Name: Etablissement d’un modèle d’implantation embryonnaire in vitro (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-21T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 13 s
Description: Découvrez un modèle d'implantation embryonnaire in vitro utilisant des embryons de souris et des cellules endométriales. Cette méthode simple et reproductible permet d'étudier les effets hormonaux sur la fécondation et d'améliorer les traitements de fertilité.

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Nos études ont été soutenues par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82171603), la Fondation de la Commission municipale de la santé de Shanghai (202140341), la Commission des sciences et de la technologie de la municipalité de Shanghai (23JC1403803) et le Programme de promotion de l’innovation du NHC et de Shanghai Key Labs, SIBPT (RC2023-02).

La manipulation des souris et les études expérimentales ont été réalisées selon des protocoles approuvés par le Comité des animaux de l’Institut de Shanghai pour les technologies biomédicales et pharmaceutiques. Assurez les procédures de sécurité : Portez toujours un équipement de protection individuelle (EPI) approprié lorsque vous manipulez des produits chimiques ou des matières biologiques.
1. Acquisition d’embryons de souris
REMARQUE : Cette section décrit le processus d’obtention d’embryons de souris. Des souris femelles adultes (âgées de 6 à 8 semaines, hybrides C57BL/6 et DBA/2) ont été maintenues dans des conditions environnementales standard de 12 h de lumière et 12 h d’obscurité à 20-25 °C et de 40 à 60 % d’humidité, avec de la nourriture et de l’eau fournies à volonté.
<ol><li>Injecter par voie intrapéritonéale chez des souris femelles 10 UI de gonadotrophine sérique de jument gravide (PMSG), puis injecter 10 UI de gonadotrophine chorionique humaine (HCG) à un intervalle de 42 à 48 heures.</li>
	<li>Accouplez chaque souris femelle avec un mâle du même âge et vérifiez la présence d’un plug vaginal le lendemain matin. REMARQUE : Le plug vaginal est un morceau jaune clair de suppositoire formé après la solidification du sperme à l’ouverture vaginale.</li>
	<li>Euthanasier les souris femelles avec des bouchons vaginaux par inhalation de CO2 .</li>
	<li>Ouvrez l’abdomen et localisez les organes génitaux féminins ; étirer l’oviducte, l’ovaire et les coussinets adipeux avec des pinces ; couper l’oviducte et l’ovaire avec des ciseaux ; puis coupez l’oviducte et l’utérus (Figure 1).</li>
	<li>Transférez l’oviducte obtenu dans une boîte de Pétri de 35 mm préremplie de milieu M2. REMARQUE : Le milieu M2 doit être préchauffé dans un incubateur (37 °C, 5 % CO2) pendant 30 min.</li>
	<li>Perforer l’ampoule élargie de l’oviducte à l’aide d’une aiguille de 25 G pour libérer ou pincer le complexe cumulus-zygote (figure 2).</li>
	<li>À l’aide d’une pince, transférez le complexe cumulus-zygote dans une solution M2 contenant 0,5 mg/mL d’hyaluronidase et incubez pendant plusieurs minutes jusqu’à ce que les cellules du cumulus se dissocient (figure 3).</li>
	<li>Prélevez les zygotes à l’aide d’une pipette de transfert d’œufs et lavez-les dans un milieu M2 contenant 4 mg/mL de BSA pour éliminer les résidus de hyaluronidase, les cellules cumulus et les impuretés.</li>
</ol>2. Culture in vitro d’embryons de souris
REMARQUE : Cette section détaille le processus de culture in vitro d’embryons de souris, des zygotes aux blastocystes. Les microgouttes de culture KSOM doivent être préparées 24 h à l’avance pour assurer l’équilibre entre la température et le gaz.
<ol><li>Préparez 12 microgouttelettes de milieu KSOM, d’un volume de 20 μL chacune, au fond d’une boîte de Pétri de 35 mm. Recouvrez les microgouttelettes de 3 à 5 ml d’huile minérale (figure 4) et placez les boîtes de Pétri dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2 pour l’équilibre.</li>
	<li>Transférez les embryons de souris du milieu M2 vers le milieu KSOM à l’aide d’une pipette de transfert pour un lavage en profondeur. REMARQUE : Cette étape nécessite un stéréomicroscope avec une platine de chauffage à 37 °C. Réduire au minimum la durée de la manipulation des embryons à l’extérieur de l’incubateur.</li>
	<li>Placez les embryons lavés dans les microgouttelettes KSOM préparées et incubez-les à 37 °C avec 5% de CO2 pendant 4 jours. REMARQUE : Pour assurer une nutrition adéquate, cultivez 5 à 10 embryons par microgoutte de 20 μL.</li>
	<li>Sélectionnez les blastocystes avantageux en fonction de leur taille (100-130 μm), de leur masse cellulaire interne (la masse cellulaire interne est composée de nombreuses cellules toutes compactées), du nombre de cellules trophoblastiques (le trophectoderme est composé de nombreuses cellules cohésives et regroupées) et du degré d’expansion (le blastocoel occupe 80-100% de l’embryon).</li>
</ol>3. Préparation des cellules endométriales
<ol><li>À l’intérieur d’une armoire de sécurité biologique, aspirer 1 mL de gélatine à 2 % à l’aide d’une pipette et le distribuer dans une plaque de culture à 12 puits. Tournez doucement la plaque pour assurer une couverture complète du fond avec la gélatine. Placez la plaque dans un incubateur à 37 °C pendant 30 min. Ensuite, aspirez l’excès de gélatine et laissez le fond de l’assiette sécher complètement.</li>
	<li>Une fois le processus d’enrobage terminé, cultivez des cellules d’adénocarcinome de l’endomètre humain (Ishikawa) avec du DMEM/F12 (voir le tableau des matériaux pour plus de détails), 1 mM de pyruvate de sodium, 2 mM de L-glutamine, 100 μg/mL de streptomycine et 100 UI/mL de pénicilline, ensemencez-les dans les plaques à 12 puits recouvertes de gélatine (2 × 105cellules/puits) et incubez pendant 24 h.</li>
</ol>4. Attachement de l’embryon
<ol><li>Placez délicatement 5 à 15 blastocystes frais dans chaque puits de la plaque de 12 puits contenant des cellules d’Ishikawa préparée à l’étape précédente pour la co-culture (Figure 5).</li>
	<li>Après 48 h d’incubation, observez les embryons au microscope pour évaluer leur état d’attachement. Pour observer l’attachement de l’embryon, déplacez rapidement la plaque trois fois. Les embryons non attachés présenteront un mouvement flottant ou roulant à la surface des cellules d’Ishikawa.</li>
	<li>Calculer le taux d’implantation de l’embryon à l’aide de l’équation (1) ; Utilisez le taux d’adhésion de l’embryon pour représenter l’effet d’implantation. Taux d’implantation embryonnaire = (embryons attachés/nombre total d’embryons implantés) × 100% (1)</li>
</ol>

Évaluation de l’adhésion embryonnaire dans un modèle de co-culture in vitro avec des cellules d’Ishikawa

<ol><li>Hannan, N. J., Paiva, P., Dimitriadis, E., Salamonsen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+for+study+of+human+embryo+implantation%3A+choice+of+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Models for study of human embryo implantation: choice of cell lines.</a> Biol Reprod. 82 (2), 235-245 (2010).</li>
<li>Li, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+efficient+method+to+quantify+embryo+attachment+to+endometrial+epithelial+cell+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Establishment of an efficient method to quantify embryo attachment to endometrial epithelial cell monolayers.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 38 (9), 505-511 (2002).</li>
<li>Hohn, H. P., Linke, M., Denker, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+of+trophoblast+to+uterine+epithelium+as+related+to+the+state+of+trophoblast+differentiation%3A+in+vitro+studies+using+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Adhesion of trophoblast to uterine epithelium as related to the state of trophoblast differentiation: in vitro studies using cell lines.</a> Mol Reprod Dev. 57 (2), 135-145 (2000).</li>
<li>Ho, H., Singh, H., Aljofan, M., Nie, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+in+vitro+model+of+human+embryo+attachment%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">A high-throughput in vitro model of human embryo attachment.</a> Fertil Steril. 97 (4), 974-978 (2012).</li>
<li>Karvas, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell-derived+trophoblast+organoids+model+human+placental+development+and+susceptibility+to+emerging+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stem-cell-derived trophoblast organoids model human placental development and susceptibility to emerging pathogens.</a> Cell Stem Cell. 29 (5), 810-825 (2022).</li>
<li>Xiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+landscape+of+3D-cultured+human+pre-gastrulation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos.</a> Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).</li>
<li>Ojosnegros, S., Seriola, A., Godeau, A. L., Veiga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+implantation+in+the+laboratory%3A+an+update+on+current+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod+Update%22%5BJournal%5D)">Embryo implantation in the laboratory: an update on current techniques.</a> Hum Reprod Update. 27 (3), 501-530 (2021).</li>
<li>Berneau, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+osteopontin+in+an+in+vitro+model+of+embryo+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Characterisation of osteopontin in an in vitro model of embryo implantation.</a> Cells. 8 (5), 432(2019).</li>
<li>Jiang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+HOXA10+sumoylation+inhibits+embryo+implantation+in+women+with+recurrent+implantation+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discov%22%5BJournal%5D)">Enhanced HOXA10 sumoylation inhibits embryo implantation in women with recurrent implantation failure.</a> Cell Death Discov. 3, 17057(2017).</li>
<li>Kang, Y. J., Forbes, K., Carver, J., Aplin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+osteopontin-integrin+%CE%B1v%CE%B23+interaction+at+implantation%3A+functional+analysis+using+three+different+in+vitro+models%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">The role of the osteopontin-integrin αvβ3 interaction at implantation: functional analysis using three different in vitro models.</a> Hum Reprod. 29 (4), 739-749 (2014).</li>
<li>Duan, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+exposure+to+supraphysiological+estradiol+during+ovarian+stimulation+increased+the+risk+of+adverse+perinatal+outcomes+after+frozen-thawed+embryo+transfer%3A+a+retrospective+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dev+Orig+Health+Dis%22%5BJournal%5D)">Oocyte exposure to supraphysiological estradiol during ovarian stimulation increased the risk of adverse perinatal outcomes after frozen-thawed embryo transfer: a retrospective cohort study.</a> J Dev Orig Health Dis. 11 (4), 392-402 (2020).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+%CE%B21+and+%CE%B23+are+biomarkers+of+uterine+condition+for+embryo+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Integrins β1 and β3 are biomarkers of uterine condition for embryo transfer.</a> J Transl Med. 14 (1), 303-312 (2016).</li>
<li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgelin+2+is+required+for+embryo+implantation+by+promoting+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Transgelin 2 is required for embryo implantation by promoting actin polymerization.</a> FASEB J. 33 (4), 5667-5675 (2019).</li>
<li>Green, C. J., Fraser, S. T., Day, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-like+growth+factor+1+increases+apical+fibronectin+in+blastocysts+to+increase+blastocyst+attachment+to+endometrial+epithelial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Insulin-like growth factor 1 increases apical fibronectin in blastocysts to increase blastocyst attachment to endometrial epithelial cells in vitro.</a> Hum Reprod. 30 (2), 284-298 (2015).</li>
<li>Kang, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-145+suppresses+embryo-epithelial+juxtacrine+communication+at+implantation+by+modulating+maternal+IGF1R%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">MiR-145 suppresses embryo-epithelial juxtacrine communication at implantation by modulating maternal IGF1R.</a> J Cell Sci. 128 (4), 804-814 (2015).</li>
<li>Berger, C., Boggavarapu, N. R., Menezes, J., Lalitkumar, P. G., Gemzell-Danielsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+ulipristal+acetate+on+human+embryo+attachment+and+endometrial+cell+gene+expression+in+an+in+vitro+co-culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effects of ulipristal acetate on human embryo attachment and endometrial cell gene expression in an in vitro co-culture system.</a> Hum Reprod. 30 (4), 800-811 (2015).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+models+of+human+endometrium+for+studying+trophoblast-endometrium+interaction+during+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture models of human endometrium for studying trophoblast-endometrium interaction during implantation.</a> Reprod Biol Endocrinol. 20 (1), 120-138 (2022).</li>
<li>Fitzgerald, H. C., Schust, D. J., Spencer, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+the+human+endometrium%3A+evolution+and+application+for+women%27s+health%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">In vitro models of the human endometrium: evolution and application for women's health.</a> Biol Reprod. 104 (2), 282-293 (2021).</li>
<li>Ahn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+microengineered+vascularised+endometrium-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional microengineered vascularised endometrium-on-a-chip.</a> Hum Reprod. 36 (10), 2720-2731 (2021).</li>
<li>Sternberg, A. K., Buck, V. U., Classen-Linke, I., Leube, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+mechanical+forces+change+the+human+endometrium+during+the+menstrual+cycle+in+preparation+for+embryo+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">How mechanical forces change the human endometrium during the menstrual cycle in preparation for embryo implantation.</a> Cells. 10 (8), 2008(2021).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts financiers ou autres à déclarer.

La simplicité et la rapidité du modèle in vitro proposé pour l’implantation d’embryons offrent des avantages remarquables pour le dépistage précoce de médicaments et d’autres applications de recherche. La simplicité du protocole, associée à la nature à haut débit des lignées cellulaires d’Ishikawa, en fait un candidat idéal pour les criblages à grande échelle, en particulier dans les premières étapes de la découverte de médicaments. Liang13 a découvert que l’inactivation de TAGLN2 diminuait la capacité d’invasion des cellules trophoblastiques. Green14 a démontré que le facteur de croissance analogue à l’insuline améliorait la capacité d’adhésion du blastocyste de souris basé sur le système de cellules embryonnaires d’Ishikawa de souris. Le modèle permet non seulement d’évaluer rapidement les candidats-médicaments, mais facilite également l’étude d’autres molécules, telles que les cytokines et les facteurs de transcription, qui jouent un rôle dans l’implantation de l’embryon15,16. Compte tenu des implications importantes de l’implantation de l’embryon en biologie de la reproduction, ce modèle est prometteur pour faire progresser notre compréhension des mécanismes sous-jacents et pour développer de nouvelles thérapies.
Bien que le modèle in vitro actuel constitue un outil précieux pour étudier l’implantation d’embryons, il est important de reconnaître ses limites. Étant un système de culture 2D, il n’a pas la complexité de l’environnement 3D in vivo 17, qui peut avoir un impact significatif sur les interactions cellule-cellule et les voies de signalisation. Par conséquent, bien que le modèle puisse fournir des informations initiales sur les effets de diverses molécules sur l’adhésion de l’embryon, il doit être considéré comme un outil de dépistage plutôt que comme un substitut aux études in vivo. Les orientations futures pourraient impliquer le développement de systèmes de culture 3D plus pertinents sur le plan physiologique qui récapitulent mieux le microenvironnement complexe de l’endomètre18, permettant des prédictions plus précises des réponses aux médicaments et des mécanismes moléculaires. De plus, il serait avantageux d’explorer l’intégration de ce modèle avec d’autres technologies avancées, telles que la microfluidique et les systèmes d’organes sur puce19,20 afin d’améliorer encore sa pertinence physiologique et ses capacités prédictives.
Au cours du processus de procréation médicalement assistée, la superovulation vise à améliorer la production d’ovules dans les ovaires, augmentant ainsi les chances de grossesse. Cependant, cette procédure peut entraîner une augmentation marquée des niveaux d’œstrogènes, dépassant le seuil physiologique normal. L’œstrogène, une hormone vitale dans la reproduction féminine, est responsable de la prolifération de l’endomètre et de la création d’un environnement propice à l’implantation de l’embryon. De plus, il régule l’équilibre d’autres hormones de reproduction, y compris la progestérone. À l’aide d’un modèle in vitro, nos résultats révèlent que si une augmentation de la concentration d’œstrogènes augmente initialement les taux d’implantation embryonnaire, des niveaux excessivement élevés au-delà de la plage physiologique entravent considérablement ce processus. Notamment, la supplémentation en progestérone peut contrer efficacement cet effet inhibiteur. Ces observations suggèrent que des niveaux anormalement élevés d’œstrogènes pendant la superovulation peuvent être un facteur contribuant aux taux d’implantation plus faibles cliniquement observés associés aux transferts d’embryons frais par rapport aux transferts d’embryons congelés. De plus, la supplémentation en progestérone post-transplantation est prometteuse pour améliorer les taux de réussite de l’implantation d’embryons.
Nous avons établi une approche simple, rentable et fiable pour la détection de l’implantation d’embryons. Des embryons de souris, après avoir atteint le stade de blastocyste grâce à la culture in vitro , ont été co-cultivés avec des cellules d’Ishikawa. Ce dispositif expérimental permet d’examiner le rôle et la fonction de diverses molécules, telles que les cytokines, les médicaments et les facteurs de transcription, dans les premiers stades de l’implantation de l’embryon. Bien que les lignées cellulaires établies comme les cellules d’Ishikawa ne fournissent pas les systèmes modèles les plus pertinents sur le plan physiologique lorsqu’elles sont associées à des embryons humains ou de souris, leur adaptabilité et leurs capacités à haut débit les rendent idéales pour le dépistage précoce de drogues à grande échelle. Bien que les modèles de culture in vitro 2D que nous avons établis nécessitent une optimisation supplémentaire, ils établissent la base d’une modélisation idéale de l’endomètre.

L’implantation de l’embryon, première étape d’une grossesse réussie, est cruciale pour comprendre sa base biologique et relever les défis de l’infertilité. Cependant, les contraintes éthiques posent des limites importantes à la collecte d’échantillons cliniques d’embryons humains, ce qui entrave la recherche sur les interactions complexes entre les embryons humains et l’endomètre au début de la grossesse1. Une compréhension approfondie de ces mécanismes complexes est essentielle pour faire progresser la recherche biologique fondamentale, la découverte de médicaments et la santé reproductive.
Des modèles in vitro antérieurs utilisaient des modèles d’adhésion où des cellules épithéliales endométriales humaines monocouches (RL95-2)2 étaient co-cultivées avec des substituts embryonnaires, tels que les cellules de choriocarcinome BeWo, JAr ou Jeg-33 . Néanmoins, le choix de la taille des sphéroïdes, allant de 70 à 100 μm, était crucial car des agrégats cellulaires plus grands ou plus petits pouvaient compromettre la précision de l’expérience. Notamment, seulement 25 % des sphéroïdes de chaque préparation répondaient à la norme pourla taille 4 appropriée, et il y avait des différences significatives par rapport aux conditions physiologiques des blastocystes.
De plus, les systèmes de culture tridimensionnels (3D) de l’endomètre et du blastocyste offrent un environnement physiologiquement plus pertinent5, mais ils nécessitent une expertise technique élevée, une croissance cellulaire lente, des coûts de ressources et de maintenance élevés, une difficulté de standardisation et une faible reproductibilité6.
Dans ce protocole, nous présentons un modèle in vitro rentable et rapide d’implantation d’embryons qui peut être développé et utilisé dans la plupart des laboratoires. L’objectif global de cette méthode est de fournir une plateforme fiable et reproductible pour l’étude des interactions entre l’embryon et l’endomètre dans un environnement contrôlé. En simulant les événements clés de l’implantation embryonnaire in vitro, ce modèle vise à combler le fossé entre les modèles animaux et les environnements cliniques, permettant une recherche plus précise et plus ciblée.
Par rapport aux substituts embryonnaires, l’utilisation de blastocystes de souris offre une représentation plus pertinente sur le plan physiologique du processus d’implantation embryonnaire in vivo7. De plus, la lignée cellulaire Ishikawa, dérivée de l’adénocarcinome de l’endomètre humain, possède des caractéristiques mixtes de l’épithélium glandulaire et de l’épithélium1 de la lumière utérine, lui permettant d’exprimer des enzymes, des protéines structurelles et des récepteurs stéroïdiens fonctionnels similaires à ceux trouvés dans l’endomètre normal, fournissant ainsi un substrat physiologiquement pertinent pour l’implantation de l’embryon. La simplicité et la rapidité du système de co-culture permettent un dépistage à haut débit et des tests de drogues 8,9,10. En fournissant une plate-forme robuste et reproductible, cette méthode offre la possibilité de faire progresser notre compréhension de l’implantation embryonnaire et de son impact sur la santé humaine.

<table><tbody><tr><td>17-&amp;bêta ;-estradiol</td><td>SIGMA</td><td>3301</td><td>Hormone œstrogénique de mammifère la plus puissante</td></tr><tr><td>BD Falcon</td><td>BD</td><td>353001</td><td>Boîtes de Pétri bactériologiques 35 x 10 mm avec couvercle étanche, polystyrène vierge de qualité cristalline,</td></tr><tr><td>enceinte de biosécurité</td><td>stérile classe ESCO</td><td><img alt="Equation 1 » src=" style="margin : auto ; ">BSC</td><td>Opérations aseptiques, fabrication de plats de culture, aliquotage de réactifs, etc</td></tr>. <tr><td>CO2 Incubateur</td><td>Thermo</td><td>8000DH</td><td>Culture d’embryons</td></tr><tr><td>Plaque de culture</td><td>Corning</td><td>3506</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>1133032</td><td>DMEM/F12 (1x), liquide 1:1, Contient de la L-glutamine et 15 mM de tampon HEPES</td></tr><tr><td>Sérum fœtal</td><td>bovin Gibco</td><td>10099141</td><td>Sérum fœtal de bovin, qualifié, Australie Origine</td></tr><tr><td>Gélatine</td><td>SIGMA</td><td>G9391</td><td>Type B, poudre, BioRéactif, adapté à la culture cellulaire</td></tr><tr><td>HCG</td><td>Nanjing Aibei</td><td>M2520</td><td>Réactif de stérilisation, injection intrapéritonéale, 50 UI/mL</td></tr><tr><td>Hyaluronidase&amp;nbsp ;</td><td>SIGMA</td><td>V900833</td><td>Qualité réactif, poudre&amp;nbsp ;</td></tr><tr><td>KSOM</td><td>Merck</td><td>MR-020P-D</td><td>(1x), Poudre, sans rouge de phénol, 5 x 10 mL</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td>L-glutamine-200 mM (100x), liquide</td></tr><tr><td>M2</td><td>Merck</td><td>MR-015-D</td><td>EmbryoMax M2 Medium (1x), liquide, avec</td></tr> huile minérale rouge de phénol<tr><td>&amp;nbsp ;</td>L’huile minérale <td>SIGMA</td><td>M8410</td><td>peut être utilisée comme couche de couverture pour contrôler l’évaporation et la contamination croisée dans diverses applications de biologie moléculaire</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine,</td><td>Gibco</td> liquide <td>15140122</td><td>10 000 unités de pénicilline (base) et 10 000 unités de streptomycine (base), en utilisant la pénicilline G (sel de sodium) et le sulfate de streptomycine dans une solution saline à 0,85 %</td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Nanjing Aibei</td><td>M2620</td><td>Réactif de stérilisation, injection intrapéritonéale, 50 UI/mL</td></tr><tr><td>Progestérone</td><td>SIGMA</td><td>5341</td><td>Hormone stéroïde sécrétée par le corps jaune au cours de la seconde moitié du cycle menstruel</td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td>Le pyruvate de sodium est couramment ajouté aux milieux de culture cellulaire en tant que source de carbone en plus du glucose</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td>Prélèvement d’embryons et observation du développement embryonnaire</td></tr></tbody></table>

etablissement d’un modèle d’implantation embryonnaire in vitro

Establishment of an Embryo Implantation Model In Vitro

L’implantation embryonnaire est la première étape dans l’établissement d’une grossesse réussie. Un modèle in vitro d’implantation d’embryons est essentiel pour la recherche biologique fondamentale, le développement de médicaments et le dépistage. Cet article présente un modèle in vitro simple, rapide et très efficace pour l’implantation d’embryons. Dans ce protocole, nous introduisons d’abord l’acquisition de blastocystes de souris et la préparation de cellules d’adénocarcinome de l’endomètre humain (Ishikawa) pour l’implantation, puis la méthode de co-culture pour les embryons de souris et les cellules d’Ishikawa. Enfin, nous avons mené une étude pour évaluer l’impact de concentrations variables de 17-β-œstradiol (E2) et de progestérone (P4) sur les taux d’adhésion embryonnaire sur la base de ce modèle. Nos résultats ont révélé que des concentrations élevées de E2 réduisaient significativement l’adhésion embryonnaire, tandis que l’ajout de progestérone pouvait restaurer le taux d’adhésion. Ce modèle offre une plate-forme simple et rapide pour évaluer et cribler les molécules impliquées dans le processus d’adhésion, telles que les cytokines, les médicaments et les facteurs de transcription contrôlant l’implantation et la réceptivité de l’endomètre.

Dans le processus des techniques de procréation assistée, l’hyperstimulation ovarienne contrôlée (COH) est une étape cruciale, conduisant à des niveaux d’œstrogènes significativement élevés chez les patientes de plus de 10 à 20 fois par rapport aux cycles naturels11. Dans ce contexte, nous nous sommes demandé si des concentrations élevées d’œstrogènes sériques avaient un impact sur l’implantation d’embryons lors du transfert d’embryons frais. Sur la base de ce modèle d’implantation embryonnaire, nous avons étudié les effets de différentes concentrations de E2 et P4 sur les taux d’implantation embryonnaire12. Après le traitement de famine, les cellules d’Ishikawa ont été incubées avec E2 (0, 0,1, 1, 10 et 100 nM) ou une combinaison de E2 et P4 (0-0, 100-0, 100-10 et 100-100 nM) pendant 48 h. Les cellules ont ensuite été transférées dans des plaques à 12 puits recouvertes de gélatine, et 5 à 15 blastocystes ont été ajoutés à chaque puits. Chaque groupe a été répliqué 3 fois et les taux d’implantation ont été déterminés après 48 h.
Les résultats ont démontré que des concentrations quasi physiologiques de E2 (10 nM) augmentaient les taux d’implantation embryonnaire par rapport à 0 nM E2. Cependant, des concentrations ultra-élevées de E2 (100 nM) ont considérablement réduit les taux d’implantation d’embryons. L’ajout de P4 dose-dépendant a atténué les effets négatifs de l’ultra-haute E2 sur l’implantation (Figure 6). Sur la base de ce modèle in vitro , nous illustrons les effets négatifs des concentrations ultra-élevées d’œstrogènes non physiologiques sur l’implantation de l’embryon et introduisons davantage l’application de ce modèle dans la recherche scientifique.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66873/66873fig01.jpg"> Figure 1 : Excision de l’oviducte de souris. Étirez l’oviducte, l’ovaire et les coussinets adipeux avec une pince, et coupez d’abord l’oviducte et l’ovaire avec des ciseaux, puis excisez l’oviducte de l’utérus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66873/66873fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66873/66873fig02.jpg"> Figure 2 : Extraction de zygotes. L’ampoule d’élargissement de la trompe de Fallope est perforée à l’aide d’une pince pour libérer le complexe cumulus-zygote. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66873/66873fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66873/66873fig03.jpg"> Figure 3 : Isolement de zygotes nus avec digestion à l’hyaluronidase. À l’aide d’une pince, transférez avec précaution le complexe cumulus-zygote dans une solution M2 contenant 0,5 mg/mL d’hyaluronidase, et laissez-le pendant quelques minutes jusqu’à ce que les cellules du cumulus se détachent des zygotes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66873/66873fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66873/66873fig04.jpg"> Figure 4 : Culture in vitro d’un embryon de souris. Préparez 12 microgouttelettes de milieu KSOM, chacune d’un volume de 20 μL. Couvrez les microgouttelettes avec 3 à 5 ml d’huile minérale. Transférez les embryons de souris du milieu M2 vers la moitié supérieure des microgouttelettes KSOM pour un lavage en profondeur, placez les embryons lavés dans la moitié inférieure et incuberez-les à 37 °C avec 5% de CO2 pendant 4 jours. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66873/66873fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66873/66873fig05.jpg"> Figure 5 : Implantation de l’embryon. Placez délicatement 5 à 15 blastocystes frais dans chaque puits de la plaque de 12 puits contenant des cellules d’Ishikawa pour la co-culture. Après 48 h d’incubation, déplacer rapidement la plaque 3x. Les embryons non attachés présenteront un mouvement flottant ou roulant à la surface des cellules d’Ishikawa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66873/66873fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66873/66873fig06.jpg"> Figure 6 : Effet de l’œstrogène à très haute concentration sur le taux d’implantation de l’embryon. L’astérisque indique une différence statistiquement significative, P &lt; 0,05. Abréviations : E2 = œstradiol ; P4 = progestérone. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66873/66873fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Ce protocole décrit des méthodologies permettant d’établir un modèle in vitro simple et efficace d’implantation embryonnaire pour évaluer les molécules pertinentes affectant le processus d’implantation embryonnaire.

Etablissement d’un modèle d’implantation embryonnaire in vitro

Embryo implantation is the first step in the establishment of a successful pregnancy. An in vitro model for embryo implantation is critical for basic ...

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