Name: Quantification du niveau de 8-oxo-dG à l’aide d’un test ELISA pour évaluer les dommages oxydatifs à l’ADN dans les cellules MCF-7 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-24T14:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 13 s
Description: Apprenez à quantifier les dommages oxydatifs de l'ADN par ELISA dans les cellules MCF-7. Cette méthode efficace mesure le 8-oxo-dG pour évaluer l'impact du peroxyde d'hydrogène sur l'ADN.

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Ce travail a été soutenu par l’équipe de recherche innovante de l’établissement d’enseignement supérieur du Jiangsu pour la science et la technologie (2021), le programme du centre de recherche sur la technologie de l’ingénierie du collège professionnel du Jiangsu (2023), le programme technologique clé des projets technologiques de subsistance du peuple de Suzhou (SKY2021029), le projet ouvert de la biobanque de ressources cliniques du Jiangsu (TC2021B009), le projet du laboratoire clé d’État de médecine et de protection contre les radiations, Université Soochow (GZK12023013), programmes du Collège de santé professionnelle de Suzhou (SZWZYTD202201) et projet Qing-Lan de la province du Jiangsu en Chine (2021, 2022).

1. Construction d’unmodèle d’endommagement oxydatif de l’ADN induit par H2O2 dans des cellules MCF-7
<ol><li>Récupération de cellules MCF-7<ol><li>Transférez rapidement le tube cryogénique de culture cellulaire, qui contient 3,5 x 106 cellules MCF-7 et est stocké dans un réfrigérateur à -80 °C, dans une boîte en mousse contenant de l’azote liquide. Récupérez le tube à l’aide d’une pince et placez-le dans un bain-marie à température constante de 37 °C pendant environ 1 min pour décongeler les cellules préservées. REMARQUE : Pendant le processus de décongélation au bain-marie, secouez les cellules par intermittence pour assurer un chauffage uniforme du cryoflacon.</li>
		<li>Placez le cryoflacon dans une centrifugeuse et centrifugez-le à température ambiante à 150 x g pendant 5 min.</li>
		<li>À l’aide d’une pipette, jeter le surnageant du tube de stockage cryogénique et ajouter 1 mL de milieu de culture complet. Bien mélanger et transférer dans une boîte de culture de 10 mm, compléter 7 ml supplémentaires de milieu de culture complet.</li>
		<li>Agitez la boîte de culture de manière entrecroisée pour assurer un mélange uniforme, et cultivez dans un incubateur de CO2 à 37 °C avec 5 % de CO2. REMARQUE : Le milieu de culture complet est constitué d’un milieu de culture DMEM complété par 10 % de sérum fœtal bovin, 1 % de pénicilline et de streptomycine.</li>
	</ol></li>
	<li>Évaluation de la viabilité cellulaire<ol><li>Sélectionnez des cellules MCF-7 dans la phase de croissance logarithmique avec un bon état cellulaire pour l’expérience. Au cours de la phase de croissance logarithmique, les cellules présentent généralement un cycle de division plus court et une fréquence élevée de division cellulaire.<ol><li>Observez la morphologie et le taux de croissance des cellules MCF à l’aide d’un microscope électronique. Lorsque les cellules présentent une morphologie monocouche uniforme et densément tassée, et que la prolifération cellulaire est évidente, il peut être déterminé que les cellules sont essentiellement dans la phase de croissance logarithmique.</li>
		</ol></li>
		<li>Lavage des cellules : À l’aide d’une pipette, retirez le milieu de culture de la boîte de culture, ajoutez 1 ml de tampon PBS pour laver les cellules, puis jetez le PBS.</li>
		<li>Détachement cellulaire : Ajouter 1 mL de trypsine pour laver les cellules, attendre environ 1 min pour que la trypsine détache complètement les cellules de la boîte de culture. Tapotez doucement la coupelle de culture ; observation des mouvements cellulaires en feuilles indique un détachement complet de la cellule.</li>
		<li>Fin du détachement cellulaire et comptage des cellules : Ajouter 8 mL de milieu de culture complet pour terminer le détachement, pipeter doucement les cellules et déterminer la concentration en suspension cellulaire à l’aide d’un appareil de comptage cellulaire. REMARQUE : Assurez-vous que la suspension cellulaire est homogène avant de compter en pipetant doucement de haut en bas.</li>
		<li>Ensemencement cellulaire : Ajustez la suspension cellulaire diluée pour obtenir une densité cellulaire de 5 000 cellules par 100 μL. Inocuculez la suspension cellulaire dans 21 puits d’une plaque de 96 puits à l’aide d’un pistolet à pipette, en distribuant 100 μL dans chaque puits. Ajouter 100 μL de tampon PBS aux puits environnants des puits ensemencés pour éviter une évaporation excessive du milieu de culture.</li>
		<li>Préparation d’un milieu contenant du H2O2 : Choisir 9 puits sur la plaque de culture cellulaire à 12 puits et attribuer des étiquettes en fonction du gradient des concentrations en H2O2 (0, 0,25, 0,50, 0,75, 1,0, 1,5, 2,0 mM). Ajouter 720 μL de milieu complet dans les puits étiquetés comme 2,0 mM et 1,5 mM et ajouter 360 μL de milieu complet dans les puits restants.<ol><li>À l’aide d’une pipette, versez 1,63 μL et 1,22 μL de réactif 3 % H2O2 dans les puits étiquetés comme 2,0 mM et 1,5 mM, respectivement. Mélangez bien la solution. À l’aide d’une pipette, transvaser 360 μL de 2,0 mM H2O2 dans le 1,0 mM bien étiqueté et mélanger ; ensuite, transvaser 360 μL de 1,0 mM H2O2 dans le 0,5 mM bien marqué et mélanger ; et enfin transférer 360 μL de 0,5 mM H2O2 dans le 0,25 mM bien marqué. Pipette 360 μL de 1,5 mM H2O2 dans le puits bien étiqueté de 0,75 mM pour diluer et atteindre la concentration souhaitée. (Figure 1). REMARQUE : Assurez-vous que la solution mère H2O2 dans la pipette est complètement transférée dans les puits pour éviter toute solution résiduelle. Assurez-vous de bien mélanger les solutions avant de procéder à la dilution.</li>
		</ol></li>
		<li>Incubation : Après environ 24 h d’ensemencement cellulaire, à l’aide d’une pipette, retirer le milieu de culture de la plaque à 96 puits une fois que les cellules ont adhéré aux surfaces. Selon le gradient de concentration, ajouter le milieu contenant du H2O2 respectif dans chaque puits. Remettez la plaque dans l’incubateur pendant 12 h.</li>
		<li>Ajout du réactif CCK-8 : Après la période de traitement désignée de 12 h, utiliser une pipette pour retirer le milieu de culture de la plaque à 96 puits, ajouter 100 μL de milieu de culture complet et 10 μL de réactif CCK-8 dans chaque puits, et inclure trois puits de contrôle à blanc. Incuber la plaque à 37 °C pendant 2 h. REMARQUE : Pendant le processus d’ajout d’échantillons, évitez la formation de bulles pour éviter toute interférence avec la lecture de la valeur OD.</li>
		<li>Mesure de l’absorbance : Sortez la plaque à 96 puits de l’incubateur, mesurez l’absorbance à une longueur d’onde de 450 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques et enregistrez les résultats.</li>
		<li>Selon la formule de calcul de l’IC50 , taux d’inhibition (%) = (DO du groupe expérimental du médicament-DO moyenne du trou de contrôle du médicament)/ (DO moyenne du trou de contrôle cellulaire-DO moyenne du trou de contrôle du médicament) x 100% Calculer les résultats en pourcentage de l’absorbance dans les cultures témoins.</li>
		<li>Importez les données expérimentales traitées dans un logiciel d’analyse statistique, sélectionnez le type d’analyse Régression non linéaire, construisez le modèle logistique à quatre paramètres et cliquez sur le bouton Ajuster la courbe pour l’ajustement de la courbe . Après le processus de montage, le logiciel calculera automatiquement la valeur IC50 .</li>
	</ol></li>
	<li>Expérience d’oxydation cellulaire MCF-7 induite par H2O2<ol><li>Récupérer des cellules MCF-7 dans la phase de croissance logarithmique avec un bon état cellulaire pour l’expérimentation.</li>
		<li>Lavez, effectuez le détachement des cellules, terminez le détachement et comptez les cellules (reportez-vous à l’étape 1.2 pour les méthodes spécifiques).</li>
		<li>Ensemencement cellulaire : Ajuster la densité de la suspension cellulaire à 1 x 106 cellules par boîte, avec 4 mL de suspension par boîte de 6 cm de diamètre.</li>
		<li>Étiquetez deux tubes de microcentrifugation de 5 mL comme 0,25 mM et 0,75 mM 3% H2O2. Ajouter 4 mL de milieu complet dans chaque tube, puis ajouter 1,13 μL et 3,40 μL de 3 % H2O2, respectivement. Secouez doucement les tubes pour assurer un mélange complet. Remplacer le milieu de culture dans les trois boîtes par un milieu complet contenant des concentrations de H2O2 de 0, 0,25 et 0,75 mM.</li>
		<li>Incuber les cultures : Remettre les plats dans l’incubateur pendant 12 h.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Préparation des échantillons cellulaires et préparation des réactifs ELISA
<ol><li>Collecte d’échantillons d’extraits cellulaires<ol><li>Prélèvement d’échantillons : Jeter le surnageant de culture cellulaire MCF-7, rincer, effectuer le détachement des cellules, mettre fin au détachement et prélever les cellules. Transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 ml.</li>
		<li>Centrifugation : Centrifuger à 800 x g pendant 5 min pour recueillir la pastille cellulaire. Ajouter 200 μL de PBS pour remettre en suspension chaque échantillon cellulaire et perturber les cellules par des cycles répétés de congélation-décongélation. Centrifuger le lysat cellulaire à 1 500 x g pendant 10 min et utiliser une pipette pour recueillir le surnageant à des fins d’analyse. REMARQUE : Lorsque la quantité de cellules est faible, réduisez le volume de PBS utilisé pour la remise en suspension. Les échantillons peuvent être conservés à 4 °C jusqu’à 1 semaine si une analyse immédiate n’est pas possible. Pour un stockage à long terme, aliquotez les échantillons en fonction des quantités à usage unique et conservez-les à -80 °C pour éviter les cycles répétés de gel-dégel.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation des réactifs ELISA<ol><li>Décongélation des réactifs : Laisser les réactifs ELISA, y compris les films d’étanchéité, les plaques pré-enrobées, les étalons, le diluant d’échantillon, l’anticorps de détection-HRP, le substrat chromogène, la solution d’arrêt, le tampon de lavage concentré (20x) et les échantillons d’essai atteindre la température ambiante (18-25 °C) pendant 20 min avant de commencer le test. Pré-ouvrez le lecteur ELISA 15 min avant de l’utiliser.</li>
		<li>Préparation du tampon de lavage : Calculez le volume requis de tampon de lavage dilué, puis diluez 20 fois le tampon de lavage concentré avec de l’eau distillée ou désionisée dans 1 solution de travail. Retournez tout tampon de lavage concentré inutilisé dans le réfrigérateur à 4 °C. REMARQUE : Le tampon de lavage doit être préparé frais avant utilisation. Si des cristaux sont présents dans le tampon de lavage concentré conservé dans le réfrigérateur, laissez-le atteindre la température ambiante et secouez-le doucement jusqu’à ce que les cristaux se dissolvent complètement avant de l’utiliser.</li>
		<li>Préparation de la norme<ol><li>Préparer des solutions de travail d’échantillons étalons à des concentrations de 1,25, 2,5, 5, 10, 20 et 40 ng/mL, respectivement. Pour garantir l’exactitude des résultats expérimentaux, mélangez soigneusement les échantillons standard de haut en bas avant utilisation afin d’éviter la formation de bulles pendant le processus de dissolution.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>3. Expérience ELISA
<ol><li>Revêtement des plaques : Concevez à l’avance le nombre total de puits pour les étalons, les échantillons et les ébauches/contrôles et retirez les bandes de plaques requises. Ajouter 50 μL de solution de travail standard et des échantillons de détection de différentes concentrations dans les puits de réaction. Effectuer les étalons en trois exemplaires et s’abstenir d’ajouter des échantillons dans les puits blancs/de contrôle25. REMARQUE : Les étapes expérimentales du test ELISA sont illustrées schématiquement à la figure 2. Si la concentration de l’échantillon dépasse la plage de détection, l’échantillon doit être dilué avec un diluant avant l’échantillonnage. Lors de l’ajout d’échantillons, ajoutez-les au fond de la plaque, en évitant de toucher les parois du puits, secouez doucement pour mélanger et évitez la formation de bulles. Pour garantir l’exactitude de l’expérience, chaque ajout d’échantillon doit être effectué dans un délai de 10 minutes.</li>
	<li>Incubation : À l’exception des puits vierges, ajouter 100 μL d’anticorps de détection conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) dans chaque puits de réaction, sceller les puits à l’aide d’une plaque d’étanchéité et incuber à 37 °C pendant 60 minutes dans un incubateur à température constante.</li>
	<li>Lavage : Jetez le liquide, secouez le liquide dans les puits de la plaque, séchez sur du papier absorbant, ajoutez 350 μL de tampon de lavage dans chaque puits de réaction, laissez reposer pendant 1 à 2 minutes, puis jetez le tampon de lavage. Répétez le processus de lavage 5 fois. REMARQUE : Un lavage en profondeur est crucial car il affecte directement la précision des résultats expérimentaux. Assurez-vous que le tampon de lavage est complètement secoué après chaque lavage. Essuyez soigneusement tout résidu sur le fond de la plaque après le lavage pour éviter d’affecter la mesure de l’absorbance.</li>
	<li>Réaction de couleur : Ajouter 50 μL de substrat A et 50 μL de substrat B dans chaque puits de réaction, sceller la plaque et incuber à 37 °C dans l’obscurité pendant 15 min. REMARQUE : Après avoir ajouté le réactif de couleur, observez rapidement le changement de couleur dans les puits de réaction. Si la couleur est trop foncée, ajoutez la solution d’arrêt pour terminer la réaction plus tôt.</li>
	<li>Terminez la réaction et mesurez l’absorbance : ajoutez 50 μL de solution stop dans chaque puits de réaction et mesurez immédiatement la valeur de DO à une longueur d’onde de 450 nm avec un lecteur ELISA (dans les 15 minutes).</li>
	<li>Analyse des données : Importez les données expérimentales traitées dans le logiciel d’analyse statistique, sélectionnez le type d’analyse Régression linéaire. Construisez une courbe d’étalonnage en traçant la concentration des étalons sur l’axe des X par rapport aux valeurs de densité optique (DO) sur l’axe des Y. Utiliser la courbe d’étalonnage établie pour déterminer la concentration de 8-oxo-dG présente dans les échantillons. Construisez un modèle mathématique logistique et cliquez sur le bouton Ajuster la courbe pour l’ajustement de la courbe. Après le processus de montage, le logiciel calcule automatiquement la courbe standard et la valeur P. REMARQUE : La courbe standard ne peut pas être réutilisée et doit être déterminée à nouveau pour chaque expérience.</li>
</ol>

Détermination du degré de dommages oxydatifs de l’ADN dans les cellules MCF-7

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Le développement de méthodes ELISA revêt une grande importance pour les méthodologies existantes et nouvelles de détection des dommages à l’ADN. Par rapport aux techniques traditionnelles de HPLC et de spectrométrie de masse, cette approche est non seulement conviviale, mais présente également une sensibilité élevée et répond aux exigences du criblage à haut débit30. Cela permet de surveiller le 8-oxo-dG dans des études de dépistage de maladies à grande échelle, ce qui facilite une meilleure compréhension de la corrélation entre ce biomarqueur et diverses maladies.
Au cours des procédures expérimentales, plusieurs étapes critiques sont essentielles pour garantir la fiabilité et la reproductibilité des résultats. Initialement, l’expérience a évalué avec compétence la sensibilité des cellules MCF-7 à H2O2, avec une valeur IC50 de 0,7655 mM à 12 h, mettant en évidence le niveau de tolérance des cellules MCF-7. Ce résultat est d’une grande importance scientifique pour la compréhension des mécanismes de défense antioxydants des cellules MCF-7 et de leur survie sous stress oxydatif, tout en fournissant un indicateur de référence important pour le dépistage futur des médicaments antioxydants ou des mécanismes de traitement connexes31. De plus, la sélection et l’appariement des anticorps 8-oxo-dG sont essentiels pour la détection ELISA et affectent directement la spécificité et la sensibilité du système de détection ELISA. De plus, l’optimisation de la stratégie d’amplification du signal et des étapes de traitement des échantillons sont des facteurs importants qui affectent la précision de la détection. Nous avons constaté que l’utilisation d’un système de réaction de substrat stable peut réduire les erreurs de fond et augmenter la plage de sensibilité de détection.
Au cours du processus expérimental, des problèmes techniques tels que des anticorps instables, des fluctuations de signal et une réactivité croisée des réactifs peuvent survenir. Pour résoudre ces problèmes, nous avons adopté un protocole expérimental plus stable, qui comprenait l’utilisation de solvants d’anticorps stables pour améliorer la stabilité des anticorps et l’optimisation et l’ajustement des conditions expérimentales. De plus, pour remédier à l’erreur causée par les fluctuations du signal, nous avons normalisé l’expérience en utilisant des échantillons standard de 8-oxo-dG pour assurer la cohérence des résultats.
En ce qui concerne les limites de la méthode expérimentale, bien que l’ELISA offre une approche à haut débit, elle peut encore être limitée par la couverture spécifique en anticorps et l’inévitable réactivité croisée du substrat32. Par conséquent, des étapes supplémentaires de purification ou de prétraitement des échantillons peuvent être nécessaires pour les échantillons complexes. De plus, la détection d’échantillons présentant des concentrations plus faibles peut nécessiter une optimisation supplémentaire de l’activité des anticorps pour répondre aux exigences de la recherche.
En conclusion, la méthode de détection ELISA du 8-oxo-dG a des implications importantes pour des domaines de recherche spécifiques. Il a une valeur d’application potentielle dans la surveillance de l’environnement, l’évaluation des risques de maladies et le diagnostic précoce et fournit une nouvelle approche de détection du 8-oxo-dG dans l’agriculture, la sécurité alimentaire et le dépistage des médicaments33. Par exemple, dans le cadre de la biosurveillance environnementale, la détection du stress des dommages oxydatifs de l’ADN causé par les toxines environnementales dans les organismes peut aider à identifier les risques potentiels en temps opportun34. À l’avenir, avec l’optimisation accrue de la technologie de détection et son application dans plusieurs disciplines, cette méthode devrait jouer un rôle plus critique dans la recherche en sciences de la vie.

Les dommages oxydatifs de l’ADN sont la conséquence d’un déséquilibre entre la génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et le système de défense antioxydantcellulaire 1. Il s’agit principalement de l’oxydation de l’ADN, des basespurine et pyrimidine 2,3. Cette modification oxydative des bases de l’ADN compromet non seulement l’intégrité du génome, mais englobe également un large éventail de problèmes pathologiques, notamment le cancer, les maladies neurodégénératives et les maladies cardiovasculaires 4,5. La base guanine de l’ADN a le potentiel de réduction le plus faible et est la plus sensible à l’oxydation6. Par conséquent, la 8-oxo-7,8-dihydro-2'-désoxyguanosine (8-oxo-dG) sert de marqueur primaire pour évaluer l’étendue des dommages oxydatifs de l’ADN 7,8. La quantification précise du 8-oxo-dG est devenue un problème critique pour aborder divers aspects de l’apparition et de la progression de la maladie et de l’évaluation de la charge oxydative multifactorielle9.
Les méthodes traditionnelles de détection du 8-oxo-dG, telles que la chromatographie liquide à haute performance avec détection électrochimique (HPLC-ECD), la spectrométrie de masse et les techniques associées avec trait d’union, présentent une sensibilité et une spécificité élevées 10,11,12. Cependant, ces techniques ont souvent des exigences opérationnelles complexes et des coûts élevés, ce qui entrave leur applicabilité généralisée et leur praticité dans l’analyse d’échantillons à haut débit. Avec les progrès continus de la science et de la technologie, une variété de nouvelles méthodes efficaces et précises ont émergé. L’application de ces nouvelles technologies nous permet de quantifier plus précisément le niveau de 8-oxo-dG et fournit des outils plus puissants pour une étude approfondie de l’association entre le stress oxydatif et la maladie. Par exemple, les chercheurs ont appliqué la technologie des nanopores pour détecter et séquencer quantitativement l’ADN13, identifier les types de dommages à l’ADN à l’aide d’une stratégie de séquençage de code en un seul clic14, développer des méthodes de séquençage à haut débit et créer des biocapteurs basés sur le 8-oxoG en intégrant la biotine-streptavidine à ELISA15. Parmi elles, l’ELISA, avec ses avantages reconnus en termes de spécificité, de criblage à haut débit et de coût, est l’une des solutions idéales pour la détection 8-oxo-dG. Par conséquent, il est crucial de développer une méthode à haut débit, très sensible, pratique et rapide pour détecter le 8-oxo-dG.
La technique ELISA (enzyme-related immunosorbent assay), développée en 197116, a rapidement progressé au cours des 50 dernières années et est maintenant devenue l’une des méthodes de détection les plus couramment utilisées dans les domaines de la biologie et de la médecine 17,18,19. La technologie ELISA présente une sensibilité et une spécificité élevées, possède un temps de réaction court et est facile à utiliser, ce qui en fait un choix largement reconnu pour les tests d’échantillons à grande échelle et l’analyse à haut débit20. Par conséquent, l’ELISA a été largement utilisé pour l’analyse quantitative ou semi-quantitative de composés, de protéines, d’anticorps ou de molécules dans les cellules 21,22,23. Par exemple, il a été utilisé dans la détection de biomarqueurs associés à diverses maladies, résidus de médicaments et biomolécules24. Les tests ELISA peuvent être classés en quatre types principaux sur la base de la conception expérimentale et des principes25. Ces méthodes comprennent l’ELISA direct, l’ELISA indirect, l’ELISA sandwich et l’ELISA compétitif26,27. Parmi ceux-ci, l’ELISA sandwich, qui utilise deux anticorps spécifiques, l’un pour capturer la molécule cible et l’autre pour la détection, a été choisi pour l’étude de cet article. Le principe expérimental de l’ELISA sandwich est le suivant : tout d’abord, un anticorps spécifique est immobilisé dans les puits d’une microplaque pour capturer l’analyte d’intérêt. Après l’ajout de l’étalon ou de l’échantillon, l’analyte cible se lie à l’anticorps immobilisé. Par la suite, un anticorps marqué qui reconnaît un épitope différent sur l’antigène est ajouté, formant une structure sandwich. Après l’élimination des anticorps non liés, un substrat est ajouté. Sous l’action catalytique de l’anticorps secondaire, une réaction de couleur se produit, et l’intensité de la couleur est positivement corrélée à la concentration de l’analyte cible dans l’échantillon. Enfin, la densité optique (DO) a été mesurée pour déterminer la concentration de l’échantillon. L’ELISA sandwich présente les avantages d’une sensibilité et d’une spécificité accrues pour les échantillons cibles, ce qui le rend adapté à la détection de faibles concentrations d’analytes cibles et d’échantillons complexes28. De plus, les résultats obtenus peuvent être quantifiés pour une analyse plus approfondie. Ces facteurs font de l’ELISA sandwich une méthode de détection couramment utilisée dans la recherche scientifique et les laboratoires cliniques29.
Cette étude visait à détecter quantitativement le 8-oxo-dG dans les cellules MCF-7 afin de déterminer le degré de dommages oxydatifs de l’ADN dans les cellules. Cette étude se compose de deux parties principales : la construction d’un modèle de dommages oxydatifs de l’ADN cellulaire MCF-7 et la détection du 8-oxo-dG à l’aide d’ELISA. Tout d’abord, les cellules MCF-7 ont été cultivées in vitro et traitées avec différentes concentrations de H2O2 pendant différentes durées. La viabilité cellulaire a été évaluée à l’aide d’un test CCK-8 pour déterminer la concentration inhibitrice demi-maximale (IC50) de H2O2 dans les cellules MCF-7. Sur la base des valeurs CI50 , un temps de traitementH2O2 et une concentration d’induction appropriés ont été choisis. Pour extraire des échantillons de cellules MCF-7 endommagées par l’oxydation, des échantillons de cellules et de surnageants ont été obtenus et ajoutés à des puits liés à des enzymes préalablement enrobés d’anticorps 8-oxo-dG. Le 8-oxo-dG présent dans l’échantillon se liera aux anticorps liés au porteur en phase solide. Ensuite, des anticorps 8-oxo-dG marqués à la peroxydase de raifort ont été ajoutés. Le mélange réactionnel a été incubé à une température constante pour assurer une liaison complète de l’échantillon et de l’anticorps. L’enzyme non liée a été éliminée par lavage, puis le substrat colorimétrique a été ajouté, ce qui a produit une couleur bleue. Sous l’action de l’acide, la solution est devenue jaune. Enfin, la valeur de DO des échantillons de puits de réaction a été mesurée à 450 nm, et la concentration de 8-oxo-dG dans l’échantillon était proportionnelle à la valeur de DO. En générant une courbe standard, la concentration de 8-oxo-dG dans l’échantillon peut être calculée.

<table><tbody><tr><td>0.25 % Trypsine-EDTA(1x)</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Kit de comptage cellulaire-8</td><td>Dojindo</td><td>CK04</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de comptage</td> cellulaire <td>QiuJing</td><td>XB-K-25</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubateur</td><td>Thermo</td><td>51032872</td><td></td></tr><tr><td>DMEM basic(1X)</td><td>Gibco</td><td>C11995500BT</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>PAN</td><td>ST30-3302</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism X9</td><td>Logiciel GraphPad Logiciel</td><td></td><td>d’analyse statistique</td></tr> centrifugeuse <tr><td>à grande vitesse Thermo</td><td></td><td>&nbsp ; 9AQ2861</td><td></td></tr><tr><td>Humain 8-oxo-dG ELISA Kit</td><td>Zcibio</td><td>ZC-55410</td><td></td></tr><tr><td>L-1000XLS+ Pipettes</td><td>Rainin</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>L-20XLS+ Pipettes</td><td>Rainin</td><td>17014392</td><td></td></tr><tr><td>réservoir d’azote liquide</td><td>Mvecryoge</td><td>YDS-175-216</td><td></td></tr><tr><td>MCF-7 CELL</td><td>BNCC</td><td>BNCC100137</td><td></td></tr><tr><td>Photomètre microplaque Multiskan FC</td><td>Thermo</td><td>1410101</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Solarbio</td><td>P1020</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine Solution, 100X</td><td>Beyotime</td><td>C0222</td><td></td></tr><tr><td>Microscope trinoculaire à cellules vivantes</td><td>Motic</td><td>1.1001E+12</td><td></td></tr><tr><td>Congélateur ultra-basse température</td><td>Haire</td><td>V118574</td><td></td></tr></tbody></table>

quantification du niveau de 8-oxo-dg à l’aide d’un test elisa pour évaluer les dommages oxydatifs à l’adn dans les cellules mcf-7

Quantifying the Level of 8-oxo-dG Using ELISA Assay to Evaluate Oxidative DNA Damage in MCF-7 Cells

La base 8-Oxo-7,8-dihydro-2'-désoxyguanosine (8-oxo-dG) est la forme prédominante de dommages oxydatifs de l’ADN couramment observés. L’altération de l’ADN a un impact profond sur l’expression des gènes et sert de facteur pivot dans la stimulation des troubles neurodégénératifs, du cancer et du vieillissement. Par conséquent, la quantification précise du 8-oxoG a une importance clinique dans l’étude des méthodologies de détection des dommages à l’ADN. Cependant, à l’heure actuelle, les approches existantes pour la détection du 8-oxoG posent des défis en termes de commodité, de rapidité, d’abordabilité et de sensibilité accrue. Nous avons utilisé la technique ELISA (Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent assay), une méthode colorimétrique très efficace et rapide, pour détecter les variations de la teneur en 8-oxo-dG dans des échantillons de cellules MCF-7 stimulés avec différentes concentrations de peroxyde d’hydrogène (H2O2). Nous avons déterminé la concentration de H2O2 qui a induit des dommages oxydatifs dans les cellules MCF-7 en détectant sa valeur IC50 dans les cellules MCF-7. Par la suite, nous avons traité des cellules MCF-7 avec 0, 0,25 et 0,75 mM H2O2 pendant 12 h et extrait le 8-oxo-dG des cellules. Enfin, les échantillons ont été soumis à l’ELISA. Après une série d’étapes, y compris l’étalement de la plaque, le lavage, l’incubation, le développement de la couleur, la fin de la réaction et la collecte de données, nous avons réussi à détecter des changements dans la teneur en 8-oxo-dG dans les cellules MCF-7 induits par H2O2. Grâce à de tels efforts, nous visons à établir une méthode pour évaluer le degré de dommages oxydatifs de l’ADN dans les échantillons cellulaires et, ce faisant, à faire progresser le développement d’approches plus rapides et plus pratiques pour la détection des dommages à l’ADN. Cette entreprise est sur le point d’apporter une contribution significative à l’exploration des analyses associatives entre les dommages oxydatifs de l’ADN et divers domaines, y compris la recherche clinique sur les maladies et la détection de substances toxiques.

Comme l’illustre la figure 3, l’axe des X désigne la concentration de H2O2 appliquée aux cellules MCF-7, tandis que l’axe des Y indique la viabilité des cellules. Le traitement avec 0,75 mM pendant 12 h a réduit la viabilité des cellules MCF-7 à 67 %. Parallèlement à l’augmentation de la concentration, il y a eu une diminution significative de la viabilité des cellules MCF-7, en particulier à une concentration de 1,5 mM, où la viabilité a diminué à moins de 3 % (tableau 1). Les résultats expérimentaux ont suggéré un IC50 de 0,7655 mM pour les cellules MCF-7.
Dans cette série d’expériences, nous avons utilisé une technique ELISA améliorée pour la quantification des niveaux de 8-oxo-dG. Grâce à l’analyse des données, l’équation de régression de la courbe standard est la suivante :
Y = 23,66 × X + 0,07038.
Comme le montre la figure 4A, la courbe d’étalonnage a montré une linéarité élevée (R² = 0,978), et la figure 4B montre que les relations entre les concentrations mesurées de 8-oxo-dG dans les échantillons et les quantités ajoutées correspondantes étaient fortement corrélées, ce qui indique une bonne précision (le coefficient de variation était inférieur à 5 %). De plus, la cohérence des résultats obtenus sur plusieurs répétitions indique la fiabilité et la reproductibilité de la méthode expérimentale.
En résumé, les données expérimentales indiquent que notre méthode ELISA optimisée est capable de détecter avec succès les fluctuations des niveaux de 8-oxo-dG dans des conditions bien contrôlées. Cela a des implications importantes pour les applications futures de cette technique dans un plus large éventail de types d’échantillons pour surveiller les dommages à l’ADN causés par le stress oxydatif. Malgré certaines limites, les perspectives d’application de la méthode semblent prometteuses après optimisation des conditions expérimentales.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66888/66888fig01.jpg"> Figure 1 : Préparation des dilutions de H2O2. Le schéma de principe décrit la méthode de préparation des dilutions de peroxyde d’hydrogène (H2O2), impliquant la combinaison méticuleuse de solutions et le transfert précis de concentrations variées de H2O2 dans des tubes étiquetés comme 1,0 mM, 0,5 mM et 0,25 mM respectivement. La concentration visée est obtenue en transférant 1,5 mM H2O2 dans le tube désigné comme 0,75 mM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66888/66888fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66888/66888fig02.jpg"> Figure 2 : Dosage immuno-enzymatique (ELISA) pour la détection d’antigènes. Cette illustration schématique illustre les étapes séquentielles d’un test immuno-enzymatique (ELISA) pour la détection d’antigènes : Ajout d’échantillons et préparation à blanc ; incubation de l’antigène marqué HRP ; lavage et préparation des assiettes ; l’ajout et l’incubation du substrat ; la terminaison de réaction et la mesure de la densité optique (DO). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66888/66888fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66888/66888fig03.jpg"> Figure 3 : H2O2 a inhibé la prolifération cellulaire MCF-7. La viabilité cellulaire a été évaluée par un essai CCK-8 traité avec diverses concentrations de H2O2 (0, 0,25, 0,50, 0,75, 1,0, 1,5 ou 2,0 mM) pendant 12 h et une CI50 a été calculée pour l’état indiqué. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66888/66888fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66888/66888fig04.jpg"> Figure 4 : Analyse quantitative du 8-oxo-dG dans les cellules MCF-7 après traitement par H2O2. (A) Courbe standard ELISA pour le 8-oxo-dG. Décrit la relation entre les concentrations connues de 8-oxo-dG (1,25, 2,5, 5, 10, 20 et 40 ng/mL) et leurs valeurs d’absorbance respectives. L’équation de régression de la courbe standard est Y = 23,66 × X + 0,07038. (n = 3, R2 = 0,978). (B) Concentration de 8-oxo-dG dans les cellules MCF-7 traitées en H2O2. Le graphique montre les niveaux de 8-oxo-dG dans les cellules MCF-7 soumises à différentes concentrations de H2O2 (0, 0,25 et 0,75 mM). Chaque point de données représente la moyenne ± SE (erreur type) de trois expériences indépendantes (n = 3), illustrant l’impact du stress oxydatif sur les dommages à l’ADN. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66888/66888fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Paramètre</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Concentration H2O2 , mM</td>
			<td>0</td>
			<td>0.25</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.75</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>Viabilité des cellules MCF-7, %</td>
			<td>100</td>
			<td>82.8</td>
			<td>81.37</td>
			<td>61.07</td>
			<td>13.4</td>
			<td>2.77</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Viabilité cellulaire des cellules MCF-7 traitées avecH2O2.

Ce protocole décrit une méthode efficace pour détecter quantitativement les dommages oxydatifs de l’ADN dans les cellules MCF-7 par la technologie ELISA.

Quantification du niveau de 8-oxo-dG à l’aide d’un test ELISA pour évaluer les dommages oxydatifs à l’ADN dans les cellules MCF-7

8-Oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxo-dG) base is the predominant form of commonly observed DNA oxidative damage. DNA impairment profoundly ...

Cette recherche vise à mesurer quantitativement le 8-oxo-dG dans les cellules MCF-7 à l’aide de l’ELISA, en évaluant les impacts du peroxyde d’hydrogène sur les dommages oxydatifs de l’ADN. Plus précisément, les étapes ELISA sont détaillées dans cette vidéo pour plus d’efficacité. Les techniques de détection du 8-oxo-dG, y compris la chromatographie liquide à haute performance avec détection électrochimique, la spectrométrie de masse et d’autres méthodologies sophistiquées, ont démontré leur efficacité.Cependant, ces méthodes impliquent souvent de nombreuses étapes fastidieuses et peuvent être assez coûteuses. Ce protocole comble les lacunes de la recherche dans la détection efficace et sensible des dommages oxydatifs à l’ADN, en particulier le 8-oxo-dG dans les échantillons cellulaires, ce qui est crucial pour comprendre ses implications dans la maladie, le vieillissement et la réponse aux stress environnementaux. Mon laboratoire se concentre sur l’innovation méthodologique pour la détection des événements de dommages à l’ADN.Cela nous permettra de mener des recherches scientifiques approfondies en laboratoire sur les marqueurs de dommages à l’ADN.

quantifying-level-8-oxo-dg-using-elisa-assay-to-evaluate-oxidative

Research

Recherche

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimie

Le but de ce protocole est la détection du marqueur de l'oxydation de l'ADN, 8-oxo-7,8-dihydro-2'-désoxyguanosine (8-oxo-dGuo) par CLHP-DE, en ADN à partir de cellules en culture ou des tissus animaux.

HPLC: Mesure de l&#39;oxydation des biomarqueurs ADN, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-désoxyguanosine, dans des cellules cultivées et des tissus animaux

Ce manuscrit décrit l’utilisation de reporters fluorogène génétiquement encodé dans une application de l’imagerie de cellules vivantes pour l’examen du stress oxydatif induit par les xénobiotiques. Cette approche expérimentale offre inégalée de résolution spatio-temporelle, sensibilité et spécificité tout en évitant beaucoup des défauts des méthodes conventionnelles utilisées pour la détection du stress oxydatif toxicologique.

Imagerie des approches pour les évaluations toxicologiques stress oxydatif, à l’aide de capteurs codés génétiquement fluorogène

Nous décrivons ici les méthodes de quantification sensible et précise des lésions 8-oxo-7,8-dihydro-2 '-désoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,n6-étheno-2 '-désoxyadénosine (1,n6-Dado) et 1,n2- étheno-2 '-désoxyguanosine (1,N-2dguo) dans l’ADN. Les méthodes ont été appliquées à l’évaluation des effets des particules fines ambiantes (PM2,5) dans les tissus (poumons, foie et rein) des souris A/J exposées.

Quantification de trois lésions de l’ADN par spectrométrie de masse et évaluation de leurs niveaux dans les tissus de souris exposés à des particules fines ambiantes

Ici, nous présentons un protocole pour détecter l’espèce totale d’oxygène réactif cellulaire (ROS) à l’aide de 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacétate (DCFH-DA). Cette méthode permet de visualiser la localisation cellulaire de ROS dans les cellules adhérentes avec un microscope à fluorescence et de quantifier l’intensité de ROS avec un lecteur de plaque de fluorescence. Ce protocole est simple, efficace et rentable.

Détection des espèces réactives totales d’oxygène dans les cellules adhérentes par 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacétate Staining

Nous proposons ici un protocole systématisé, accessible et reproductible pour détecter les espèces réactives cellulaires de l’oxygène (ROS) à l’aide d’une sonde de diacétate de 2′,7′-dichlorofluorescéine (DCFH-DA) dans les cellules gliales de Müller (MGC). Cette méthode quantifie les niveaux de ROS cellulaires totaux à l’aide d’un cytomètre en flux. Ce protocole est très facile à utiliser, adapté et reproductible.

Quantification des espèces réactives de l’oxygène à l’aide de la sonde de diacétate de dichlorofluorescéine 2′,7′-dichlorofluorescéine et de la cytométrie en flux dans les cellules gliales de Müller

Ici, nous présentons une compilation de tests pour mesurer directement la fonction mitochondriale dans les cellules de mammifères indépendamment de leur capacité à consommer de l’oxygène moléculaire.

Tests indépendants de l’oxygène pour mesurer la fonction mitochondriale chez les mammifères

Ici, il est démontré comment le dosage in situ de ligature de proximité (PLA) peut être utilisé pour détecter et visualiser les interactions directes protéines-protéines entre ATM et p53 dans des cultures de cellules en suspension exposées au stress génotoxique.

Détection et visualisation des complexes protéiques induits par endommagement de l&#39;ADN dans des cultures cellulaires en suspension utilisant l&#39;essai de ligature de proximité

Ce protocole décrit la caractérisation de la synthèse de l’ADN polymérase d’ADN modifié grâce à l’observation des changements à l’ADN fluorescent étiqueté proche infrarouge à l’aide de l’électrophorèse sur gel et gel de l’imagerie. Gels d’acrylamide sont utilisés pour l’imagerie haute résolution de la séparation des acides nucléiques courts, qui migrent à des vitesses différentes selon la taille.

Analyse d’activité de l’ADN polymérase utilisant l’ADN marqué Fluorescent proche infrarouge visualisée par électrophorèse sur Gel d’Acrylamide

Un protocole détaillé pour effectuer un titrage ELISA est décrite. En outre, un nouvel algorithme est présenté afin d’évaluer le titrage des tests ELISA et d’obtenir une constante de dissociation de liaison d’un ligand soluble à un récepteur immobilisée plaque de microtitration.

Titrage ELISA comme une méthode pour déterminer la constante de Dissociation de l’Interaction Ligand du récepteur

Une méthode non marqué, non-radio-isotopiques pour la relecture de l’ADN polymérase et un test de réparation de l’ADN a été développée à l’aide de haute résolution spectrométrie de masse MALDI-TOF et une stratégie d’extension de nucléotide. Le test s’est avéré être très précis, simple, rapide et facile à réaliser pour la relecture et réparer les correctifs inférieure à 9-nucléotides.

Correction d’épreuves et de test de réparation d’ADN en utilisant l’analyse de spectrométrie de masse MALDI-TOF et de nucléotide simple Extension

Apprenez à quantifier les dommages oxydatifs de l'ADN par ELISA dans les cellules MCF-7. Cette méthode efficace mesure le 8-oxo-dG pour évaluer l'impact du peroxyde d'hydrogène sur l'ADN.

Quantification du niveau de 8-oxo-dG à l’aide d’un test ELISA pour évaluer les dommages oxydatifs à l’ADN dans les cellules MCF-7 (Vidéo) | JoVE Journal

Quantification du niveau de 8-oxo-dG à l’aide d’un test ELISA pour évaluer les dommages oxydatifs à l’ADN dans les cellules MCF-7

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