Name: Préparation de microsphères d’alginate de sodium réticulées avec différents ions métalliques à l’aide de la technologie d’électronébulisation microfluidique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-07T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Découvrez la préparation de microsphères d'alginate de sodium réticulées avec des ions zinc et cuivre par électronébulisation microfluidique. Ces porteurs médicamenteux présentent des propriétés antimicrobiennes et une libération contrôlée des principes actifs.

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Ce travail a été soutenu par un projet de recherche de l’Université Zhejiang Shuren (2023R053 et 2023KJ237).

Le sang utilisé dans les expériences a été obtenu à partir de souris femelles BALB/c de grade SPF pesant 20 à 25 g et âgées d’environ 7 semaines. Le comité d’éthique de l’expérimentation animale du Zhejiang Shuren College a approuvé tous les soins aux animaux et les procédures expérimentales.
1. Préparation de la solution
<ol><li>Peser l’ALG et le dissoudre dans de l’eau ultra-pure en agitant au bain-marie à 50 °C pour obtenir une solution d’ALG à 2 %.</li>
	<li>Préparez séparément la fraction massique avec des solutions à 5 % (ou la concentration massique molaire est de 0,3 M) de CaCl2, FeCl3, ZnSO4 et CuSO4 dans de l’eau ultrapure. Versez chaque solution séparément dans un plat de collecte.</li>
</ol>2. Dispositif d’électropulvérisation microfluidique
<ol><li>Prenez un tube capillaire en verre et placez-le sur une flamme de chalumeau pour le ramollir, puis étirez-le à différents diamètres (50 μm-500 μm). Coupez les pièces fines à l’aide d’un coupe-verre et polissez doucement l’orifice de la pointe avec du papier de verre en carbure de silicium de haute qualité. Après le nettoyage, raccorder l’extrémité épaisse du tube capillaire à un long tube et l’autre extrémité du tube à une aiguille de distribution et à une seringue de 5 ml (figure supplémentaire 1). REMARQUE : Les arêtes vives des coupes de tube de verre sont difficiles à insérer dans le tuyau ; Ainsi, la cassure doit être arrondie au bord de la flamme.</li>
	<li>Fixez la seringue au pousse-seringue microfluidique et le tube capillaire à une extrémité au support. Connectez le clip d’extrémité haute tension rouge de l’alimentation haute tension à l’aiguille de distribution de la seringue et placez le clip argenté dans le liquide de collecte. Cette configuration crée un dispositif d’électropulvérisation microfluidique simple (Figure 1A). REMARQUE : Placez le tube capillaire perpendiculairement à la table.</li>
</ol>3. Préparation des microsphères ALG
<ol><li>Placez les boîtes de collecte séparées contenant différents ions métalliques directement sous le tube capillaire. Allumez le pousse-seringue microfluidique et sélectionnez Avance rapide pour amorcer le tube avec l’ALG, puis réglez le débit approprié (2 mL/h).</li>
	<li>Allumez l’interrupteur d’alimentation haute tension et tournez le bouton pour régler la tension appropriée (5-7 kV).</li>
	<li>Ajouter 20 mL de solution dans chacune des boîtes de Pétri de 90 mm pour recueillir les microsphères d’ALG afin de former des ALGMS réticulées avec différents ions métalliques (figure 1B).</li>
	<li>L’ALG forme des microsphères sous l’action du champ électrique et de la gravité dans différentes solutions de collecte d’ions en quelques secondes. Aspirez les microsphères à l’aide d’une pipette stérilisée et transférez-les dans des tubes à centrifuger individuels de 1,5 mL pour obtenir des microsphères d’hydrogel Zn2+, Ca2+, Cu2+ et Fe3+ -ALG (figure 1C). Étiquetez les tubes Zn-ALGMS, Ca-ALGMS, Cu-ALGMS et Fe-ALGMS. REMARQUE : Des microsphères de différents diamètres peuvent être obtenues en ajustant des paramètres tels que la tension, le diamètre de la pointe, le débit et la concentration de la solution.</li>
	<li>Prenez une petite quantité des microsphères préparées, dispersez-les aussi uniformément que possible dans du PBS et placez-les sous un microscope pour les visualiser.</li>
	<li>Sélectionnez au hasard 10 champs d’observation dans le même lot de microsphères, importez les images à mesurer dans le logiciel ImageJ, convertissez les images dans le mode de niveaux de gris approprié et utilisez la technologie de segmentation par seuil pour définir avec précision la surface des particules cibles et démarrer la fonction d’analyse des particules afin qu’ImageJ puisse identifier et mesurer les particules cibles. Obtenez des données sur les microsphères, puis importez-les dans le logiciel Origin pour l’analyse et la cartographie de la taille des particules.</li>
</ol>4. Test de performance antimicrobienne
<ol><li>Préparer des suspensions de 5 mL de Staphylococcus aureus (S. aureus) et d’Escherichia coli (E. coli) avec une turbidité bactérienne initiale de 0,2 mcF à l’aide d’un milieu liquide Luria-Bertani (LB).</li>
	<li>Ajouter 10 ml de chaque solution bactérienne dans 4 tubes à centrifuger stériles individuels de 15 ml. Ensuite, ajoutez 0,5 mL de Zn-ALGMS, Ca-ALGMS, Cu-ALGMS et Fe-ALGMS ALG dans chaque tube et placez-les dans un agitateur à température constante à 37 °C et 200 tr/min pendant 12 h. Ajoutez une quantité égale de solution saline au groupe témoin.</li>
	<li>Diluez chaque solution bactérienne à 10à 5 fois avec de l’eau stérile. À l’aide d’une bille de verre stérile, étalez 200 μL de solution bactérienne sur un milieu solide LB.</li>
	<li>Étalez la solution rapidement et uniformément sur la plaque de revêtement, en évitant les allers-retours dans la même zone. Ensuite, placez les plaques dans un incubateur à 37 °C pendant 12 h. Observez les colonies de différents groupes. REMARQUE : Toutes les procédures aseptiques doivent être effectuées à proximité d’une lampe à alcool. Stérilisez les récipients de culture microbienne, les ustensiles d’inoculation et les milieux de culture.</li>
</ol>5. Tests de libération de médicaments
<ol><li>Pour évaluer la capacité de libération de différents microsphères, utilisez l’albumine sérique bovine (BSA) comme médicament modèle chargé. Ajouter 500 μL de chaque microsphère (Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS et Fe-ALGMS) à 1 mg/mL de suspension BSA pendant 24 h.</li>
	<li>Pour l’essai de libération de médicament, ajouter chaque échantillon saturé à 5,0 M de solution saline tamponnée au phosphate (PBS ; pH 7,4), suivi d’une agitation pendant 15 min à 37 °C avec agitation continue à 80 tr/min.</li>
	<li>Utilisez 100 μL de la solution et remplacez le milieu par un milieu frais à 1, 3, 6, 12, 24, 36 et 48 h.</li>
	<li>Quantifier les concentrations de protéines surnageantes à des moments précis à l’aide d’une trousse d’analyse de la santé biologique conformément aux instructions du fabricant. Mesurez quantitativement le médicament libéré par un marqueur enzymatique pour obtenir l’absorbance correspondante et convertissez la valeur mesurée en concentration réelle du médicament selon la courbe standard. Calculez le taux de libération du médicament à l’aide de la formule suivante : Pourcentage de libération de la drogue = (concentration de la drogue libérée à un moment précis / concentration initiale de la drogue) x 100 %</li>
	<li>À intervalles réguliers, retirez un volume égal de PBS de chaque puits et remplacez-le par un volume égal de milieu frais.</li>
</ol>6. Test d’hémolyse
<ol><li>Placez les ALGMS Ca, Cu, Zn-ALGM et Fe préparés dans du PBS et incuberez-les à 37 °C pendant 24 h pour formuler la solution d’incubation.</li>
	<li>Obtenir du sang total de souris BALB/c saines par phlébotomie oculaire, recueilli dans des tubes anticoagulants contenant du citrate de sodium. Vortex et centrifugeuse à 1509 x g pendant 15 min pour obtenir des globules rouges.</li>
	<li>Rincez les globules rouges 2x-3x avec du PBS et préparez une solution de globules rouges à 10% avec du PBS.</li>
	<li>Préparation de divers ALGM : Prendre 500 μL de chaque microsphère pour le groupe expérimental, 1 mL d’eau ultrapure (ddH2O) pour le groupe témoin positif et 1 mL de solution PBS pour le groupe témoin négatif et mélanger chacun avec 20 μL de solution de cellules sanguines.</li>
	<li>Incuber les échantillons à 37 °C pendant 4 h, centrifuger à 1509 x g, 15 min. Gardez le surnageant à l’écart et photographiez les globules rouges de chaque groupe après l’hémolyse.</li>
	<li>Prenez le taux d’hémolyse du groupe témoin positif à 100 % et le groupe témoin négatif à 0 %. Mesurez les valeurs d’absorbance des surnageants dans chaque groupe et calculez le taux d’hémolyse à l’aide de la formule : Hémolyse (%) = (Valeurs d’absorbance des surnageants de chaque groupe- Valeurs d’absorbance de l’eau distillée seule) / (Valeurs d’absorbance du groupe témoin positif - Valeurs d’absorbance de l’eau distillée seule) x 100</li>
</ol>7. Test de cytobiocompatibilité
<ol><li>Lavez les différents ALGM 2 fois avec du PBS et placez-les dans une boîte de Pétri de 5 ml pendant 15 min et jetez le surnageant.</li>
	<li>Ajouter séparément différents ALGM à 0,2 mL dans un milieu de culture complet (DMEM) contenant 10 % de FBS, incuber à 37 °C pendant 24 h et filtrer la solution pour obtenir le lixiviat.</li>
	<li>Cultivez les cellules NIH3T3 à une densité cellulaire d’environ 70 % dans des plaques de 24 puits, traitez les cellules NIH3T3 avec une solution de lixiviation de microsphères et poursuivez la culture avec un milieu complet pendant encore 24 h.</li>
	<li>Retirez le milieu de culture cellulaire et lavez les cellules avec du PBS.</li>
	<li>Évaluez la viabilité cellulaire à l’aide du test Calcein-AM/PI. Prendre 2,5 μL de solution de Calcein-AM (4 mM) et 12,5 μL de solution de PI (2 mM) et les ajouter à 5 mL de 1x PBS et bien mélanger pour obtenir une solution de travail avec 2 μM de Calcein-AM et 5 μM de PI.</li>
	<li>Ajoutez la solution de travail sur des plaques de culture cellulaire préalablement ensemencées à 500 μL par puits, incubez à 37 °C sous protection lumineuse pendant 15 min, et observez et photographiez sous un microscope à fluorescence inversée. Configurez trois répétitions pour chaque groupe.</li>
	<li>Calculez la viabilité cellulaire selon la formule suivante : Viabilité cellulaire (%) = nombre de cellules viables / (nombre de cellules viables + nombre de cellules mortes)</li>
</ol>

Développement de microsphères d’hydrogel d’alginate de sodium à des fins biomédicales

<ol><li>Gong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+recent+advances+of+cellulose-based+intelligent-responsive+hydrogels+as+vehicles+for+controllable+drug+delivery+system%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+BiolMacromol%22%5BJournal%5D)">A review of recent advances of cellulose-based intelligent-responsive hydrogels as vehicles for controllable drug delivery system.</a> Int J BiolMacromol. 264 (2), 130525(2024).</li>
<li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+microfluidic+hydrogel+microspheres+for+cell+and+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Funct%22%5BJournal%5D)">Injectable microfluidic hydrogel microspheres for cell and drug delivery.</a> Adv Funct. 31 (31), 2103339(2021).</li>
<li>Qiao, S., Chen, W., Zheng, X., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+pH-sensitive+alginate-based+hydrogel+by+microfluidic+technology+for+intestinal+targeting+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Macromol%22%5BJournal%5D)">Preparation of pH-sensitive alginate-based hydrogel by microfluidic technology for intestinal targeting drug delivery.</a> Int J Biol Macromol. 254 (2), 127649(2024).</li>
<li>Lei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+hydrogel+microspheres+for+protein+capture+and+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Design%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial hydrogel microspheres for protein capture and wound healing.</a> Mater Design. 215, 110478(2022).</li>
<li>Ju, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zn2%2B+incorporated+composite+polysaccharide+microspheres+for+sustained+growth+factor+release+and+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Today+Bio%22%5BJournal%5D)">Zn2+ incorporated composite polysaccharide microspheres for sustained growth factor release and wound healing.</a> Mater Today Bio. 22, 100739(2023).</li>
<li>El-Sayed, N. S., Hashem, A. H., Khattab, T. A., Kamel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+antibacterial+hydrogels+based+on+sodium+alginate%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J+Biol+Macromol%22%5BJournal%5D)">New antibacterial hydrogels based on sodium alginate.</a> Int. J Biol Macromol. 248, 125872(2023).</li>
<li>Olukman Şahin, M., Şanlı, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+5-fluorouracil+release+properties+investigation+from+pH+sensitive+sodium+alginate+coated+and+uncoated+methyl+cellulose%2Fchitosan+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Macromol%22%5BJournal%5D)">In vitro 5-fluorouracil release properties investigation from pH sensitive sodium alginate coated and uncoated methyl cellulose/chitosan microspheres.</a> Int J Biol Macromol. 258 (1), 128895(2024).</li>
<li>Chi, H., Qiu, Y., Ye, X., Shi, J., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+strategy+of+hydrogel+microsphere+and+its+application+in+skin+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Preparation strategy of hydrogel microsphere and its application in skin repair.</a> Front Bioeng Biotechnol. 11, 1239183(2023).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-inspired+dual-adhesive+particles+from+microfluidic+electrospray+for+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Res%22%5BJournal%5D)">Bio-inspired dual-adhesive particles from microfluidic electrospray for bone regeneration.</a> Nano Res. 16 (4), 5292-5299 (2022).</li>
<li>Zheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celastrol-encapsulated+microspheres+prepared+by+microfluidic+electrospray+for+alleviating+inflammatory+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Adv%22%5BJournal%5D)">Celastrol-encapsulated microspheres prepared by microfluidic electrospray for alleviating inflammatory pain.</a> Biomater Adv. 149, 213398(2023).</li>
<li>Yang, L., Yang, W., Xu, W., Zhao, Y., Shang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-inspired+Janus+microcarriers+with+sequential+actives+release+for+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Eng+J%22%5BJournal%5D)">Bio-inspired Janus microcarriers with sequential actives release for bone regeneration.</a> Chem Eng J. 476, 146797(2023).</li>
<li>Yang, L., Sun, L., Zhang, H., Bian, F., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ice-inspired+lubricated+drug+delivery+particles+from+microfluidic+electrospray+for+osteoarthritis+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Ice-inspired lubricated drug delivery particles from microfluidic electrospray for osteoarthritis treatment.</a> ACS Nano. 15 (12), 20600-20606 (2021).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-flexible+stretchable+liquid+metal+circuits+with+antimicrobial+properties+through+selective+laser+activation+for+health+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Eng+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-flexible stretchable liquid metal circuits with antimicrobial properties through selective laser activation for health monitoring.</a> Chem Eng J. 482, 149173(2024).</li>
<li>Sukhodub, L., Kumeda, M., Sukhodub, L., Bielai, V., Lyndin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+ions+doping+effect+on+the+physicochemical%2C+antimicrobial%2C+and+wound+healing+profiles+of+alginate-based+composite%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr+Polym%22%5BJournal%5D)">Metal ions doping effect on the physicochemical, antimicrobial, and wound healing profiles of alginate-based composite.</a> Carbohydr Polym. 304, 120486(2023).</li>
<li>Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+microparticles+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mater%22%5BJournal%5D)">Hydrogel microparticles for biomedical applications.</a> Nat Rev Mater. 5 (1), 20-43 (2020).</li>
<li>Bertsch, P., Diba, M., Mooney, D. J., Leeuwenburgh, S. C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-healing+injectable+hydrogels+for+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Self-healing injectable hydrogels for tissue regeneration.</a> Chem Rev. 123 (2), 834-873 (2023).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomass+microcapsules+with+stem+cell+encapsulation+for+bone+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomicro+Lett%22%5BJournal%5D)">Biomass microcapsules with stem cell encapsulation for bone repair.</a> Nanomicro Lett. 14 (1), 4(2021).</li>
<li>Wu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK-Cell-Encapsulated+porous+microspheres+via+microfluidic+electrospray+for+tumor+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater%22%5BJournal%5D)">NK-Cell-Encapsulated porous microspheres via microfluidic electrospray for tumor immunotherapy.</a> ACS Appl Mater. 11 (37), 33716-33724 (2019).</li>
<li>Nan, L., Zhang, H., Weitz, D. A., Shum, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+future+of+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22LOC%22%5BJournal%5D)">Development and future of droplet microfluidics.</a> LOC. 24 (5), 1135-1153 (2024).</li>
</ol>

Aucun conflit d’intérêts ne doit être divulgué.

Dans ce protocole, nous présentons une méthode de préparation d’ALGMS basée sur la technologie de l’électropulvérisation microfluidique. La méthode est simple à utiliser et permet d’obtenir un grand nombre de microsphères avec une rondeur uniforme et un diamètre contrôlable. Cette approche est pratique pour les chercheurs et peut promouvoir la recherche et l’application de microsphères d’hydrogel. De plus, en se réticulant avec différents ions métalliques, la stabilité et la bioactivité des ALGMS ont été améliorées. Dans les expériences antimicrobiennes, les Cu-ALGMS et Zn-ALGMS ont montré des effets inhibiteurs bactériens significatifs.
Les microsphères d’hydrogel sont des microstructures flexibles avec une excellente plasticité, permettant une administration efficace des médicaments grâce à une sélection de matériaux et une conception structurelle spécifiques. L’alginate, un polysaccharide naturel qui se gélifie dans des conditions douces, est biocompatible, biodégradable et non toxique. Les microsphères d’alginate de sodium à l’échelle du micron sont largement utilisées en biochimie et en biomédecine, y compris la recherche pharmaceutique, l’administration de médicaments et l’ingénierie tissulaire. L’un des principaux avantages des microsphères d’alginate de sodium dans les applications d’administration de médicaments est leur capacité à libérer durablement des médicaments, assurant le maintien de concentrations élevées de l’ingrédient pharmaceutique actif sur une durée prolongée14. Nos expériences de libération prolongée de médicaments ont révélé que les ALGMS avec différentes réticulations ioniques ont la capacité de maintenir la libération de médicaments et peuvent être utilisés pour des applications d’administration de médicaments.
Les méthodes de fabrication courantes des microsphères d’hydrogel comprennent l’émulsification par lots, la fragmentation mécanique, la lithographie, l’émulsion microfluidique et l’électropulvérisation 8,15. Les avantages des méthodes d’émulsification par lots et de broyage mécanique résident dans la simplicité de la méthode de fabrication et une efficacité de production élevée. Cependant, il est difficile de contrôler la forme des microsphères d’hydrogel individuelles à l’aide de ces méthodes. La photolithographie consiste à concentrer la lumière sur une plaque de masque ou un moule pour durcir la réticulation et former des microsphères d’hydrogel. Cependant, l’efficacité de production de cette méthode est facilement affectée par la plaque du masque, la source lumineuse et le moule. De plus, la méthode d’émulsion microfluidique peut mieux contrôler le processus de moulage des microsphères d’hydrogel et produire des microsphères d’hydrogel avec des formes spécifiées ; Cependant, son efficacité de production est faible16. Par rapport à ces méthodes, la méthode d’électropulvérisation microfluidique peut produire des microsphères d’hydrogel de taille uniforme, de forme régulière et de taille de particule réglablede 17. L’étape clé de ce protocole est la préparation des microsphères. La taille et la forme des microsphères peuvent varier en fonction de la planéité du tube de verre, de la valeur de la tension et du débit18. L’utilisation de la technologie d’électronébulisation microfluidique pour préparer des microsphères présente également certaines limites, telles que la tendance des microcanaux à se boucher et le rendement limité, la compatibilité limitée des matériaux et la difficulté de la mise à l’échelle du procédé, ainsi que la difficulté du contrôle et de la surveillance du procédé. Cela limite dans une certaine mesure leur application généralisée19.
En résumé, la technologie d’électropulvérisation microfluidique est une méthode de préparation de microsphères mature, offrant l’avantage de la synthèse en une seule étape. En optimisant les paramètres de taille du canal d’écoulement et en contrôlant la concentration du matériau et le débit, il est facile d’obtenir des microsphères de différentes morphologies et tailles. Notamment, le processus n’implique que la phase aqueuse et aucun tensioactif supplémentaire, ce qui le rend respectueux de l’environnement et simple à utiliser, évitant ainsi le besoin de processus de lavage complexes. Cette méthode fournit une stratégie pour produire des microsphères à partir de matériaux hydrogelés similaire au processus de gélification de l’alginate.

Les systèmes d’administration de médicaments sont un haut lieu de la recherche dans le domaine de l’ingénierie biotissulaire, visant à améliorer l’efficacité de l’administration de médicaments et à réduire les effets indésirables et les effets secondaires1. Parmi ces systèmes, les microsphères d’hydrogel, caractérisées par une bonne biocompatibilité, des propriétés mécaniques réglables et une plasticité fonctionnelle, sont l’un des véhicules les plus couramment utilisés pour le chargement et l’administration de médicaments2. Ils peuvent être utilisés pour la libération lente et contrôlée de médicaments, fournir de bons effets protecteurs pour les médicaments, éviter ou minimiser les effets non spécifiques des médicaments dans d’autres tissus et cibler l’administration de médicaments à des structures tissulaires spécifiques3. Par conséquent, les microsphères d’hydrogel sont devenues un nouveau système d’administration de médicaments efficace, avec l’émergence progressive de la recherche dans ce domaine4.
Les microsphères d’hydrogel sont généralement synthétisées à partir de matériaux biodégradables, notamment des polysaccharides, des protéines et des polymères naturels5. Parmi eux, l’ALG est un polysaccharide biocompatible et biodégradable extrait d’algues brunes marines6. Sa chaîne moléculaire contient des groupes hydroxyles et carboxyles libres qui peuvent se réticuler avec la plupart des cations divalents ou multivalents pour former une structure d’hydrogel insoluble dans l’eau avec un réseau tridimensionnel5. Les microsphères d’hydrogel formées par l’ALG peuvent être converties en polyélectrolytes chargés négativement dans des solutions neutres et alcalines. Cette répulsion entre les charges négatives fait gonfler les microsphères, ce qui permet la libération de l’ingrédient actif encapsulé ou du médicament. Ces propriétés ont conduit à considérer les microsphères ALG comme des vecteurs de médicaments prometteurs largement utilisés pour le chargement et la libération contrôléede médicaments 7.
Différentes méthodes existent pour la préparation des microsphères d’hydrogel. Les méthodes traditionnelles de préparation de l’ALGMS comprennent généralement la méthode sol-gel ou la méthode émulsion-sol. Ces méthodes impliquent des étapes telles que la précipitation, la co-précipitation et les réactions de gélification pour obtenir les microsphères cibles8. Au cours des dernières années, avec le développement continu de la technologie microfluidique, la méthode d’électropulvérisation microfluidique est progressivement devenue une méthode de préparation de microsphères efficace et précise9. Cette méthode utilise la technologie microfluidique pour électropulvériser une solution polymère à travers une buse microfine afin de former des gouttelettes et des microsphères de taille micrométrique au cours du processus de durcissement ou de réticulationultérieur 10. Par rapport à la méthode traditionnelle, l’électronébulisation microfluidique offre un contrôle précis de la taille et de la morphologie des particules de microsphères en ajustant des paramètres tels que le débit de la solution, la tension et la taille de la buse fine11. Il permet également une préparation continue à grande vitesse des microsphères, améliorant ainsi l’efficacité de la préparation et maintenant des conditions de réaction douces. De plus, les ALGMS peuvent être préparés pour posséder diverses fonctions, telles que des médicaments à libération contrôlée et des catalyseurs chargés, ce qui permet leur application facile dans divers domaines.
Nous présentons ici un protocole pour la préparation des microsphères ALG à l’aide de la méthode d’électronébulisation microfluidique. Le processus consiste à faire passer une solution d’ALG à travers un dispositif microfluidique et à la soumettre à une électropulvérisation. Les gouttelettes résultantes ont été collectées dans la solution contenant différents ions métalliques (Ca2+, Cu2+, Zn2+ et Fe3+) pour initier la réaction de réticulation. Cette réaction améliore la stabilité et l’adhérence des microsphères et les dote de différentes fonctionnalités. Cette méthode est facile à mettre en œuvre, et les microsphères synthétisées présentent une bonne uniformité de taille dans leur morphologie. De plus, nous avons étudié leurs propriétés antimicrobiennes, leur capacité de libération lente des médicaments et leur biocompatibilité. Ce protocole sera utile pour la poursuite du développement et de la production de médicaments.

<table><tbody><tr><td>Écran à mailles 120</td><td>Solarbio, Chine</td><td>YA0946</td><td></td></tr><tr><td>Brûleur à alcool</td><td>Solarbio, Chine</td><td>YA2320</td><td></td></tr><tr><td>BALB / c souris</td><td>Wukong Biotechnology, Chine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Réactif d’essai d’acide bicinchoninique</td><td>Meilunbio, Chine</td><td>MA0082</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Lablead, Chine</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 & nbsp ; poudre</td><td>Aladdin,Chine</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>Calcein-AM/PI</td><td>Biosharp,Chine</td><td>BL130A</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger</td><td>Corning,Amérique</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4&nbsp ; poudre</td><td>Jnxinyuehuagong,Chine</td><td>7758-99-8</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibicol,Chine</td><td>C11995500BT</td><td></td></tr><tr><td>FeCl3&nbsp ; poudre</td><td>Aladdin,Chine</td><td>7705-08-0</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>HAKATA, Chine</td><td>HN-FBS</td> Tubes en <td></td></tr><tr><td>verre</td><td>Sartorius, Allemagne</td><td>CC0028</td><td></td></tr><tr><td>Microscopie optique</td><td>Evidentscientific, Japon</td><td>BX53 (LED)</td><td></td></tr> <tr><td>Pompe à seringue microfluidique</td><td>Longerpump, Angleterre</td><td>LSP01-3A</td><td></td></tr><tr><td>NIH3T3</td><td>HyGyte, Chine</td><td>TCM-C752</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri</td><td>Thermofisher,America</td><td>150464</td><td></td></tr><tr><td>Tampon phosphate salin</td><td>Thermofisher,America</td><td>3002</td><td></td></tr><tr><td>Microscope électronique à balayage</td><td>Thermofisher,America</td><td>Axia ChemiSEM</td><td></td></tr><tr><td>Poudre d’alginate de sodium&nbsp ;</td><td>Bjbalb, Chine</td><td>Y13095</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4 poudre</td><td>Jnxinyuehuagong, Chine</td><td>7733-02-0</td><td></td></tr></tbody></table>

préparation de microsphères d’alginate de sodium réticulées avec différents ions métalliques à l’aide de la technologie d’électronébulisation microfluidique

Preparation of Cross-Linked Sodium Alginate Microspheres with Different Metal Ions Using the Microfluidic Electrospray Technology

Les microsphères sont des particules de taille micrométrique qui peuvent charger et libérer progressivement des médicaments par encapsulation physique ou adsorption sur la surface et dans les polymères. Dans le domaine de la biomédecine, les microsphères d’hydrogel ont été largement étudiées pour leur application en tant que vecteurs de médicaments en raison de leur capacité à réduire la fréquence d’administration des médicaments, à minimiser les effets secondaires et à améliorer l’observance du patient. L’alginate de sodium (ALG) est un polysaccharide linéaire naturel avec trois liaisons glycosidiques de squelette. Il y a deux groupes hydroxyles auxiliaires présents dans chacune des fractions du polymère, qui ont les caractéristiques d’une fraction hydroxyle d’alcool. Les unités ALG synthétiques peuvent subir des réactions chimiques de réticulation avec des ions métalliques, formant une structure de réseau réticulé d’empilements de polymères, formant finalement un hydrogel. Les microsphères d’hydrogel peuvent être préparées à l’aide d’un processus simple impliquant les propriétés de réticulation ionique de l’ALG. Dans cette étude, nous avons préparé des microsphères d’hydrogel à base d’ALG (ALGMS) en utilisant une stratégie d’électrodéposition microfluidique. Les microsphères d’hydrogel préparées étaient de taille uniforme et bien dispersées, grâce au contrôle précis du flux d’électronébulisation microfluidique. Des ALGMS réticulés avec différents ions métalliques ont été préparés à l’aide d’une technique d’électropulvérisation microfluidique combinant microfluidique et champ électrique élevé, et ses propriétés antimicrobiennes, sa capacité de libération lente de médicaments et sa biocompatibilité ont été étudiées. Cette technologie est prometteuse pour le développement et la production de médicaments avancés.

Caractérisation d’ALGMS réticulés avec différents ions métalliques La morphologie optique des ALGMS Ca-CA, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS et Fe-ALGMS est illustrée à la figure 2, présentant une bonne sphéricité, une surface lisse, une distribution granulométrique uniforme (figure supplémentaire 2) et une excellente monodispersité. Nous avons ensuite effectué une caractérisation microscopique à l’aide de la microscopie électronique à balayage (MEB) et de l’analyse par spectroscopie à dispersion d’énergie (EDS). Comme le montre la figure 3, les microsphères étaient généralement sphériques avec une rondeur bien définie. La surface du Zn-ALGMS était inégalement répartie, apparaissant plus rugueuse avec de nombreuses rides. Nous avons effectué une spectroscopie à dispersion d’énergie pour déterminer la distribution du contenu des ions métalliques impliqués dans la réaction de réticulation dans le gel. Notamment, la taille de la microsphère peut être ajustée en modifiant des paramètres tels que la distance de collecte, la concentration de gel et la tension du champ électrique12. Dans le protocole décrit, en ajustant les paramètres du dispositif microfluidique et la concentration du liquide, des particules de différentes tailles peuvent être facilement obtenues en fonction d’exigences spécifiques.
Évaluation des propriétés antimicrobiennes Nous avons évalué la capacité antimicrobienne de différentes microsphères à l’aide de la méthode de la plaque, comme le montre la figure 4. Différentes microsphères ont montré une activité antibactérienne contre E. coli et S. aureus, les Cu-ALGM et Zn-ALGM montrant les propriétés antibactériennes les plus fortes. Cette efficacité accrue peut être attribuée à l’activité antimicrobienne des métaux, à savoir le cuivre (Cu) et le zinc (Zn)13. Sukhodub et al. ont démontré que Fe3+, Zn2+, Ca2+ et Cu2+ présentaient des effets antibactériens synergiques avec le chitosane, tandis que les échantillons sans chitosane ne présentaient aucune activité similaire, validant l’effet antibactérien synergique des complexes formés14. Les résultats obtenus s’alignent sur cette étude, les Cu-ALGMS et Zn-ALGMS étant supérieurs aux autres microsphères d’hydrogel dans le traitement des maladies infectieuses bactériennes.
Évaluation des propriétés de libération du médicament L’évaluation de la libération du médicament à partir de différentes microsphères d’hydrogel d’alginate à base de métal en utilisant BSA comme médicament modèle a révélé des différences dans leurs profils de libération. (Figure supplémentaire 3). Les ions présentaient une meilleure capacité de libération lente de médicament que ceux d’autres matériaux. Le taux de libération de médicament de Fe2+ était relativement plus rapide que celui des trois autres ions, tandis que le taux de libération de médicament de Ca2+ et de Zn2+ était relativement plus lent. Ces résultats mettent en évidence les différences dans les effets des différents ions sur la libération des médicaments. Nous émettons l’hypothèse que Fe2+ interagit peut-être avec le médicament ou se lie d’une manière qui le rend plus facile à libérer, tandis que Ca2+ et Zn2+ se lient plus étroitement au médicament, ou qu’il existe d’autres facteurs qui limitent le taux de libération. Cette libération soutenue de médicament à partir des microsphères d’hydrogel peut être liée à la force de réticulation entre le métal et le polysaccharide d’alginate. De plus, la différence dans la capacité d’adsorption des différents métaux par rapport à celle de la BSA a probablement contribué aux différences observées dans les capacités de retard des médicaments.
Évaluation de la biocompatibilité Une bonne biocompatibilité est une condition préalable à l’administration de médicaments dans les applications cliniques. Par conséquent, nous avons évalué l’hémocompatibilité des microsphères à l’aide d’un test d’hémolyse in vitro . Nous avons utilisé de l’eau pure comme témoin positif et une solution PBS comme témoin négatif. Les résultats expérimentaux sont présentés dans la figure supplémentaire 4, révélant que les globules rouges de la suspension sont restés intacts au contact de différentes microsphères, indiquant une hémolyse minimale par les microsphères. Les résultats de la cytobiocompatibilité ont montré que les microsphères n’affectaient pas l’activité cellulaire (figure supplémentaire 5). Ces résultats ont indiqué que les microsphères ont une bonne compatibilité avec les cellules sanguines.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66871/66871fig01.jpg"> Figure 1 : Préparation des microsphères d’hydrogel d’alginate. (A) Installation de la technologie d’électronébulisation microfluidique. (B) L’image en temps réel du processus d’électronébulisation microfluidique. (C) Les microsphères d’hydrogel d’alginate Ca2+, Cu2+, Zn2+ et Fe3+ préparées. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66871/66871fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66871/66871fig02.jpg"> Figure 2 : Micrographie des microsphères d’hydrogel d’alginate. Micrographie de (A) Ca-ALGMS, (B) Cu-ALGMS, (C) Zn-ALGMS et (D) Fe-ALGMS dans PBS (pH 7,4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66871/66871fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66871/66871fig03.jpg"> Figure 3 : Microscopie électronique à balayage et spectroscopie à dispersion d’énergie. Les images montrent la caractérisation des ALGMS (A) Ca, (B) ALGMS Cu, (C) ALGMS Zn et (D) ALGMS Fe avec i et ii pour les données de microscopie à balayage et iii-v pour les données de spectroscopie. Les images iii-v montrent une cartographie EDS, dans laquelle l’EDS sélectionne une face sur la surface de l’échantillon à balayer pour obtenir des informations de distribution élémentaire sur toute la zone. Le mode de balayage de carte est utilisé dans les applications d’analyse de composition, d’analyse de zone de phase et de distribution granulométrique des matériaux, où chaque élément est représenté par une couleur différente, comme illustré. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66871/66871fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66871/66871fig04.jpg"> Graphique 4. Propriétés antimicrobiennes des microsphères. (A) Les propriétés antimicrobiennes des groupes ont été testées à l’aide de la méthode du frottis bactérien. (B, C) Quantification des résultats de la numération sur plaque de frottis bactérien pour chaque groupe. Les échantillons de contrôle montrent des colonies cultivées sur du milieu LB sans aucun ajout. Les colonies relatives des autres bactéries ont été calculées en prenant le nombre de clones du groupe témoin à 100 % et en l’utilisant comme référence. La barre d’erreur : écart-type, n = 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66871/66871fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Figure supplémentaire 1 : Un tube en verre est relié à la seringue par un long tube en caoutchouc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66871/Supplementary%20figure%201_RE.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire 2 : Taille des particules. (A) Zn-ALGMS, (B) Ca-ALGMS, (C) Cu-ALGMS, (D) Fe-ALGMS. Une concentration molaire de 5 % a été utilisée pour tous les échantillons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66871/Supplementary%20figure%202_RE.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire 3 : Libération de médicaments. La courbe de libération de médicaments des ALGMS Ca-CA, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS et Fe-ALGMS dans le PBS (pH 7,4). La barre d’erreur : écart-type, n = 3 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66871/Supplementary%20figure%203_RE.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire 4 : Dosage de l’hémolyse des ALGMS Ca, Cu-ALGM, Zn-ALGMS et Fe-ALGMS. PC (contrôle positif) : ddH2O ; NC (contrôle négatif) : PBS. La barre d’erreur : écart-type, n = 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66871/Supplementary%20figure%204_RE.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire 5 : Cytotoxicité des microsphères réticulées avec différents ions. L’évaluation de la biocompatibilité des AGAL-Zn, Ca-AGAL, AGAL-Cu et AGAL-Fe a été effectuée. Calcein-AM/PI a été utilisé pour effectuer le test, et pour les résultats ici, 5 champs de vision ont été sélectionnés au hasard. ImageJ a été utilisé pour analyser le rapport entre les globules rouges et les cellules mortes afin d’obtenir la viabilité cellulaire relative. 1. PC, contrôle positif, 2.NC, contrôle négatif, 3. Zn-ALGMS, 4. Ca-ALGMS, 5. Cu-ALGMS, 6. Fe-ALGMS, La barre d’erreur : écart-type, n = 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66871/Supplementary%20figure%205_RE.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Le protocole décrit la préparation de microsphères d’alginate de sodium réticulées avec différents ions métalliques à l’aide d’un dispositif microfluidique pour la conception de supports de médicaments. Les propriétés antimicrobiennes et la libération lente de ces microsphères ont également été étudiées.

Préparation de microsphères d’alginate de sodium réticulées avec différents ions métalliques à l’aide de la technologie d’électronébulisation microfluidique

Microspheres are micrometer-sized particles that can load and gradually release drugs via physical encapsulation or adsorption onto the surface and within ...

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