Électropénétrographie AC-DC pour l’étude des comportements de sonde et d’ingestion des moustiques Culex tarsalis sur les mains humaines

Notre groupe utilise l’EPG pour étudier comment les arbovirus et d’autres facteurs affectent les comportements de sonde et d’ingestion qui se produisent pendant l’alimentation sanguine, car de nombreux agents pathogènes manipulent le comportement des vecteurs pour améliorer la transmission. Fondamentalement, nous étudions ce qui se passe lors d’une piqûre de moustique et comment ces comportements influencent la transmission des agents pathogènes et la pathologie de la maladie. Historiquement, l’EPG était principalement utilisé pour étudier les insectes phytophages.

Le développement récent de procédures EPG AC-DC pour les arthropodes hématophages nous permet d’étudier les comportements de sonde et d’ingestion qui se produisent pendant l’alimentation sanguine avec un niveau de détail sans avoir besoin de procédures invasives, ce qui permet peut-être de développer de nouvelles stratégies de gestion. Le plus grand défi de l’utilisation de l’EPG sur des arthropodes hématophages est de corréler les formes d’onde avec des activités biologiques telles que la salivation et la transmission d’agents pathogènes. Nous avons de solides hypothèses basées sur les origines électriques des formes d’onde et la littérature, mais nous avons encore besoin de preuves empiriques.

Pour commencer, passez la pointe d’une pipette de pâturage en verre dans une flamme, en tournant légèrement la pipette. Inspectez le diamètre et répétez l’opération pour amener la pipette à la taille souhaitée. Pour fabriquer un aspirateur d’insectes, couvrez la grande extrémité de la pipette de pâturage modifiée avec une moustiquaire et insérez-la dans le tube en silicone relié à un aspirateur de laboratoire en fixant la jonction avec du ruban isolant.

Pour les électrodes d’enregistrement, enveloppez un bloc de mousse avec une pellicule plastique fraîche pour contenir les mégots d’insectes préparés et les moustiques câblés. Grattez le centimètre supérieur du fil de cuivre avec une lame de rasoir jusqu’à ce qu’il soit brillant de tous les côtés. Ensuite, coupez du fil d’or de 0,025 millimètre de diamètre en morceaux de quatre à cinq centimètres de long.

Tenez le fil dans une pince à fermeture automatique masquée avec du ruban adhésif pour éviter de bosseler le fil, enroulez doucement le fil d’or trois fois autour du fil de cuivre de l’embout d’insecte en commençant le long de la pointe propre du fil de cuivre. Utilisez une sonde de dissection pour appliquer de la colle argentée afin de maintenir le fil d’or en place. Après vous être assuré qu’il n’y a pas d’extrémité lâche, placez le bout d’insecte dans la mousse jusqu’à ce que la colle sèche.

Ensuite, caressez doucement le fil d’or attaché au bout de l’insecte pour lui donner un arc long et doux, et coupez le fil à environ 2,5 à 3 centimètres de longueur. En travaillant sous un microscope de dissection, tenez l’insecte par le clou en laiton avec la main non dominante pendant que le fil d’or touche la platine du microscope de dissection et saisissez l’extrémité du fil d’or avec une pince à pointe fine à l’aide de la main dominante, utilisez la pince à pointe fine pour croiser la pointe du fil d’or sur le fil de cuivre de l’embout d’insecte près de la zone collée. Ensuite, tirez doucement sur le bout de l’insecte jusqu’à ce que le fil d’or forme une petite boucle d’or autour de la pince à pointe fine.

Relâchez le fil d’or et retirez délicatement la pince. Tout en tenant le bout de l’insecte dans la main non dominante, saisissez la boucle dorée avec une pince à pointe fine. Tirez sur l’embout d’insecte tout en tournant légèrement la pince pour l’éloigner de l’embout jusqu’à ce que la boucle se plie à un angle de 90 degrés par rapport au col du fil.

Assurez-vous que la boucle dorée est complètement fermée avant de remettre le bout d’insecte dans le bloc de mousse. Pour commencer, préparez l’aspirateur d’insectes et les électrodes d’enregistrement pour le câblage des moustiques. Positionnez les moustiques anesthésiés sur le dos sur le coussin d’anesthésie, l’abdomen face au chercheur.

Après avoir placé un ruban de laboratoire, appliquez une goutte de 0,5 centimètre de colle argentée fraîchement mélangée sur le ruban. Ensuite, aspirez l’abdomen d’un moustique anesthésié dans l’aspirateur. En utilisant l’aspiration juste assez longtemps pour asseoir l’abdomen en place, et maintenez le moustique sous la lunette de dissection au-dessus de la colle argentée à l’aide de l’aspirateur.

Après avoir trempé une épingle de minucin dans la colle à argent, appliquez une fine couche sur le pronotum du moustique. Trempez rapidement la boucle d’or à l’extrémité de l’électrode d’enregistrement dans la colle argentée. Placez-le sur le point de colle argentée sur le pronotum du moustique et balancez la boucle d’avant en arrière pour vous assurer qu’elle est bien alignée.

Ensuite, replacez le bout d’insecte dans la mousse à un angle qui permet au moustique filaire de se tenir confortablement au réveil. Une fois que le nombre souhaité de moustiques est câblé, placez le bloc de mousse dans une boîte de rangement et entretenez-le. Pour commencer, fixez les électrodes d’enregistrement aux moustiques le jour de l’expérience d’électropénographie ou d’EPG.

Une fois l’hôte en position, tournez l’amplificateur de tête sur le côté. Après avoir retiré un moustique câblé, insérez la goupille en laiton de l’insecte dans le port de l’amplificateur de tête. Démarrez l’enregistrement à l’aide du logiciel de gestion du matériel.

Positionnez l’amplificateur de tête au-dessus de la main afin que le moustique puisse se tenir confortablement debout et sonder. Allumez l’amplificateur de tête lorsqu’il est mis à la terre. Ajustez la position de la main de l’hôte au besoin pour aider à sonder le succès.

Utilisez le logiciel de gestion du matériel pour effectuer des observations horodatées concernant les réponses de l’hôte, les comportements des moustiques, les changements de gain et d’autres événements pertinents pendant l’enregistrement. Ajustez la position des signaux à l’écran et le gain logiciel à l’aide du logiciel de gestion matérielle pour que les deux signaux restent clairement visibles. Pour régler le gain matériel, basculez la plage du canal un et les commutateurs multiplicateurs.

Si ce réglage n’est pas suffisant, tournez la molette de gain du premier canal vers la droite ou la gauche pour augmenter ou diminuer le gain respectivement afin d’éviter les pics ou les pics incertains. Pour régler le décalage, basculez l’interrupteur de décalage du canal un sur le boîtier de commande sur neg. Tournez ensuite le cadran de décalage de la chaîne jusqu’à ce que les pics des signaux pré et post se produisent dans la même direction sur l’écran de l’ordinateur.

Si le moustique est au milieu d’une sonde, laissez-la finir. S’il ne sonde pas dans les 10 minutes, éteignez l’amplificateur de tête. Demandez à l’hôte de retirer soigneusement sa main, puis retirez le moustique avec le bout d’insecte attaché.

Enfin, replacez le moustique dans la boîte de rangement. Les enregistrements EPG AC-DC de moustiques Culex tarsalis se nourrissant de mains humaines ont généré des formes d’onde interprétables adaptées à la classification en familles, types et sous-types.