteur de la RNase</td>
			<td>40 U/μL</td>
			<td>1 U/μL</td>
			<td>25 μL</td>
		</tr><tr><td>Eau sans nucléases</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>924 μL</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Tampon de lavage</td>
		</tr><tr><td>Nom du réactif</td>
			<td>Concentration des actions</td>
			<td>Concentration finale</td>
			<td>Volume total 1 mL</td>
		</tr><tr><td>BSA dans PBS</td>
			<td>10%</td>
			<td>1%</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr><tr><td>PBS</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>900 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Isolement des noyaux, tampon de lyse et composition du tampon de lavage.

Cet article établit un pipeline pour des suspensions de cellules uniques et de noyaux de haute qualité d’embryons de souris gaztrulants pour le séquençage de cellules uniques et de noyaux.

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