Name: Génération et caractérisation d’organoïdes utérins de rat à partir de cellules souches épithéliales de l’endomètre de rat (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-02T14:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: Découvrez comment générer des organoïdes utérins de rat à partir de cellules souches épithéliales endométriales. Cette méthode permet d'étudier les maladies endométriales et de tester des médicaments in vitro.

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</ol>

<table><tbody><tr><td>Anti-CD15 (SSEA-1)</td><td>Abcam</td><td>ab135377</td><td>Lapin, 1:200 (IHC)</td></tr><tr><td>Récepteur anti-œstrogène alpha</td><td>Abcam</td><td>ab32063</td><td>Lapin, 1:200 (IHC)</td></tr><tr><td>Anti-cytokératine</td><td>Abcam</td><td>ab7753</td><td>Souris, 1:250 (IHC)</td></tr><tr><td>Récepteur anti-progestérone</td><td>Abcam</td><td>ab101688</td><td>Lapin, 1:200 (IHC)</td></tr><tr><td>Anti-Ki67</td><td>Abcam</td><td>ab279653</td><td>Souris, 1:250 (IHC)</td></tr><tr><td>A8301</td><td>TargetMol</td><td>909910-43-6</td><td></td></tr><tr><td>&beta ;-Estradiol</td><td>Merck</td><td>E8875</td><td></td></tr><tr><td>Kit de comptage cellulaire-8</td><td>Beyotime</td><td>C0038</td><td></td></tr><tr><td>CD9</td><td>BioLegend</td><td>109819</td><td>1:20 (FC), Pacific Blue</td></tr><tr><td>CD24</td><td>BioLegend</td><td>101806</td><td>1:20 (FC), FITC</td></tr><tr><td>CD31</td><td>BioLegend</td><td>303120</td><td>1:20 (FC), APC</td></tr><tr><td>CD45</td><td>BioLegend</td><td>301703</td><td>1:20 (FC), PE</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>TargetMol</td><td>CT99021</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex Organoïde Solution de récolte</td><td>R& D Systems</td><td>3700-100-01</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 TSA Kit système de fluorescence</td><td>APExBIO</td><td>K1051</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 Kit système de fluorescence</td><td>TSA APExBIO</td><td>K1052</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>1 &mu ; g/mL</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Invitrogen</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM</td><td>BioLegend</td><td>369803</td><td>1:20 (FC), PerCP</td></tr><tr><td>Fluorescéine TSA Fluorescence System Kit</td><td>APExBIO</td><td>K1050</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11008</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Chèvre anti-souris IgG, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A-21422</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Chèvre Anti-lapin IgG/HRP</td><td>anticorps APExBIO</td><td>bs-0295G-HRP</td><td></td></tr><tr><td>Knockout sérum substitut</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript RT Master Mix</td><td>Takara</td><td>RR063A</td><td></td></tr><tr><td>Progestérone</td><td>Merck</td><td>57-83-0</td><td></td></tr><tr><td>Sprague-Dawley rat&nbsp ;</td><td>Shanghai JieSiJie Laboratory Animals Co., LTD, Chine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SSEA-1</td><td>BioLegend</td><td>323047</td><td>1:20 (FC), APC</td></tr><tr><td>TB Green Fast qPCR Mix</td><td>Takara</td><td>RR820A</td><td></td></tr><tr><td>TriZOL</td><td>Invitrogen</td><td>15596026CN</td><td>Extraction d’ARN</td></tr><tr><td>u-Slide Plaques à 8 puits</td><td>Ibidi</td><td>80827</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>TargetMol</td><td>146986-50-7</td><td></td></tr><tr><td><amorces >qPCR fortes des gènes cibles" </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Genes</strong</td><td>>Company</td><td>Sequences</td><td></td></tr><tr><td>rat GAPDH F</td><td>Sangon biotech</td><td>GACATGCCGCCTGGAGAAAC</td><td></td></tr><tr><td>rat GAPDH R</td><td>Sangon biotech</td><td>AGCCCAGGATGCCCTTTAGT</td><td></td></tr><tr><td>rat Nanog F</td><td>Sangon biotech</td><td>GACTAGCAACGGCCTGACTCA</td><td></td></tr><tr><td>rat Nanog R&nbsp ;</td><td>Sangon biotech</td><td>CTGCAATGGATGCTGGGATA</td><td></td></tr><tr><td>rat Sox2 F</td><td>Sangon biotech</td><td>ATTACCCGCAGCAAAATGAC</td><td></td></tr><tr><td>rat Sox2 R</td><td>Sangon biotech</td><td>ATCGCCCGGAGTCTAGTTTTCT</td><td></td></tr><tr><td>rat Oct4 F</td><td>Sangon biotech</td><td>CCCAGCGCCGTGAAGTTGGA</td><td></td></tr><tr><td>rat Oct4 R</td><td>Sangon biotech</td><td>ACCTTTCCAAAGAGAACGCCCA GG</td><td></td></tr></tbody></table>

génération et caractérisation d’organoïdes utérins de rat à partir de cellules souches épithéliales de l’endomètre de rat

Generation and Characterization of Rat Uterus Organoids from Rat Endometrial Epithelial Stem Cells

Les reESC et les organoïdes utérins de rat ont été établis à partir de six rats Sprague-Dawley femelles pesant entre 200 g et 250 g selon le protocole décrit à la figure 1. S’appuyant sur le succès de la culture à long terme de cellules souches épithéliales de l’endomètre humain, la formulation REEM était principalement composée de Y27632, A8301 et CHIR99021. Pour stabiliser les cellules endométriales in vitro, nous avons d’abord isolé des cellules endométriales de l’endomètre de rat à l’aide de techniques enzymatiques et mécaniques. L’analyse par cytométrie en flux de la figure 2A a révélé que les cellules endométriales primaires comprenaient environ 50 % de cellules épithéliales exprimant CD9 (49,8 %), avec de faibles niveaux d’EpCAM (4,49 %) et de CD24 (2,64 %). Le marqueur SSEA-1 pour les reESC était présent à 6,58 %, tandis que les marqueurs endothéliales CD31 (30,9 %) et CD45 (70,3 %) étaient relativement élevés.
Cependant, l’élevage dans REEM a permis d’obtenir des reESC P1 présentant une morphologie verticillée ou polyédrique uniforme et formant des structures de clones compactes (Figure 2D). L’élimination progressive des facteurs individuels des REEM a conduit à une diminution correspondante de la capacité de prolifération des REE. Le test de formation de clones a mis en évidence le rôle critique de Y27632 dans la culture stable des reESC (Figure 2B,C). Lors du troisième passage, les reESC ont montré une expression cohérente de SSEA-1 et de cytokératine, indiquant une expansion réussie des reESC primaires pendant la culture (Figure 2F). De plus, les reESC ont maintenu une capacité de prolifération robuste et stable, même lors de passages tardifs (Figure 2E), démontrant ainsi leur isolement et leur expansion réussis dans le système REEM actuel.
Des cultures d’organoïdes ont été établies selon un système précédemment rapporté dérivé de cellules souches endométriales humaines8. En 3 jours, les reESC ont montré une auto-organisation rapide en structures de type organoïde avec un centre creux, qui ont ensuite augmenté en taille et en épaisseur (voir Figure 3A). Les résultats typiques de coloration HE illustrant la formation d’organoïdes par les reESC sont présentés à la figure 3B. Ces cultures d’organoïdes peuvent être maintenues par le passage, comme en témoigne la viabilité cellulaire élevée indiquée par la coloration Ki67 après le passage direct et les cycles de gel-dégel. De plus, une coloration HE a été réalisée sur la 10e génération d’organoïdes, et les résultats ont montré que la structure organoïde pouvait être maintenue intacte (voir Figure 3E). De plus, les résultats de la qPCR ont indiqué que Nanog, Sox2 et Oct4 étaient exprimés à des niveaux comparables à ceux de la génération P1 (Figure 3F). Cette découverte suggère le potentiel de culture à long terme d’organoïdes dans le système actuel.
Notre étude a mené une enquête préliminaire sur la réponse des structures utérines de rat à E2 et P4. La coloration par immunofluorescence de la figure 4A a révélé la présence de récepteurs d’œstrogène et de progestérone. Après une supplémentation en E2 , ces organoïdes sont passés d’une forme sphérique creuse à un modèle de croissance interne plus densément peuplé (Figure 4C). L’exposition subséquente au P4 a entraîné une diminution de la perméabilité des structures denses, ce qui a finalement entraîné leur désintégration (figure 4B). Ces résultats suggèrent que E2 entraîne potentiellement une différenciation supplémentaire des structures utérines de rat, tandis que P4 peut déclencher des voies apoptotiques.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66928/66928fig01v2.jpg"> 
Figure 1 : Procédures utilisées pour établir les cellules souches épithéliales de l’endomètre du rat et les organoïdes de l’utérus du rat. Abréviation : SD = Sprague-Dawley. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66928/66928fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66928/66928fig02v2.jpg"> 
Figure 2 : Génération et culture à long terme de cellules souches épithéliales épithéliales de l’endomètre du rat in vitro. (A) Analyse cytométrique en flux montrant la proportion de cellules positives dans l’endomètre du rat. (B) Coloration violette cristalline de clones dans REEM avec ou sans A8301, Y27632 ou CHIR99021, respectivement. Barres d’échelle = 1 cm. (C) Les numéros de clone en REEM avec ou sans facteurs. Les barres d’erreur représentent l’écart-type ; n = 3 donneurs (***, p&lt;0,001). (D) Images de microscopie optique de cellules souches épithéliales de l’endomètre de rat P1 avec et sans coloration violette cristalline. (E) Analyses CCK-8 de cellules souches épithéliales de l’endomètre du rat au passage 1, au passage 7 et au passage 14. Les barres d’erreur représentent l’écart-type, n = 3. (F) Analyses d’immunofluorescence démontrant l’expression de la cytokératine et de SSEA-1. Abréviation : REEM = reESCs support d’expansion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66928/66928fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66928/66928fig03v2.jpg"> 
Figure 3 : Génération et culture à long terme d’organoïdes endométriaux de rat in vitro. (A) Images de microscopie optique d’organoïdes endométriaux de rat P1. (B) Coloration H&amp;E pour les organoïdes P1 à partir de cellules souches épithéliales de l’endomètre de rat. (C) Analyses d’immunofluorescence démontrant l’expression de la cytokératine et de SSEA-1. (D) Analyses d’immunofluorescence démontrant l’expression de Ki67 et SSEA-1. (E) Coloration H&amp;E pour les organoïdes de rat P 10. (F) Analyses qPCR pour l’expression de Nanog, Sox2 et Oct-4 dans les organoïdes endométriaux de rat P1 et P10. Expression normalisée à GAPDH (n = 3, test t bilatéral non apparié, n.s. = non significatif). Abréviation : H&amp;E = hématoxyline et éosine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66928/66928fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66928/66928fig04.jpg"> 
Figure 4 : Culture séquentielle d’organoïdes avec E2 et P4. (A) Analyses d’immunofluorescence démontrant l’expression du récepteur des œstrogènes, du récepteur progestatif et de la SSEA-1. (B) Vue d’ensemble des images de microscopie optique d’organoïdes de rats cultivés en E2 et P4. (C) Les images de microscopie optique montrent la transformation d’une sphère creuse en sphère dense à l’intérieur de la cavité interne des organoïdes après avoir été cultivée 7 jours en E2. Abréviations : RE = récepteur des œstrogènes ; PR = récepteur progestatif. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66928/66928fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Génération et caractérisation d’organoïdes utérins de rat à partir de cellules souches épithéliales de l’endomètre de rat

Endometrial organoids offer valuable insights into the development and pathophysiology of endometrial diseases and serve as platforms for drug testing. ...

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