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</ol>

<table><tbody><tr><td>-80 &deg;C stockage</td><td></td><td></td><td>Pour culture cellulaire</td></tr><tr><td>0,1 % de gélatine dans l'eau</td><td>MilliporeSigma</td><td>ES-006-B</td><td>Pour culture cellulaire</td></tr><tr><td>Unités de filtre 0,2 &micro;m</td><td>Fisher</td><td>04-977-158</td><td>Pour culture cellulaire</td></tr><tr><td>0,5 % de trypsine-EDTA (10X)</td><td>ThermoFisher</td><td>15400-054</td><td>Pour culture cellulaire</td></tr><tr><td>1 M de MgCl2</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9010</td><td>Pour la lyse &amp; la purification par affinité</td></tr><tr><td>1 M de Tris pH 7,5</td><td>ThermoFisher</td><td>15567027</td><td>Pour la lyse &amp; la purification par affinité</td></tr><tr><td>1 M de Tris pH 8</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9855G</td><td>Facultatif: pour insérer FTA dans un locus protéique ribosomal endogène</td></tr><tr><td>Tubes microcentrifugeuse de 1,5 et 2 mL, autoclavés</td><td></td><td></td><td>Pour la transfection</td></tr><tr><td>Tubes microcentrifugeuse de 1,5, 2 et 5 mL à liaison protéique basse</td><td>Eppendorf</td><td>022431081, 022431102, 0030108302</td><td>Pour la lyse &amp; la purification par affinité</td></tr><tr><td>Plaques de culture de tissus de 10 cm</td><td></td><td></td><td>Pour culture cellulaire</td></tr><tr><td>10 M de NaOH</td><td>MilliporeSigma</td><td>72068-100ML</td><td>Pour la lyse &amp; la purification par affinité</td></tr><tr><td>Concentré de tampon de course Tris/glycine/SDS 10x</td><td>Bio-Rad</td><td>1610772</td><td>Pour le Western blot</td></tr><tr><td>Incubateur de culture de tissus à 37 &deg;C x 2</td><td></td><td></td><td>Pour culture cellulaire. L'un d'entre eux sert d'incubateur principal pour la culture cellulaire et l'illumination des cellules transfectées. Un espace temporaire est nécessaire dans un deuxième incubateur le jour de l'activation d'ALIBi pour accueillir les cellules transfectées tout en installant le transilluminateur dans l'incubateur principal.</td></tr><tr><td>Bain d'eau à 37 &deg;C</td><td></td><td></td><td>Pour culture cellulaire</td></tr><tr><td>5 M de NaCl</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9010</td><td>Pour la lyse &amp; la purification par affinité</td></tr><tr><td>50 mM de biotin</td><td>ThermoFisher</td><td>B20656</td><td>Pour la lyse &amp; la purification par affinité</td></tr><tr><td>Tampon Laemmli 6x</td><td>FIsher</td><td>50-196-784</td><td>Pour le Western blot</td></tr><tr><td>70 % d'éthanol</td><td></td><td></td><td>Pour la désinfection</td></tr><tr><td>Acétonitrile</td><td>Fisher</td><td>A955</td><td>Facultatif: pour la préparation d'échantillons de spectrométrie de masse</td></tr><tr><td>Kit de protéase AcTEV</td><td>ThermoFisher</td><td>12575015</td><td>Pour la lyse &amp; la purification par affinité</td></tr><tr><td>Plasmid ALIBi C-fragment</td><td>Addgene</td><td>#235615, 235636 &ndash; 235641</td><td>L'échelle midi-prep est requise pour la transfection</td></tr><tr><td>Plasmid ALIBi N-fragment</td><td>Addgene</td><td>#235614, 235635, 235642, 235643</td><td>L'échelle midi-prep est requise pour la transfection</td></tr><tr><td>Papier aluminium</td><td></td><td></td><td>Pour la lyse &amp; la purification par affinité</td></tr><tr><td>Bicarbonate d'ammonium</td><td>MilliporeSigma</td><td>5.3305</td><td>Facultatif: pour la préparation d'échantillons de spectrométrie de masse</td></tr><tr><td>Anticorps anti-FLAG</td><td>MilliporeSigma</td><td>F3165</td><td>Pour le Western blot</td></tr><tr><td>Anticorps anti-GAPDH</td><td>Cell Signaling</td><td>5174</td><td>Pour le Western blot</td></tr><tr><td>Anticorps anti-souris secondaire</td><td>GE Healthcare</td><td>NA931V</td><td>Pour le Western blot</td></tr><tr><td>Anticorps anti-lapin secondaire</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934V</td><td>Pour le Western blot</td></tr><tr><td>Anticorps anti-Rpl12</td><td>Abcam</td><td>ab175219</td><td>Pour le Western blot</td></tr><tr><td>Anticorps anti-Rpl31</td><td>Abcam</td><td>ab103991</td><td>Pour le Western blot</td></tr><tr><td>Anticorps anti-Rpl5</td><td>ProteinTech</td><td>15430-1-AP</td><td>Pour le Western blot</td></tr><tr><td>Anticorps anti-V5</td><td>ThermoFisher</td><td>R960-25</td><td>Pour le Western blot</td></tr><tr><td>Apyrase</td><td>NEB</td><td>M0398L</td><td>Pour la lyse &amp; la purification par affinité</td></tr><tr><td>Bêta-mercaptoéthanol (55 mM)</td><td>ThermoFisher</td><td>21985-023</td><td>Pour culture cellulaire</td></tr><tr><td>Transilluminateur à lumière bleue</td><td>Clare Research Chemical</td><td>DR46B (petit) ou DR196 (grand)</td><td>Pour la lyse &amp; la purification par affinité</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td>Pour le Western blot</td></tr><tr><td>Pointes C18 (pointes OMIX C18)</td><td>Agilent</td><td>A57003100</td><td>Facultatif: pour la préparation d'échantillons de spectrométrie de masse</td></tr><tr><td>Conteneur de congélation cellulaire</td><td></td><td></td><td>Pour culture cellulaire</td></tr><tr><td>Centrifugeuse adaptée pour les tubes coniques de 15 mL et/ou 50 mL</td><td></td><td></td><td>Pour culture cellulaire</td></tr><tr><td>Centrifugeuse pour tubes microcentrifugeuse de 1,5-2 mL</td><td></td><td></td><td>Pour la lyse &amp; la purification par affinité. Doit être capable de réfrigération jusqu'à 4 C et de vitesses allant jusqu'à 17 000 g. Idéalement, il est situé dans une pièce qui peut être temporairement obscurcie lors du transfert des tubes à l'intérieur et à l'extérieur.</td></tr><tr><td>Kit ECL Clarity</td><td>Bio-Rad</td><td>170-5061</td><td>Pour le Western blot</td></tr><tr><td>Réservoir de gel Criterion</td><td>Bio-Rad</td><td>1656001</td><td>Pour le Western blot</td></tr><tr><td>Gele TGX pré-moulées Criterion, 4-20%</td><td>Bio-Rad</td><td>5671095</td><td>Pour le Western blot. Tailles et dispositions de puits supplémentaires disponibles</td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>MilliporeSigma</td><td>C7698-5G</td><td>Pour la lyse &amp; la purification par affinité</td></tr><tr><td>Déoxycholate</td><td>MilliporeSigma</td><td>S1827</td><td>Pour la lyse &amp; la purification par affinité</td></tr><tr><td>Dithiothréitol</td><td>ThermoFisher</td><td>PIA39255</td><td>Facultatif: pour la préparation d'échantillons de spectrométrie de masse</td></tr><tr><td>DPBS, sans calcium, sans magnésium</td><td>ThermoFisher</td><td>14190-250</td><td>P

isolement des sous-populations de ribosomes subcellulaires basé sur la biotinylation enrichie par éclairage restreinte par peptide peptidique spécifique à la marque de recombinaison

Isolation of Subcellular Ribosome Subpopulations Based on Recombinant Peptide Tag-Specific Location-Restricted Illumination-Enhanced Biotinylation

Isolement des sous-populations de ribosomes subcellulaires basé sur la biotinylation enrichie par éclairage restreinte par peptide peptidique spécifique à la marque de recombinaison

Growing evidence suggests that mRNA translation is a highly compartmentalized process within a cell, and that subcellular trafficking and localization of ...

Our research investigates how ribosome composition and mRNA translation vary across subcellular domains to regulate local protein synthesis. Current methods lack spatial and temporal precision. ALIBi addresses this through optogenetically controlled proximity labeling of ribosomes.To begin, obtain L31FTA mouse embryonic stem cells and transfect them with ALIBi, GFP control, or full length BirA plasmids. After 24 to 48 hours of transfection, pre-chill the centrifuge to four degrees Celsius. With the lights off, move the transfected plates to a temporary 37-degree Celsius incubator.To prevent temperature fluctuations, once the transilluminator is placed in the main incubator, using 70%ethanol, wipe down the blue light transilluminator. After connecting the transilluminator to power, place it in the main incubator. Allow the incubator conditions to reequilibrate, while continuing the setup.Warm an aliquot of media to 37 degrees Celsius for dosing with biotin and cyclohexamide, or CHX. If preparing control samples without supplemental biotin, warm a separate aliquot for CHX-only dosing. Chill an aliquot of DPBS intended for CHX dosing.Prepare the RNase removal buffer, salt wash, lysis buffer, and wash buffers. Using a pipette, mix buffers containing dense or viscous components to ensure even mixing. Chill the prepared buffers on ice before use.Re-suspend the stock bottle of streptavidin beads by gentle pipetting or rocking. Transfer 450 microliters of beads into a protein low binding tube for each 10 centimeter plate of cells. Place the re-suspended beads on the magnetic rack for one minute, or until the beads have fully migrated.Aspirate and discard the bead storage buffer without touching the bead pellet. Wash the beads two times with 900 microliters of RNAs removal buffer. Wash the beads once with 900 microliters of salt wash.Wash the beads two times with 900 microliters of wash I buffer. Store the beads in the wash I buffer at four degrees Celsius while performing activation and cell lysis. Add biotin and CHX to the warmed aliquot of media and keep at 37 degrees Celsius until use.Add CHX to the cold DPBS aliquot and keep it chilled until use. Aspirate the media from the transfected plates. Immediately add 10 milliliters of warm media containing CHX with or without Biotin to each plate.Place negative control plates in a dark incubator. Place the remaining plates directly on top of the transilluminator. Turn on the transilluminator and incubate the plates for 15 minutes.Wash each plate two times with the 10 milliliters of cold DPBS containing CHX. Place the plates on ice between and after washes. After aspirating the second wash, tilt the plate and aspirate any residual DPBS.Keeping the plate flat on ice, add two milliliters of ice-cold lysis buffer and incubate the plate on ice for five minutes. Tap the plate two to three times during incubation to dislodge cells. Using a micropipette, pipette the lysate up and down across the plate surface to dislodge any remaining cells.Transfer the lysate to a chilled labeled protein low binding tube. In difficult to lyse organelles, sonicate all samples for 45 seconds at four degrees Celsius. And if required, transfer the lysate into a larger tube before sonication.Transfer the sonicated lysate into a two-milliliter tube. Incubate the lysate on ice for 15 minutes. Centrifuge the lysate at 17, 000 G for three minutes at four degrees Celsius.Transfer the supernatant into a chilled protein low binding tube without disturbing the pellet. Using a magnetic rack, pellet the washed strepped avident beads. Aspirate the wash one buffer.Transfer 1, 200 microliters of clarified lysate to the tube containing the washed beads. Pipette up and down gently to re-suspend the beads. Store the remaining clarified lysate at minus 80 degrees Celsius.Incubate the lysate with the beads at four degrees Celsius in the dark on a tube rotator for one hour. During the incubation, prepare the Tobacco Etch Virus, or TEV elution buffer. Pellet the beads on a magnetic rack.Transfer the supernatant to a chilled protein low binding tube. Store the supernatant at minus 80 degrees Celsius. Wash the beads two times with 900 microliters of wash I buffer and once with 900 microliters of wash II buffer.Add 450 microliters of TEV elution buffer to the beads. Incubate the beads in TEV elution buffer for one hour at room temperature on a tube rotator. Pellet the beads on the magnetic rack.Transfer the elute to a protein low binding tube. Store the eluate at minus 80 degrees Celsius if proteomics analysis or Western blot is intended. Cells containing all system components showed a L31-FTA band, which was stronger with full length burray and faint or absent when components were omitted.Endogenous biotinilated carboxylase proteins were detected in all lysates at 70 to 80 kilodaltons and 120 to 130 kilodaltons. ANTV5 probing confirmed expression of the split bore fragments. Biotinillated L31FTA decreased in the flow through relative to the lysate.No biotinillated L31-FTA was present in the eluate following TEV-mediated elution. Anti-flag probing showed a cleaved L31-FTA band at a lower molecular weight than intact L31-FTA ribosomal protein. S12 probing demonstrated the presence of the small ribosomal subunit in the eluate.Anti-V5 probing showed that proteins that do not bind the ribosome were absent from the eluate. When 2.5 fold more lysate was used with the same 450 microliters of streptavidin coated beads, a substantial amount of biotinilated L31-FTA remained in the flow through. Endogenous biotinilated proteins were partially depleted in the flow through.Endogenous biotinillated proteins were absent from the eluet, but were recovered after heating post-dilution beads in lambly buffer. Anti-flag probing detected cleaved L31-FTA at a lower molecular weight than intact L31-FTA. Anti-V5 probing showed that the split burray fragments were absent from the eluate.ALIBi enables the identification of ribosome-bound proteins and mRNAs in specific subcellular regions, revealing differences in translation regulation. The key challenge is maintaining specific proximity labeling through careful control of targeting construct expression and illumination conditions. Following this protocol, affinity purified ribosomes and associated mRNAs can be analyzed using quantitative proteomic and transcriptomic approaches.

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Biologie

Un obstacle majeur à des analyses biochimiques des ribosomes contenant naissante peptidyl-ARNt a été la présence de ribosomes d'autres dans les mêmes échantillons, les ribosomes pas impliqué dans la traduction de la séquence d'ARNm spécifiques en cours d'analyse. Nous avons développé une méthodologie simple pour purifier, en exclusivité, les ribosomes contenant la naissante peptidyl-ARNt d'intérêt.

Isolement des ribosomes Traduire Contenant Peptidyl-ARNt pour des analyses fonctionnelles et structurelles

Une technique pour identifier les sites de pause translationnelle sur l'ARNm est décrite. Cette procédure est basée sur l'isolement des polypeptides naissants qui s'accumulent sur les ribosomes lors de la traduction in vitro d'un ARNm cible, suivie par l'analyse de la taille des chaînes naissantes en utilisant une électrophorèse sur gel dénaturant.

Isolement du ribosome Bound polypeptides naissants<em&gt; In vitro</em&gt; Pour identifier les sites de pause de translation le long d&#39;ARNm

Nous décrivons ici une technique qui est maintenant couramment utilisé pour isoler de manière stable liés ribosome complexes de la chaîne naissante (RNC). Cette technique tire parti de la découverte que de 17 acides aminés de long "séquence d'arrêt" SecM peut arrêter élongation de la traduction dans un procaryote...

Utilisation de la séquence d&#39;arrêt SecM comme un outil pour isoler les polypeptides Ribosome Bound

Techniques pour disséquer les mécanismes qui sous-tendent la sécrétion de HIV-1 Nef dans exosomes sont décrits. Peptides courts spécifiques provenant de Nef et la transfection de protéines ont été exploités pour déterminer la structure, la fonction et les partenaires de liaison de la sécrétion Modification de la région de Nef. Ces procédures présentent un intérêt général dans de nombreuses études mécanistes.

Identification de Motifs Fonctionnelles et leurs PARTENAIRES DE LIAISON Peptide-basée sur

Ce protocole illustre modifications essentielles de polyribosome fractionnement afin d'étudier la translatome de vivo échantillons dans le SNC. Il permet une évaluation globale de la régulation de la traduction et de la transcription par l'isolement et la comparaison de l'ARN total à ribosome fractions d'ARN liés.

En Interrogation in vivo de système nerveux central Translatome par polyribosome fractionnement

Nous décrivons ici une méthode d’identification des protéines de liaison aux petites molécules à l’aide du marquage par photoaffinité. L’avantage de cette technique est que la liaison et le marquage covalent des protéines cibles se produisent dans l’environnement cellulaire vivant, éliminant ainsi le risque de perturber la structure des protéines natives et les conditions de liaison lors de la lyse cellulaire.

Identification des protéines de petites molécules de liaison dans un Natif cellulaire Environnement par des cellules vivantes photoaffinité Étiquetage

Nous présentons une méthode pour la purification, la détection et l’identification des peptides diGly qui proviennent de protéines ubiquitinées à partir d’échantillons biologiques complexes. La méthode présentée est reproductible, robuste et surpasse les méthodes publiées par rapport au niveau de profondeur de l’analyse ubiquitinome.

Détection des sites d’ubiquitination des protéines par l’enrichissement du peptide et la spectrométrie de masse

Ici, nous décrivons l’immunoprécipitation des ribosomes et de l’ARN associé de populations choisies de cellules mâles adultes de germe de souris utilisant le système de RiboTag. La reproduction stratégique et l’immunoprécipitation soigneuse donnent des résultats propres et reproductibles qui informent sur le translatome des cellules germinales et donnent un aperçu des mécanismes des phénotypes mutants.

Immunoprécipitation de RiboTag dans les cellules germinales de la souris mâle

Le transfert d’énergie de fluorescence à molécule unique est une méthode qui suit la dynamique de l’ARNt pendant la synthèse des protéines ribosomiques. En suivant les ribosomes individuels, des populations inhomogènes sont identifiées, ce qui met en lumière les mécanismes. Cette méthode peut être utilisée pour suivre les changements conformationnels biologiques en général afin de révéler les relations dynamique-fonction dans de nombreux autres biosystèmes complexes. Les méthodes à molécule...

Étude de transfert d’énergie de fluorescence à molécule unique de synthèse de protéines ribosomes

Les interactions co-traductionnelles jouent un rôle crucial dans les modifications de la chaîne naissante, le ciblage, le pliage et les voies d’assemblage. Nous décrivons ici le profilage sélectif des ribosomes, une méthode d’analyse directe in vivo de ces interactions dans le modèle eucaryote Saccharomyces cerevisiae.

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Nous présentons un protocole en deux étapes pour l’isolement de mitochondries de haute qualité qui est compatible avec la découverte et la quantification des protéines à l’échelle du protéome. Notre protocole ne nécessite pas de génie génétique et convient donc à l’étude des mitochondries de toutes les cellules et tissus primaires.

Isolement sans marquage en deux étapes des mitochondries pour améliorer la découverte et la quantification des protéines

Stanford School of Medicine.  La Biotinylation par illumination restreinte par localisation spécifique à AviTag (ALIBi) est une méthode novatrice activée par l’optogénétique développée pour marquer et purifier par affinité les populations subcellulaires de ribosomes pour le séquençage en aval et l’analyse protéomique.

Isolement des sous-populations de ribosomes subcellulaires basé sur la biotinylation enrichie par éclairage restreinte par peptide peptidique spécifique à la marque de recombinaison

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