Name: Transfert mitochondrial via des nanotubes à effet tunnel entre les cellules souches mésenchymateuses et l’épithélium pigmentaire rétinien in vitro (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T13:55:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: Découvrez le transfert mitochondrial bidirectionnel entre cellules souches mésenchymateuses et épithélium pigmentaire rétinien via des nanotubes à effet tunnel. Cette méthode permet d'étudier la communication cellulaire et les mécanismes de sauvetage in vitro.

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<meta charset="utf8"></head><body>Étude du transfert mitochondrial dans les co-cultures MSC et ARPE19

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<table><tbody><tr><td>0,25 % Trypsine-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>4 % paraformaldéhyde</td><td>Solarbio</td><td>P1110</td><td></td></tr><tr><td>Plaque 6 puits</td><td>NEST</td><td>703001</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tube à centrifuger</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>24 puits</td><td>NEST</td><td>702001</td><td></td></tr><tr><td>ARPE19 cellules</td><td>ATCC</td><td>CRL-2302</td><td>Lignées cellulaires</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Beyotime</td><td>ST025</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace violet</td><td>Invitrogen</td><td>C34557</td><td></td></tr><tr><td>Lame de couverture</td><td>NEST</td><td>801007</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>C141905005BT</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12-GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>10565-042</td><td></td></tr><tr><td>Fœtus bovins Sérum (FBS)</td><td>VivaCell</td><td>C04002-500</td><td></td></tr><tr><td>FluorSave Réactif</td><td>Millipore</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>MSCs</td><td>Nuwacell</td><td>RC02003</td><td>Lignées cellulaires</td></tr><tr><td>ncMission</td><td>Shownin</td><td>RP02010</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>pCT-Mito-GFP</td><td>SBI</td><td>CYTO102-PA-1</td><td>Plasmide; À partir de&nbsp ; https://www.systembio.com/mitochondria-cyto-tracer-pct-mito-gfp-cmv</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>MCE</td><td>HY-B1743A</td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Axygen</td><td>TF-1000-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A22287</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Solarbio</td><td>T8200</td><td></td></tr><tr><td>Transwell plaque</td><td>Corning</td><td>3470</td><td></td></tr></tbody></table>

transfert mitochondrial via des nanotubes à effet tunnel entre les cellules souches mésenchymateuses et l’épithélium pigmentaire rétinien in vitro

Mitochondrial Transfer Via Tunneling Nanotubes Between Mesenchymal Stem Cells and Retinal Pigment Epithelium In Vitro

Le schéma de principe illustrant la co-culture directe de cellules souches mésenchymateuses (CSM) et de cellules ARPE19 est illustré à la figure 1. Les CSM, conçues pour exprimer la mito-GFP, en tant que cellules donneuses, et les cellules ARPE19-mito-RFP avec des membranes cytoplasmiques marquées en violet en tant que cellules réceptrices ont été co-cultivées dans un rapport de 1:1. Après une période de co-culture de 24 heures, les cellules ont été colorées pour la phalloïdine et examinées à l’aide d’une microscopie confocale. Les populations cellulaires résultantes comprenaient des cellules MSC-mito-GFP, des cellules ARPE19-mito-RFP, des cellules ARPE19-mito-RFP contenant de la mito-GFP et des cellules MSC-mito-GFP contenant de la mito-RFP. Notamment, la présence de mito-GFP dans les cellules ARPE19 et de mito-RFP dans les CSM suggère un transfert bidirectionnel mitochondrial.
Des détails spécifiques sur la formation du TNT sont présentés à la figure 2. Ces structures peuvent établir des connexions intercellulaires entre des cellules d’un même type (Figure 2A-C), ainsi qu’entre des cellules de types différents (Figure 2D). Les nanotubes à effet tunnel (TNT) servent de conduits reliant les cellules adjacentes, présentant une structure membranaire distinctive riche en F-actine avec des extrémités ouvertes facilitant la continuité cytoplasmique et le transport des mitochondries. En utilisant l’imagerie de l’axe Z, il est évident que les TNT ne sont pas fermement ancrés à la matrice extracellulaire, mais plutôt suspendus dans le milieu de culture, ce qui les distingue des protubérances cellulaires conventionnelles. Le transfert mitochondrial est évident sur la figure 3, où les cellules ARPE19 violettes positives présentent une fluorescence dispersée, pointillée en vert, indiquant des mitochondries provenant de CSM (figure 3A). Les CSM violettes négatives contenant une fluorescence pointillée rouge représentent le transfert mitochondrial des cellules ARPE19 (Figure 3B). La figure 4 montre la formation du TNT et le transfert mitochondrial sous imagerie à super-résolution, à partir de laquelle nous pouvons voir plus de détails sur le transfert mitochondrial via le TNT. La vidéo 1 montre la dynamique du transport mitochondrial à travers le TNT.
Pour démontrer davantage que la condition préalable au transfert mitochondrial est le contact physique, comme le TNT, plutôt que la sécrétion et l’absorption mitochondriales, nous avons utilisé une méthode de co-culture précédemment rapportée10. Comme le montre la figure 5A, les cellules MSC et ARPE19 ont été ensemencées dans les chambres supérieure et inférieure d’une plaque de transwell, respectivement. Ils ont été séparés par un filtre à pores de 0,4 μm, qui bloquait le contact direct entre les CSM et les cellules ARPE19 mais permettait le passage des mitochondries. Après 24 h de co-culture, les cellules ARPE19 de la chambre inférieure ont été analysées et une faible quantité de mito-GFP a été observée dans les CSM de la chambre supérieure (Figure 5B). Ces résultats suggèrent que le transfert mitochondrial nécessite un contact direct entre les CSM et les cellules ARPE19.
En fin de compte, la quantification de la formation de TNT et du transfert mitochondrial a été effectuée, avec les résultats correspondants représentés à la figure 6. Les CSM étaient significativement plus capables de donner des mitochondries que les cellules ARPE19 (p = 0,0286). Ces résultats indiquent que les CSM possèdent la capacité de transférer les mitochondries aux cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66917/66917fig01.jpg"> Figure 1 : Vue schématique de la co-culture de CSM et de cellules ARPE19. Les CSM exprimant des cellules mito-GFP et ARPE19-mito-RFP marquées avec CellTrace Violet sont co-cultivées pendant 24 h à un rapport de 1:1. Mito-GFP dans les cellules violettes + marque le transfert des mitochondries des CSM aux cellules ARPE19, tandis que Mito-RFP dans les cellules violettes marque le transfert des mitochondries des cellules ARPE19 vers les CSM. Abréviations : GFP = protéine fluorescente verte ; RFP = protéine fluorescente rouge ; CSM = cellules souches mésenchymateuses. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66917/66917fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66917/66917fig02.jpg"> Figure 2 : Formation de TNT entre les CSM et les cellules ARPE19. Les pointes de flèches blanches indiquent la formation de TNT, les pointes de flèches vertes indiquent les mitochondries avec mito-GFP et les pointes de flèches rouges indiquent les mitochondries avec mito-RFP. (A,B) Formation de TNT entre les cellules ARPE19. (C) Formation de TNT entre les CSM. (D) Formation de TNT entre les CSM et les cellules ARPE19. Imagerie de l’axe Z montrant des TNT en suspension dans le milieu de culture. Barres d’échelle = 25 μm. Abréviations : CSM = cellules souches mésenchymateuses ; TNT = nanotubes à effet tunnel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66917/66917fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66917/66917fig03.jpg"> Figure 3 : Transfert mitochondrial des CSM vers les cellules ARPE19. (A) Le cercle pointillé blanc indique le transfert mitochondrial (mito-GFP) des CSM vers les cellules ARPE19, et (B) le cercle pointillé jaune indique le transfert mitochondrial (mito-RFP) des cellules ARPE19 vers les CSM. Barres d’échelle = 20 μm. Abréviation : GFP = protéine fluorescente verte ; RFP = protéine fluorescente rouge ; CSM = cellules souches mésenchymateuses. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66917/66917fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66917/66917fig04.jpg"> Figure 4 : Formation de TNT et transfert mitochondrial entre les CSM et les cellules ARPE19 par microscopie à super-résolution. (A et B) Transport mitochondrial des CSM vers les cellules ARPE19. (C) Détail des TNT sous imagerie à super-résolution. (D) Mitochondries vertes de CSM présentes dans les cellules ARPE19 sous imagerie à super-résolution. Barre d’échelle = 5 μm. Abréviations : CSM = cellules souches mésenchymateuses ; TNT = nanotubes à effet tunnel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66917/66917fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66917/66917fig05.jpg"> Figure 5 : Transfert mitochondrial presque indétectable en co-culture indirecte dans le système de transpuits de CSM et de cellules ARPE19. (A) Vue schématique de la co-culture de CSM et de cellules ARPE19 dans le système de transwell. (B) Images représentatives des cellules ARPE19 dans la partie inférieure de la plaque de transpuits après co-culture indirecte avec des CSM pendant 24 h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66917/66917fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66917/66917fig06.jpg"> Figure 6 : Quantification de la formation de TNT et du transfert mitochondrial. (A) la formation de TNT, (B) le transfert mitochondrial. Abréviations : M = CSM = cellules souches mésenchymateuses ; A = cellules ARPE19 ; TNT = nanotubes à effet tunnel ; M-A = formation de TNT entre les CSM et les cellules ARPE19 ; M-M = formation de TNT entre les CSM ; A-A = formation de TNT entre les cellules ARPE19. n = 4, moyenne ± écart-type, test U de Mann-Whitney, *p &lt; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66917/66917fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Figure supplémentaire S1 : Cartographie du plasmide pCT-Mito-copGFP. Achat de Mito-GFP (CYTO102-PA-1). Le cyto-traceur mitochondria, pCT-Mito-GFP (CMV), fusionne avec copGFP via une étiquette Cox8, ce qui entraîne le marquage des mitochondries avec copGFP. Cette fusion copGFP est pilotée par le promoteur CMV, permettant une expression robuste dans des lignées cellulaires telles que HeLa, HEK293 et HT1080. Mito-RFP a été modifié à partir de mito-GFP en remplaçant GFP par RFP ; il est porteur d’un gène de résistance à la puromycine. L’emballage lentiviral de ce plasmide est réalisé par des entreprises spécialisées. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66917/66917_Supplementary%20figure.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Vidéo 1 : Transport mitochondrial médié par le TNT entre les CSM et les cellules ARPE19. Le TNT est généré par le mouvement bidirectionnel des cellules MSC et ARPE19, facilitant le transfert des mitochondries des cellules MSC vers les cellules ARPE19. Abréviations : CSM = cellules souches mésenchymateuses ; TNT = nanotubes à effet tunnel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66917/66917_TNT_Video.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.</a>

Transfert mitochondrial via des nanotubes à effet tunnel entre les cellules souches mésenchymateuses et l’épithélium pigmentaire rétinien in vitro

Mitochondrial transfer is a normal physiological phenomenon that occurs widely among various types of cells. In the study to date, the most important ...

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Transfert mitochondrial via des nanotubes à effet tunnel entre les cellules souches mésenchymateuses et l’épithélium pigmentaire rétinien in vitro (Vidéo) | JoVE Journal

Transfert mitochondrial via des nanotubes à effet tunnel entre les cellules souches mésenchymateuses et l’épithélium pigmentaire rétinien in vitro

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