Name: Imagerie calcique in vivo de cellules granulaires dans le gyrus denté de l’hippocampe chez la souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Découvrez l'imagerie calcique in vivo des cellules granulaires du gyrus denté chez la souris en mouvement libre. Cette méthode combine injection virale et implantation de lentille GRIN pour étudier les activités neuronales liées aux fonctions cognitives.

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Ce travail est soutenu par le Programme pilote de Shanghai pour la recherche fondamentale - Université Fudan 21TQ1400100 (22TQ019), le projet majeur de science et de technologie de la municipalité de Shanghai, le laboratoire Lingang (subvention no. LG-QS-202203-09) et la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (32371036).

Imagerie en temps réel de l’activité neuronale dans les cellules de gyrus dentées de souris 

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<li>Hsiao, Y. -T., Wang, A. Y. -C., Lee, T. -Y., Chang, C. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+baseplating+and+a+miniscope+preanchored+with+an+objective+lens+for+calcium+transient+research+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Using baseplating and a miniscope preanchored with an objective lens for calcium transient research in mice.</a> J Vis Exp. (172), e62611(2021).</li>
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</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Ici, nous avons décrit une procédure d’imagerie calcique in vivo chez la DG de souris. Nous pensons que ce protocole sera utile pour les chercheurs qui souhaitent étudier les fonctions des DG dans divers processus cognitifs, en particulier dans les cas où une sous-population génétiquement identifiée présente un intérêt. Nous expliquons ici les avantages de notre protocole, en mettant l’accent sur certains points clés de la chirurgie, et discutons des limites de cette méthode.
Nous avons testé diverses procédures d’imagerie DG à partir de la littérature disponible et optimisé les procédures expérimentales comme détaillé dans ce protocole. À notre avis, les trois modifications clés suivantes ont grandement amélioré le taux de réussite de notre protocole. Tout d’abord, nous avons combiné toutes les procédures chirurgicales en une seule séance, tandis que de nombreuses études d’imagerie calcique pour les régions sous-corticales ont effectué l’injection du virus et l’implantation de lentilles dans deux chirurgies distinctes. L’un des principaux avantages de notre approche est que l’expression du virus et la récupération des tissus cérébraux se produisent maintenant au cours de la même période, ce qui réduit de moitié le temps d’attente pour la préparation des souris, qui prend généralementdes mois 21. De plus, des chirurgies distinctes nécessitent un repositionnement précis de la souris, car de légères inclinaisons avec un décalage de l’ordre de 100 μm entraîneront l’échec de la procédure. Pour éviter de placer la lentille, certains groupes ont développé une approche qui fixe le miniscope à la lentille et ont essayé de visualiser l’expression neuronale du capteur pendant la chirurgie d’implantation. Cette solution de contournement nécessite une ingénierie non triviale de l’appareil stéréotaxique couramment utilisé et est complexe à utiliser en raison de la suppression des activités neuronales pendant l’anesthésie. Notre méthode ne nécessite pas de repositionnement de la souris, ce qui réduit considérablement le temps et le stress associés à la procédure.
Le deuxième point clé de notre approche est que nous injectons à plusieurs reprises de petites quantités du virus dans la zone cible22. Cela conduit à l’infection d’un plus grand nombre de cellules. Il est important de noter que, par rapport à l’augmentation de la charge virale dans un seul site d’injection, cette approche a donné des résultats supérieurs en ce sens que les emplacements des cellules infectées se répartissent uniformément dans le champ de vision. Un autre point clé connexe est que la dilution du titre du virus améliore la qualité de l’imagerie calcique. D’après notre expérience, une quantité excessive de virus est associée à l’apparition de grappes d’activités ondulatoires, ce qui est cohérent avec un rapport précédent23. Bien que nous ayons initialement soupçonné que l’aspiration tissulaire pouvait conduire à une élimination prématurée du virus dans le site d’injection et à une expression insuffisante, nous n’avons pas observé un tel phénomène, et notre protocole a généralement donné lieu à une infection robuste de la région cible. Par rapport aux souris transgéniques exprimant GCaMP, l’approche virale est inévitablement moins cohérente mais offre une utilisation plus souple car elle ne nécessite pas d’élevage compliqué. Cependant, comme l’expression du GCaMP peut se propager dans les structures cérébrales adjacentes ou devenir inégalement répartie dans la région cérébrale cible, un examen minutieux des positions anatomiques du virus et du cristallin à partir du tissu fixé est essentiel pour l’interprétation des résultats. La combinaison de lignées Cre spécifiques à une région ou à un type de cellule avec l’expression de GCaMP dépendante de Cre pourrait améliorer la spécificité des signaux imagés.
Le troisième point clé de notre protocole est que lors de l’implantation de la lentille, nous avons répété l’insertion et le rinçage de la lentille plusieurs fois pour nous assurer qu’il n’y avait pas de reste de sang dans la zone d’implantation. Il s’agit d’une opération clé pour faciliter la récupération des tissus et améliorer le taux de réussite de la procédure. Bien que le mécanisme exact ne soit pas connu, nous supposons que l’insertion de la lentille causera inévitablement des dommages aux tissus, et que l’étape de rinçage éliminerait le saignement associé à ces dommages. Sinon, le saignement associé à l’insertion peut prendre beaucoup de temps pour que le cerveau se dégage, ce qui augmente la probabilité d’inflammation locale et d’infiltration de macrophages, ce qui réduirait la qualité optique. De plus, aux coordonnées que nous avons fournies dans ce protocole, nous avons constaté que le fait de placer le cristallin un peu plus près de la suture sagittale entraîne généralement une augmentation du nombre de cellules visibles, bien qu’il soit important d’éviter de percer le troisième ventricule. Nous avons également fourni une liste de problèmes courants pour un meilleur dépannage de cette étape (Tableau 1).
La souris doit être entraînée à porter le miniscope factice avant les expériences comportementales afin de minimiser l’impact du poids supplémentaire sur la tête. En règle générale, cette formation se déroule sur ~3 jours, chaque session durant 20 min. Au cours des expériences comportementales, la condition physique de la souris doit être surveillée régulièrement. Les performances comportementales de la souris seront grandement influencées par sa santé.
Ce protocole comporte plusieurs limitations. Tout d’abord, il convient de noter que l’imagerie calcique est un substitut de l’activité neuronale, qui peut être influencée par l’expression des capteurs. Les méthodes d’imagerie à un photon utilisant un miniscope peuvent conduire à un chevauchement des signaux provenant de cellules voisines, ce qui nécessite un démixage de l’analyse ultérieure. De plus, notre protocole implique des chirurgies invasives. Une partie du tissu cérébral est prélevée lors de l’étape d’implantation du cristallin GRIN, comprenant généralement une partie de la région CA1, du cortex rétrosplénal et du cortex visuel associatif. Ceci est nécessaire en raison de la limitation de la profondeur d’imagerie offerte par l’éclairage à un photon. Dans nos observations, nous n’avons pas remarqué de déficits comportementaux apparents chez les souris suite à l’intervention chirurgicale, ni dans leurs comportements généraux et sans restriction, ni dans l’apprentissage des tâches de piste linéaire (Figure supplémentaire S1). Alternativement, l’utilisation d’instruments chirurgicaux automatisés pour l’aspiration des tissus cérébraux peut réduire les erreurs associées à l’utilisation manuelle, améliorant ainsi la précision de l’intervention chirurgicale24. De plus, nos données d’imagerie calcique ont généralement donné une dynamique calcique normale. L’effet sur des fonctions cognitives plus complexes doit être davantage caractérisé. Une méthode alternative pour l’insertion du cristallin sans aspiration tissulaire a été décrite avant25. Ceci est réalisé en faisant une coupe dans le tissu cérébral le long du chemin d’insertion prévu et en plaçant la lentille directement à travers l’ouverture. D’après notre expérience, cette approche conduit à des plis ou à d’autres déformations du tissu cérébral le long du tractus d’insertion, ce qui peut encore être invasif. La grande variabilité de la déformation rend cette approche moins fiable que le protocole que nous avons décrit. Une autre mise en garde potentielle de notre protocole est que les performances comportementales de la souris sont légèrement affectées par le câble coaxial qui relie le miniscope et le boîtier d’acquisition de données (DAQ) du miniscope. Cela n’est pas seulement dû au fait que les fils s’enroulent ensemble après de nombreux tours, mais aussi parce que le fil peut être un distracteur pour la souris pendant la tâche. L’utilisation d’un miniscope sans fil26 résoudrait efficacement ce problème. 
Malgré les limites existantes, nous pensons que cette méthodologie peut être très bénéfique pour les chercheurs intéressés à utiliser l’imagerie calcique in vivo pour étudier les modèles d’activité neuronale dans le gyrus denté de l’hippocampe. Par exemple, cette approche d’imagerie calcique in vivo peut être appliquée pour étudier les cellules de lieu spécifiquement dans la région du gyrus denté. Cela permettrait d’explorer comment les cellules de lieu codent l’information dans différentes zones du cerveau10,27. Notre validation indique que ce protocole est raisonnablement reproductible, avec des taux de réussite élevés, et peut être appliqué à différentes régions du cerveau.

Des études antérieures ont montré que l’hippocampe est une structure cérébrale essentielle au traitement et à la récupération dessouvenirs1,2. Depuis les années 1950, les circuits neuronaux de l’hippocampe chez les rongeurs ont été au centre de l’étude de la formation, du stockage et de la récupération de la mémoire3. Les structures anatomiques de l’hippocampe comprennent les sous-régions du gyrus denté (DG), CA1, CA2, CA3, CA4 et du subiculum4. Des connexions bidirectionnelles complexes existent entre ces sous-régions, dont la DG, CA1 et CA3 forment un circuit trisynaptique proéminent composé de cellules granulaires et de cellules pyramidales5. Ce circuit reçoit son entrée primaire du cortex entorhinal (CE) et a été un modèle classique pour l’étude de la plasticité synaptique. Les recherches in vivo antérieures sur la fonction de l’hippocampe se sont principalement concentrées sur le CA1 6,7 en raison de son accès plus facile. Alors que les neurones CA1 jouent un rôle important dans la formation, la consolidation et la récupération de la mémoire, en particulier dans les cellules de place pour la mémoire spatiale, d’autres sous-régions de l’hippocampe sont également vitales 8,9. En particulier, des études récentes ont mis en évidence les fonctions de la DG dans la formation de la mémoire. Les cellules de lieu dans la MD sont plus stables que celles de CA110, et leurs activités reflètent des informations spécifiques au contexte11. De plus, le marquage dépendant de l’activité des cellules granulaires DG peut être réactivé pour induire des comportements liés à la mémoire12. Par conséquent, pour mieux comprendre le codage de l’information dans la DG, il est crucial d’étudier les activités de la sous-région de la MD pendant que l’animal effectue des tâches dépendantes de la mémoire.
Les études antérieures sur les activités des DG ont principalement utilisé l’électrophysiologie in vivo 13. Cependant, cette technique présente quelques inconvénients : tout d’abord, dans les enregistrements électriques, il peut être difficile d’identifier directement les différents types de cellules qui génèrent le signal. Les signaux enregistrés proviennent à la fois de cellules inhibitrices et de cellules excitatrices. Par conséquent, d’autres méthodes de traitement des données sont nécessaires pour séparer ces deux types de cellules. De plus, il est difficile de combiner d’autres informations sur le type de cellule, telles que des sous-groupes spécifiques à la projection ou un étiquetage dépendant de l’activité, avec des enregistrements électriques. De plus, en raison de la morphologie anatomique de la DG, les électrodes d’enregistrement sont souvent implantées dans une direction orthogonale, ce qui limite considérablement le nombre de neurones pouvant être enregistrés. Ainsi, il est difficile pour les enregistrements électriques de surveiller des centaines de neurones individuels de la structure DG chez le même animal14.
Une technique complémentaire d’enregistrement des activités neuronales dans la DG consiste à utiliser l’imagerie calcique in vivo 15. Les ions calcium sont fondamentaux dans les processus de signalisation cellulaire des organismes, jouant un rôle crucial dans de nombreuses fonctions physiologiques, en particulier dans le système nerveux des mammifères. Lorsque les neurones sont actifs, la concentration intracellulaire de calcium augmente rapidement, ce qui reflète la nature dynamique de l’activité neuronale et de la transmission du signal. Par conséquent, l’enregistrement en temps réel des changements dans les niveaux de calcium intracellulaire dans les neurones fournit des informations importantes sur les mécanismes de codage neuronaux.
La technologie d’imagerie calcique utilise des colorants fluorescents spécialisés ou des indicateurs calciques génétiquement modifiés (GECI) pour surveiller les concentrations d’ions calcium dans les neurones en détectant les changements d’intensité de fluorescence, qui peuvent ensuite être capturés par imagerie microscopique16. Généralement, la famille GCaMP de gènes indicateurs de calcium, comprenant la protéine fluorescente verte (GFP), la calmoduline et les séquences polypeptidiques M13, est utilisée. GCaMP peut émettre une fluorescence verte lorsqu’il se lie aux ions calcium17, ce qui permet d’enregistrer les fluctuations de la fluorescence verte par imagerie18. De plus, pour obtenir des images claires de la région cérébrale cible, une lentille à gradient d’indice (lentille GRIN) est généralement implantée au-dessus de la région d’intérêt. La lentille GRIN permet d’imager la région profonde du cerveau qui n’est pas accessible directement depuis la surface.
Cette technique est relativement facile à combiner avec d’autres outils génétiques pour marquer différents types de cellules. De plus, comme le plan d’imagerie est parallèle à l’orientation des cellules dans la DG, des centaines de neurones sont accessibles pour l’imagerie à chaque intervention chirurgicale réussie. Dans ce travail, nous présentons un protocole chirurgical complet et détaillé pour l’imagerie calcique in vivo dans le gyrus denté chez la souris (Figure 1). La procédure comporte deux opérations principales. La première consiste à injecter le virus AAV-CaMKIIα-GCaMP6f dans la DG. La deuxième opération consiste à implanter une lentille GRIN au-dessus du site d’injection du virus. Ces deux procédures se déroulent au cours de la même séance. Après la récupération de ces chirurgies, l’étape suivante consiste à vérifier la qualité de l’imagerie avec des microscopes miniaturisés (miniscopes). Si le champ d’imagerie comporte des centaines de cellules actives, la procédure ultérieure consiste à fixer la plaque de base du miniscope sur le crâne de la souris à l’aide de ciment dentaire ; La souris peut ensuite être utilisée pour des expériences d’imagerie. Nous présentons également un pipeline de prétraitement basé sur MATLAB pour rationaliser l’analyse des données de calcium collectées.

<table><tbody><tr><td>200 &mu ; L pointes de pipette universelles</td><td>Transcat Pipettes</td><td>1030-260-000-9</td><td>Pour enlever le sang et la solution saline</td></tr><tr><td>Aiguille émoussée luer lock 25 G (pointes de distribution précourbées)</td><td>iSmile</td><td>20-0105</td><td>Pour enlever le tissu cérébral</td></tr><tr><td>Capuchon de protection imprimé</td> en <td>3D N/A</td> N<td>/A</td><td>Pour protéger la lentille GRIN</td></tr><tr><td>75 % éthanol</td><td>Shanghai Hushi Laboratory Equipment Co.,Ltd</td><td>bwsj-230219105303</td><td>Pour la désinfection et le nettoyage de la surface de la lentille GRIN</td></tr><tr><td>AAV2/9-CaMKII&alpha ;-GCaMP6f</td><td>virus Brain Case</td><td>BC-0083</td><td>Pour l’injection virale</td></tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td>Adobe</td><td>cc 2018 version 22.1</td><td>Pour dessiner des figures</td></tr><tr><td>Pompe à air d’anesthésie</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>R510-30</td><td>Pour l’anesthésie</td></tr><tr><td>Logiciel de contrôle de la caméra</td><td>Daheng Imaging</td><td>Galaxy Windows SDK_CN (V2)</td><td>Pour l’enregistrement des données comportementales</td></tr><tr><td>Canules / Supports de viroles en céramique (support de lentille GRIN)</td><td>RWD Life Science Co.,Ltd</td><td>68214</td><td>Pour tenir la lentille GRIN</td></tr><tr><td>Carprofène</td><td>MedChemExpress</td><td>53716-49-7</td><td>Pour réduire la douleur postopératoire de la souris&nbsp ;</td></tr><tr><td>Câble coaxial</td><td>Open ephys</td><td>CW8251</td><td>Pour connecter le miniscope et le boîtier d’acquisition de données miniscope</td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Olympus Life Science&nbsp ;</td><td>FV3000</td><td>Pour l’observation des tranches de cerveau</td></tr><tr><td>Coton-tige</td><td>Nanchang Xiangyi Medical Devices Co., Ltd</td><td>20202140438</td><td>Pour la désinfection</td></tr><tr><td>Plaque de tête personnalisée</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Pour tenir la souris sur la roue de course</td></tr><tr><td>Support de plaque de tête personnalisé</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Pour tenir la plaque de tête de la souris</td></tr> Base <tr><td>de prothèse dentaire matierlals (auto-polymérisante)</td><td>New Centry Dental</td><td>430205</td><td>Pour fixer le miniscope</td></tr><tr><td>Crème dépilatoire</td><td>Veet</td><td>ASIN : B001DUUPQ0</td><td>Pour enlever les poils de la souris</td></tr><tr><td>Stéréotaxique numérique de bureau en sttrument, SGL M</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>68803</td><td>Pour l’injection virale et l’implantation de la lentille GRIN</td></tr><tr><td>Dexaméthasone</td><td>Huachu Co., Ltd.</td><td>N/A</td><td>Pour prévenir l’inflammation postopératoire de la souris</td></tr><tr><td>Microscope de dissection</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>MZ62-WX</td><td>Pour l’observation des conditions pendant les chirurgies</td></tr><tr><td>Cartouche de filtre à gaz, grande, paquet de 6</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>R510-31-6</td><td>Pour l’anesthésie</td></tr><tr><td>Lentille GRIN</td><td>GoFoton</td><td>CLHS100GFT003</td><td>Pour l’implantation de lentille GRIN</td></tr><tr><td>Lentille</td> <td>GRINInFocus Grin Corp</td><td>SIH-100-043-550-0D0-NC</td><td>Pour l’implantation de la lentille GRIN</td></tr><tr><td>Chambre d’induction souris (15 cm x 10 cm x 10 cm)</td><td>RWD Life Science Co.,Ltd</td><td>V100</td><td>Pour l’anesthésie</td></tr><tr><td>Caméra industrielle</td><td>Daheng Imaging</td><td>MER-231-41U3M-L, VS-0618H1</td><td>Pour l’acquisition des données comportementales</td></tr><tr>Désinfectant à<td>l’iodophor</td><td>Qingdao Hainuo Innovi Disinfection Technology Co.,Ltd</td><td>8861F6DFC92A</td><td>Pour la désinfection</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>RWD Life Science Co.,Ltd</td><td>R510-22-10</td><td>Pour l’anesthésie</td></tr><tr><td>Tube de prélèvement d’échantillons liquides (micropipette de capillaires en verre pour Nanoject III)</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-203-G/X</td><td>Pour l’injection virale</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>R2021b</td><td>Pour l’analyse des données</td></tr><tr><td>Microdrill</td><td>RWD Life Science Co.,Ltd</td><td>78001</td><td>Pour la craniotomie</td></tr><tr><td>Extracteur de micropipettes</td><td>Narishige International USA</td><td>PC-100</td><td>Pour tirer le tube de prélèvement d’échantillons liquides</td></tr><tr><td>Huile minérale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td>Pour l’injection virale</td></tr><tr><td>Miniscope DAQ</td><td>Software Github (Aharoni-Lab/Miniscope-DAQ-QT-Software)</td><td>N/A</td><td>Pour l’enregistrement des données d’imagerie calcique</td></tr><tr><td>Miniscope Data Acquisition Box (DAQ) (V3.3)</td><td>Ouvrir ephys</td><td>V3.3</td><td>Pour acquérir les données d’imagerie calcique</td></tr><tr><td>Miniscope V4</td><td>Open ephys</td><td>V4</td><td>Pour l’imagerie calcique in vivo</td></tr><tr><td>Miniscope V4 plaque de base (Variante 2)</td><td>Open ephys</td><td>Variante 2</td><td>Pour tenir le miniscope</td></tr><tr><td>nanoject III Injecteur de nanolitres programmable</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-207</td><td>Pour l’injection virale</td></tr><tr><td>Pommade ophtalmique</td><td>Cisen Pharmaceutical Co., Ltée.</td><td>H37022025</td><td>Pour garder les yeux humides</td></tr><tr><td>Tube PCR</td><td>LabServ</td><td>309101009</td><td>Pour diluer le virus</td></tr><tr><td>Ordinateur personnel (ThinkPad)</td><td>Lenovo</td><td>20W0-005UCD</td><td>Pour enregistrer les données d’imagerie calcique et les données comportementales</td></tr><tr><td>Roue de course</td><td>Shanghai Edai Pet Products Co., Ltd</td><td>NA-H115</td><td>Pour tenir la souris lors de la fixation de la plaque de base</td></tr><tr><td>Tournevis (vis M1.6)</td><td>Greenery (Yantai Greenery Tools Co.,Ltd)</td><td>60902</td><td>Pour dévisser les vis M1.6</td></tr><tr><td>Tournevis (vis de réglage)</td><td>Greenery (Yantai Greenery Tools Co.,Ltd)</td><td>S2</td><td>Pour dévisser les vis de réglage</td></tr><tr><td>Vis de réglage</td><td>TBD</td><td>2-56 Vis de réglage à pointe conique</td><td>Pour fixer le miniscope à sa plaque de base Appareil d’anesthésie</td></tr><tr><td>pour petits animaux</td><td>RWD Life Science Co.,Ltd</td><td>R500</td><td>Pour l’anesthésie</td></tr><tr><td>Seringue stérile</td><td>Jiangsu Great Wall Medical Equipment Co., LTD</td><td>20163140236</td><td>Pour rincer le sang</td></tr><tr><td>Ciseaux chirurgicaux</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>S14016-13</td><td>Pour couper les cheveux et le cuir chevelu</td></tr><tr><td>ThermoStar Contrôleur de température, 69025 tampon incl.</td><td>RWD Life Science Co.,Ltd</td><td>69027</td><td>Pour maintenir la température corporelle de l’animal</td></tr><tr><td>Pince ultra fine</td><td>RWD Life Science Co.,Ltd</td><td>F11020-11</td><td>Pour enlever les débris osseux et le</td></tr><tr><td>câble USB 3.0</td><td>Dura Open ephys</td><td>N/A</td><td>Pour connecter le boîtier DAQ miniscope et la lumière UV de l’ordinateur</td></tr><tr><td></td><td>Jinshida</td><td>66105854002</td><td>Pour fixer la lentille GRIN sur le crâne</td></tr><tr><td>Résine UV (adhésif photopolymérisable)</td><td>Loctite</td><td>32268</td><td>Pour fixer la lentille GRIN sur le crâne</td></tr><tr><td>Pompe à vide</td><td>Kylin-Bell</td><td>GL-802B</td><td>Pour enlever le sang, la solution saline et le tissu cérébral</td></tr></tbody></table>

imagerie calcique in vivo de cellules granulaires dans le gyrus denté de l’hippocampe chez la souris 

In Vivo Calcium Imaging of Granule Cells in the Dentate Gyrus of Hippocampus in Mice

Des approches en temps réel sont généralement nécessaires dans les études de l’apprentissage et de la mémoire, et l’imagerie calcique in vivo offre la possibilité d’étudier l’activité neuronale chez les animaux éveillés pendant les tâches comportementales. Étant donné que l’hippocampe est étroitement associé à la mémoire épisodique et spatiale, il est devenu une région essentielle du cerveau dans la recherche de ce domaine. Dans des recherches récentes, les cellules d’engramme et les cellules de lieu ont été étudiées en enregistrant les activités neuronales dans la région CA1 de l’hippocampe à l’aide du microscope miniature chez la souris tout en effectuant des tâches comportementales comprenant un champ ouvert et une piste linéaire. Bien que le gyrus denté soit une autre région importante de l’hippocampe, il a rarement été étudié avec l’imagerie in vivo en raison de sa plus grande profondeur et de sa difficulté d’imagerie. Dans ce protocole, nous présentons en détail un processus d’imagerie calcique, y compris comment injecter le virus, implanter une lentille GRIN (Gradient-index) et fixer une plaque de base pour l’imagerie du gyrus denté de l’hippocampe. Nous décrivons plus en détail comment prétraiter les données d’imagerie calcique à l’aide de MATLAB. De plus, des études sur d’autres régions cérébrales profondes qui nécessitent une imagerie peuvent bénéficier de cette méthode.

La figure 1 montre le schéma de la procédure expérimentale, y compris l’injection du virus, l’implantation d’une lentille GRIN, l’affixation de la plaque de base, l’imagerie calcique in vivo via un miniscope et le traitement des données. Généralement, l’ensemble de la procédure prend 1 mois. La figure 2 montre des exemples de procédures d’injection du virus, y compris le positionnement du trou percé sur le crâne et l’état du tissu cérébral avant l’implantation du cristallin GRIN.
La figure 3 montre le processus d’ablation du tissu cérébral, ce qui est crucial pour le succès de cette chirurgie. Au fur et à mesure que plus de tissu est aspiré, différentes couches de tissu deviennent visibles. Cette étape d’aspiration peut être arrêtée une fois qu’une couche grise et réfléchissante est observée.
La figure 4 montre la procédure d’implantation de GRIN, y compris l’insertion de la lentille GRIN, l’adhérence de la plaque frontale sur le crâne et le recouvrement de la lentille GRIN avec un capuchon personnalisé. La qualité de l’imagerie calcique in vivo dépend du succès de l’injection du virus et de l’implantation du cristallin GRIN.
La figure 5 montre quatre types de résultatsd’imagerie calcique in vivo.La figure 5A est le résultat infructueux ; Aucune cellule active n’a été observée dans le champ de vision de l’imagerie. Les figures 5B et D sont des résultats positifs. La figure 5B a moins de 10 cellules actives, mais il n’y a pas de vaisseaux sanguins évidents. La figure 5C a plus de 50 cellules actives et des vaisseaux sanguins visibles. Dans la figure 5D, il y a des centaines de cellules actives dans le champ de vision de l’imagerie ; En même temps, nous avons observé des vaisseaux sanguins clairs. L’imagerie calcique in vivo de haute qualité comporte généralement des centaines de cellules activées. Moins d’une douzaine de cellules activées sont considérées comme sous-optimales pour les résultats d’imagerie. Habituellement, le nombre de cellules est en corrélation avec le diamètre du cristallin GRIN ainsi qu’avec la partie de la région du cerveau. Un diamètre de lentille GRIN plus grand et une région cérébrale plus proche de la face dorsale augmenteront la probabilité d’observer plus de cellules actives. Il est également essentiel de noter que plus le diamètre de la lentille GRIN est grand, plus elle cause de dommages au cerveau de la souris ; Il est donc crucial de choisir la taille appropriée. L’implantation d’une lentille GRIN de 1 mm de diamètre n’affecte pas la capacité de l’animal à acquérir le comportement de la piste linéaire (Figure supplémentaire S1).
Les données comportementales et les données d’imagerie calcique sont généralement traitées séparément. Les données comportementales de la souris peuvent être étiquetées manuellement ou traitées à l’aide d’un logiciel d’analyse open source. Les données d’imagerie calcique sont traitées à l’aide de la correction de mouvement non rigide (NoRMCorre) et d’EXTRACT dans MATLAB. La figure 6 montre les cellules individuelles extraites superposées au champ de vision et montre cinq traces de calcium représentatives d’un enregistrement réussi d’imagerie calcique in vivo . Voir la vidéo supplémentaire S1 pour une vidéo représentative des données brutes.
La dernière étape, la vérification de l’implantation de la lentille GRIN et de l’injection virale ont lieu dans la région cérébrale prévue est également très importante pour l’interprétation des données. La figure 7 est une coupe de cerveau de souris montrant la position de l’expression de GCaMP6f (la région de fluorescence verte) et la trace de la lentille GRIN.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig01.jpg"> Figure 1 : Schéma des procédures d’injection du virus et d’implantation du cristallin GRIN. (A) Injecter le virus AAV-CaMKIIα-GCaMP6f dans le gyrus denté. (B) Implantez la lentille GRIN au-dessus du gyrus denté. (C) Vérifiez la qualité de l’imagerie après l’opération. (D) Fixez la plaque de base du miniscope après vérification. (E) Le calendrier et le processus de l’ensemble du protocole. Abréviation : GRIN = Gradient index. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig02.jpg"> Figure 2 : Vue chirurgicale représentative lors de l’injection du virus. (A) Placez la souris sur l’appareil stéréotaxique. (B) Marquez la zone d’implantation du cristallin GRIN (la région noire). (C) Craniotomie sur la zone cible. (D) Injecter 240 nL de virus dans le gyrus denté. (E) Retirer la micropipette après l’injection. (F) Retirer le cortex et une partie du tissu cérébral CA1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig03.jpg"> Figure 3 : Vue chirurgicale représentative lors de l’aspiration du tissu cérébral. (A) La région délimitée par le marqueur noir est polie à l’aide d’une micro-perceuse, laissant derrière (B) du tissu cortical partiellement exposé. La partie gauche montre un cortex exposé et la partie droite est recouverte de tissu dura et crânien. (C) Image représentative lors de l’aspiration du tissu cérébral cortical. Le tissu reste rose pâle. (D) La substance blanche est visible dans le champ de vision, comme l’indique la flèche blanche. (E) Une aspiration supplémentaire a révélé une surface réfléchissante gris-rouge foncé sous la substance blanche. On pense que la région (flèche noire) est la surface CA1 et que l’aspiration ne doit pas aller plus profondément. (F) Il n’y a plus de saignement visible dans la région après plusieurs rinçages avec une solution saline. Dans tous les panneaux, les astérisques indiquent les outils chirurgicaux : une aiguille émoussée de 30 G pour le sérum physiologique et une aiguille émoussée de 25 G pour l’aspiration du tissu cérébral. Barres d’échelle = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig04.jpg"> Figure 4 : Exemple de procédure pour l’implantation de la lentille GRIN et la fixation de la plaque de base. (A) Implantez la lentille GRIN dans le tissu cérébral à l’aide d’un porte-lentille GRIN. (B) Collez la lentille GRIN au bon endroit avec de la résine UV ; la partie réfléchissante représente la résine UV. (C) Fixez la plaque frontale sur le crâne de la souris à l’aide de résine UV. (D) Couvrez la lentille GRIN avec un capuchon de protection imprimé en 3D. (E) Vérifier la qualité de la chirurgie. Le miniscope était fixé par un support. (F) Appliquez les matériaux de base de la prothèse autour de la plaque de base. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig05.jpg"> Figure 5 : Résultats d’imagerie réussis et infructueux. (A) Résultat infructueux d’imagerie calcique in vivo. Il n’y a pas de cellules actives chez A et plusieurs régions ont des taches de sang foncées, comme l’indiquent les flèches noires. (B-D) Résultats réussis de l’imagerie calcique in vivo. (B) Moins de 10 cellules actives peuvent être observées, mais aucun vaisseau sanguin significatif dans le champ d’imagerie. (C) Plus de 50 cellules actives et des vaisseaux sanguins importants peuvent être observés. (D) Des centaines de cellules actives et de vaisseaux sanguins plus importants peuvent être observés. Les cercles pointillés représentent le champ de vision de l’imagerie. Les flèches vertes représentent les cellules exprimant GCaMP6f. Les flèches rouges représentent les vaisseaux sanguins. Barres d’échelle = 250 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig06.jpg"> Figure 6 : Données représentatives d’imagerie calcique in vivo d’une souris courant sur la piste linéaire. (A) L’enregistrement du champ de vision d’imagerie par le miniscope, nombre total de cellules = 227. (B) Traces de calcium représentatives. Les emplacements de la cellule sont indiqués dans la même couleur en A. (C) Tâche comportementale : Piste linéaire avec des récompenses d’eau aux deux extrémités. (D) Résultat représentatif de l’analyse comportementale de l’activité de la souris ; Temps total = 100 s. Les lignes verticales bleues indiquent les points temporels du comportement de léchage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig07.jpg"> Figure 7 : Coupes de tissus cérébraux de souris après une intervention chirurgicale. (A,B) Deux exemples de tissus cérébraux de souris. Les zones rectangulaires en pointillés indiquent le chemin d’implantation de la lentille GRIN. Les lignes courbes représentent le gyrus denté de l’hippocampe. Barres d’échelle = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig07large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Problème</td>
			<td>Cause possible</td>
			<td>Solution</td>
		</tr><tr><td>Le champ d’image apparaît sombre ou noir.</td>
			<td>Il y a une quantité importante de sang résiduel sur la face inférieure du cristallin GRIN.</td>
			<td>Avant l’implantation de la lentille GRIN, la solution saline est utilisée pour rincer en continu la surface du site chirurgical jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de saignement observable.</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">Il y a des vaisseaux sanguins clairement visibles dans le champ d’imagerie, mais aucune activité neuronale discernable.</td>
			<td>1. L’expression du virus était sous-optimale ou faible.</td>
			<td>1. Il serait conseillé de vérifier les points suivants :</td>
		</tr><tr><td>2. L’emplacement de l’expression virale observée ne correspond pas à la position où le cristallin GRIN a été implanté (généralement, la position d’implantation du cristallin GRIN est trop peu profonde par rapport à l’emplacement souhaité).</td>
			<td>un. Assurez-vous que les conditions de stockage des virus sont appropriées.</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>b. Vérifiez que l’emplacement de l’injection du virus est correct.</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>c. Confirmez que la concentration du virus est appropriée.</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>2. Au cours de la prochaine intervention chirurgicale, la profondeur d’implantation de la lentille GRIN peut être augmentée de manière appropriée, et la profondeur exacte doit être soigneusement enregistrée chaque fois que l’expérience est menée.</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Le champ d’imagerie montre certains modèles régionaux d’activité neuronale, mais il n’y a pas d’activité clairement visible au niveau cellulaire individuel.</td>
			<td>1. Le volume de virus injecté était excessivement élevé.</td>
			<td>1. Diluez le virus ou réduisez le volume de l’injection de virus.</td>
		</tr><tr><td>2. L’emplacement de l’expression du virus ne correspond pas à la position du cristallin GRIN (généralement, le cristallin est implanté à une profondeur plus faible que la position optimale pour l’expression du virus).</td>
			<td>2. Au cours de la prochaine intervention chirurgicale, la profondeur d’implantation de la lentille GRIN peut être augmentée de manière appropriée, et la profondeur exacte doit être soigneusement enregistrée chaque fois que l’expérience est menée.</td>
		</tr><tr><td>Certaines cellules dans le champ d’imagerie maintiennent un signal de fluorescence constamment brillant à tout moment, et il n’y a aucun changement dans l’intensité de cette fluorescence.</td>
			<td>Le virus est surexprimé dans une seule cellule.</td>
			<td>Diluez le virus ou réduisez le volume de l’injection virale.</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : tableau de dépannage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916_Table%201.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Figure supplémentaire S1 : Acquisition normale de la tâche de mémoire spatiale par des souris ayant subi une intervention chirurgicale. Le graphique montre la quantification du nombre d’essais terminés au cours de la session de 20 minutes chaque jour. Les données sont représentées sous forme de moyenne ± SEM. N = 3 souris dans le groupe avec chirurgie et 4 dans le groupe sans chirurgie. L’ANOVA à deux facteurs a été utilisée pour la comparaison statistique. Abréviation : ns = non significatif. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20Figure%20S1.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Vidéo supplémentaire S1 : Données brutes représentatives de l’imagerie calcique en DG. Cette vidéo démontre l’activité calcique sur une période de 5 minutes. La vidéo est lue à 10 fois la vitesse d’origine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20Video%20S1.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Dossier supplémentaire 1 : La conception de la plaque de tête. Ce fichier présente le dessin 2D de la conception de la plaque de tête. La production de la plaque de tête implique la découpe de l’acier inoxydable selon le dessin. Les deux petits trous sur la barre latérale doivent être taraudés avec des filetages M1.6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20File%201.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Dossier supplémentaire 2 : La conception du capuchon de protection imprimé en 3D. Ce fichier fournit le gcode des tranches de capuchon de protection qui peuvent être utilisées avec une imprimante 3D. Dans ce protocole, nous avons utilisé du plastique à base d’acide polylactique comme matière première pour l’impression. Les petits trous sur le côté correspondent aux positions des trous taraudés sur la plaque de tête pour l’installation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20File%202.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Dossier supplémentaire 3 : La conception du support de miniscope. Ce fichier fournit le gcode des tranches du support de miniscope qui peuvent être utilisées avec une imprimante 3D. Le trou cylindrique est utilisé pour l’installation sur un support stéréotaxique avec une vis M4. Les trous sur le côté sont destinés à ajouter des vis pour le serrage, mais le support peut être utilisé sans cette fonctionnalité. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20File%203.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier supplémentaire 4 : Code de contrôle Arduino et scripts pour le prétraitement vidéo de l’imagerie calcique brute. Ce fichier contient les scripts pour contrôler Arduino et le code pour le prétraitement des données d’imagerie calcique. Le code Arduino contrôle la configuration du comportement dans laquelle la souris apprend à lécher pour des récompenses d’eau aux extrémités alternées d’une piste linéaire. En apprenant la tâche, les souris courront à plusieurs reprises d’avant en arrière sur la piste. Le code de prétraitement de l’imagerie calcique effectue la conversion de format de fichier, la correction de mouvement, le sous-échantillonnage spatial et l’extraction du signal cellulaire à partir des données collectées par le miniscope. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916_Supplemental%20File%204.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Le gyrus denté de l’hippocampe remplit des fonctions essentielles et distinctes dans l’apprentissage et la mémoire. Ce protocole décrit un ensemble de procédures robustes et efficaces pour l’imagerie calcique in vivo des cellules granulaires dans le gyrus denté chez des souris se déplaçant librement.

Imagerie calcique in vivo de cellules granulaires dans le gyrus denté de l’hippocampe chez la souris 

Real-time approaches are typically needed in studies of learning and memory, and in vivo calcium imaging provides the possibility to investigate neuronal ...

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Pour comprendre la dynamique des réseaux de microcircuits du néocortex, il est indispensable d'enregistrer simultanément l'activité d'un grand nombre de neurones. L'imagerie in vivo de calcium à deux photons est la seule méthode qui permet d'enregistrer l'activité d'une population dense de neurones avec une seule cellule de résolution.

In Vivo 2-Photon Imaging calcium dans la couche 2 / 3 de souris

Source : Shannonhouse, J., et al. Imagerie calcique in vivo Imagerie calcique d’ensembles neuronaux dans des réseaux de neurones sensoriels primaires dans des ganglions de la racine dorsale intacts. J. Vis. Exp. (2023). La vidéo fait la démonstration d’une technique d’imagerie calcique in vivo pour surveiller l’activité neuronale dans les ganglions de la racine dorsale (DRG) d’une souris transgénique. Les neurones DRG expriment un indicateur de calcium qui augmente l’intensité de la...

Imagerie calcique in vivo d’ensembles neuronaux dans les ganglions intacts de la racine dorsale d’une souris

Source : Calvo-Rodríguez, et al. Imagerie par fluorescence et bioluminescence du ca2+} dans les neurones de l’hippocampe âgés. J. Vis. exp. (2015).  Cette vidéo montre l’utilisation de l’imagerie par fluorescence pour mesurer les niveaux de calcium cytosolique dans les cultures d’hippocampe de rats à court et à long terme. En comparant des neurones jeunes et âgés, il met en évidence comment l’augmentation de la densité des canaux calciques voltage-dépendants de type L et l’activation prolongée...

Imagerie calcique in vitro dans des cultures d’hippocampes de rats à court et à long terme

Source : Lee, H. et. al., Imagerie calcique in vivo réussie avec un microscope miniaturisé monté sur la tête dans l’amygdale d’une souris se comportant librement. J. Vis. Exp. (2020)Cette vidéo montre l’imagerie calcique in vivo chez une souris à l’aide d’un indice de réfraction à gradient, ou lentille GRIN, et d’un microscope miniaturisé. La configuration combine la fixation de la tête dans un système de cage mobile sans friction, stimulant les neurones et déclenchant l’afflux d’ions calcium.

Imagerie calcique microendoscopique en temps réel chez une souris en mouvement libre

Nous présentons ici comment exposer le ganglion géniculé d’une souris de laboratoire vivante et anesthésiée et comment utiliser l’imagerie calcique pour mesurer les réponses d’ensembles de ces neurones aux stimuli gustatifs, permettant ainsi de multiples essais avec différents stimulants. Cela permet des comparaisons approfondies de quels neurones répondent à quels tastants.

Imagerie calcique in vivo des réponses des neurones ganglionnaires géniculés de souris aux stimuli gustatifs

Nous présentons un protocole pour exposer le tronc cérébral de la souris adulte du côté ventral. En utilisant une lentille à indice de réfraction gradient avec un microscope miniature, l’imagerie au calcium peut être utilisée pour examiner l’activité de la somata neuronale olive inférieure in vivo.

In vivo Imagerie du calcium chez la souris Olive inférieure

L’imagerie calcique in vivo Miniscope est une technique puissante pour étudier la dynamique neuronale et les microcircuits chez des souris qui se comportent librement. Ce protocole décrit la réalisation de chirurgies cérébrales pour obtenir une bonne imagerie calcique in vivo à l’aide d’un miniscope.

Injection virale stéréotaxique et implantation de lentilles à indice de gradient pour l’imagerie calcique in vivo du cerveau profond

Ce protocole décrit l’exposition chirurgicale du ganglion radiculaire dorsal (DRG) suivi de GCaMP3 (indicateur Ca2+ codé génétiquement; Protéine fluorescente verte-calmoduline-protéine M13 3) Imagerie Ca2+ des ensembles neuronaux à l’aide de souris Pirt-GCaMP3 tout en appliquant une variété de stimuli à la patte postérieure ipsilatérale.

In vivo Imagerie calcique d’ensembles neuronaux dans des réseaux de neurones sensoriels primaires dans des ganglions radiculaires dorsaux intacts

Le présent protocole décrit l’imagerie calcique in vivo pour mesurer les réponses d’ensembles de neurones lombaires-6 DRG à des stimuli somatiques et viscéraux. Des comparaisons approfondies peuvent être faites entre les neurones répondant à différents stimuli. Ce protocole est précieux pour étudier les mécanismes de la douleur viscérale et de la stimulation somatique, comme l’acupuncture.

in vivo Imagerie calcique de la réponse des neurones des ganglions de la racine dorsale aux stimuli somatiques et viscéraux

Les indicateurs calciques codés génétiquement (GECI) permettent une analyse robuste de la signalisation des neurones sensoriels à l’échelle de la population. Ici, nous avons développé une nouvelle approche qui permet de visualiser in vivo l’activité des neurones des ganglions trijumeaux chez le rat.

In-Vivo Imagerie calcique des neurones sensoriels dans le ganglion trijumeau du rat

Ce protocole décrit l’imagerie calcique GCaMP in vivo de neurones intacts du ganglion du trijumeau (TG). Cette description comprend la chirurgie d’exposition aux TG, l’imagerie par microscopie confocale in vivo des neurones TG, l’application de stimuli somatiques pendant l’imagerie microscopique des neurones TG et l’analyse des données d’imagerie calcique GCaMP in vivo .

In vivo Imagerie calcique d’ensembles neuronaux dans des réseaux de neurones sensoriels primaires dans des ganglions du trijumeau intacts

Découvrez l'imagerie calcique in vivo des cellules granulaires du gyrus denté chez la souris en mouvement libre. Cette méthode combine injection virale et implantation de lentille GRIN pour étudier les activités neuronales liées aux fonctions cognitives.

Imagerie calcique in vivo de cellules granulaires dans le gyrus denté de l’hippocampe chez la souris

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