Utilisation d’oligonucléotides synthétiques modifiés pour doser des enzymes métabolisant des acides nucléiques
5 juillet 2024
Ici, un protocole pour doser les enzymes métabolisant les acides nucléiques est présenté, à l’aide d’exemples d’enzymes ligase, nucléase et polymérase. Le test utilise des oligonucléotides marqués par fluorescence et non marqués qui peuvent être combinés pour former des duplex imitant les dommages à l’ARN et/ou à l’ADN ou les intermédiaires de voie, permettant la caractérisation du comportement enzymatique.
Donc, mon groupe de recherche, nous nous intéressons vraiment aux enzymes impliquées dans la réplication et la réparation de l’ADN. En particulier, nous étudions les enzymes des micro-organismes extrêmophiles et aussi des agents pathogènes parce que nous voulons comprendre comment ces enzymes permettent à ces organismes de survivre aux défis environnementaux. Nous nous intéressons à la fois à la fonction biologique des enzymes et aux applications biotechnologiques.
Nous travaillons donc beaucoup avec l’ADN et l’ARN ligases, et nous avons récemment établi le rôle d’un type minimal d’ADN ligase qui semble être trafiqué vers l’extérieur de la cellule bactérienne. Et nous avons déterminé que cela joue un rôle dans la formation du biofilm chez l’agent pathogène Neisseria gonorrhoeae. Nous avons également, en collaboration avec nos collaborateurs d’ArcticZymes, caractérisé une nouvelle ligase ARN-ADN, capable de fixer des adaptateurs d’ADN à l’une ou l’autre extrémité d’un morceau d’ARN.
C’est pourquoi nos collaborateurs d’ArcticZymes, qui ont également contribué à ce protocole, caractérisent différentes enzymes métabolisant l’ADN et l’ARN qui ont des applications potentielles en biologie moléculaire. Ils utilisent donc ce type de protocole comme première étape pour comprendre le spectre des activités de ces enzymes et les comparer à ce qui est déjà disponible sur le marché. Le protocole offre une alternative plus facile et plus sûre pour doser les enzymes métabolisant les acides nucléiques par rapport à l’utilisation de substrats radiomarqués.
Les substrats d’ADN ou d’ARN marqués par fluorescence rendent notre approche plus efficace, car nous pouvons mélanger et assortir les oligonucléotides pour créer une variété de substrats. Donc, pour le moment, nous nous concentrons vraiment sur la compréhension de la fonction biologique de certaines nouvelles nucléases que nous avons découvertes dans un génome environnemental de l’Antarctique. Ces nucléases ont des homologues chez d’autres organismes extrêmophiles, et nous essayons donc de comprendre quel rôle elles jouent pour permettre à ces microbes de survivre.
Nous nous intéressons également à l’activité de certaines de nos nouvelles enzymes sur les analogues d’acides nucléiques non naturels et à leurs utilisations potentielles dans le cadre d’une boîte à outils de biologie moléculaire avec des substrats d’ADN et d’ARN non naturels.
Aperçu
Cet article présente un protocole pour l'analyse d'enzymes métabolisant les acides nucléiques, en se concentrant sur les enzymes ligase, nuclease et polymérase. Le dosage utilise des oligonucléotides marqués par fluorescence et non marqués pour former des duplex imitant les lésions de l'ARN et de l'ADN, facilitant ainsi la caractérisation du comportement enzymatique.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biochimie
- Biologie moléculaire
- Dosages enzymatiques
Contexte
- Recherche sur les enzymes impliquées dans la réplication et la réparation de l'ADN.
- Étude des microorganismes extrémophiles et des agents pathogènes.
- Compréhension des fonctions biologiques et des applications biotechnologiques de ces enzymes.
- Étude des ligases d'ADN et d'ARN et de leur rôle dans la survie bactérienne.
Objectif de l'étude
- Caractériser les enzymes métabolisant les acides nucléiques.
- Étudier le rôle des ADN ligases dans la formation du biofilm.
- Explorer de nouvelles ligases ARN vers ADN pour des applications biotechnologiques.
Méthodes utilisées
- Développement de tests utilisant des oligonucléotides marqués par fluorescence.
- Caractérisation du comportement enzymatique par formation d'hybrides double brin.
- Collaboration avec ArcticZymes pour la caractérisation d'enzymes.
- Étude du trafic enzymatique dans les cellules bactériennes.
Résultats principaux
- Mise en évidence du rôle d'une DNA ligase minimale dans la formation du biofilm.
- Caractérisation d'une nouvelle ligase ARN à ADN.
- Apports sur les mécanismes de survie des microorganismes extrémophiles face aux contraintes environnementales.
- Applications biotechnologiques potentielles des enzymes étudiées.
Conclusions
- L'étude améliore la compréhension des enzymes métabolisant les acides nucléiques.
- Les résultats pourraient conduire à de nouvelles applications biotechnologiques.
- Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour explorer tout le potentiel de ces enzymes.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Des tests basés sur des oligonucléotides synthétiques modifiés permettent une caractérisation rapide et non radioactive d'enzymes métabolisant les acides nucléiques, facilitant la validation précoce de cibles thérapeutiques et la réduction des risques mécanistiques en recherche et développement biopharmaceutiques.&D. Le marquage fluorescent et la personnalisation des substrats facilitent l'évaluation quantitative et à haut débit de la spécificité enzymatique, de la préférence pour les cofacteurs et de la compatibilité des substrats. Ces capacités simplifient l'évaluation de nouvelles ligases, nucléases et polymérases, accélérant le tri des portefeuilles et réduisant l'incertitude biologique dans les voies de découverte.
Applications stratégiques en R&D biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet d'étudier la spécificité des substrats enzymatiques et les besoins en cofacteurs pour la validation fonctionnelle des cibles.
- Contribue à l'atténuation des risques mécanistiques en analysant l'activité enzymatique sur des substrats d'acides nucléiques endommagés ou non naturels.
- Facilite l'évaluation comparative d'enzymes nouvelles par rapport à des références établies pour le tri des portefeuilles.
Développement de tests et criblage
- Fournit des substrats normalisés et modulaires pour des dosages d'activité enzymatique reproductibles.
- Offre des résultats quantitatifs basés sur la fluorescence, adaptés à des protocoles de criblage évolutifs.
- Élimine la manipulation de substances radioactives, améliorant ainsi la sécurité opérationnelle et l'accessibilité dans les laboratoires.
Recherche translationnelle et préclinique
- Permet l'évaluation de l'activité enzymatique sur des analogues d'acides nucléiques d'intérêt pathologique ou synthétiques, lorsque la conception du substrat le permet.
- Assure la continuité entre la découverte et la validation préclinique en fournissant des formats d'essai robustes et transférables.
- Facilite la prise de décisions d'avancement ajustées au risque grâce à la caractérisation quantitative des enzymes.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Ces tests basés sur des oligonucléotides placent la caractérisation enzymatique à l'interface entre la phase initiale de découverte, l'identification de candidats thérapeutiques et la recherche préclinique, en soutenant des cycles répétés de vérification d'hypothèses et de validation mécanistique.
- Découverte en biologie : Soutient l'interrogation fondée sur des hypothèses concernant la fonction enzymatique et la compatibilité des substrats.
- Criblage : Fournit des résultats reproductibles et quantitatifs permettant l'évaluation comparative des enzymes.
- Analytique : Permet une mesure précise des activités de ligation, de dégradation et de liaison à l'aide de la quantification de la fluorescence.
- Recherche translationnelle : Autorise l'adaptation à des substrats pertinents pour les maladies ou des substrats synthétiques afin d'assurer un alignement préclinique.
- Réutilisation en milieu professionnel : Offre une plateforme souple, non radioactive, adaptable à diverses classes d'enzymes et aux besoins de recherche variés.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Augmente la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles enzymatiques.
- Valeur opérationnelle : Améliore la standardisation, la reproductibilité et la sécurité en éliminant les matériaux radioactifs.
- Valeur stratégique : Améliore la qualité des décisions d'avancement ou d'abandon et l'efficacité du capital dans les phases initiales de la R&D.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles enzymatiques et des outils pour le développement en aval.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en conception d'oligonucléotides et en optimisation des dosages enzymatiques.
- Suppose l'accès à une imagerie PAGE avec détection de fluorescence et aux infrastructures standards de biologie moléculaire.
- Exige une standardisation interéquipes des protocoles de préparation des substrats et d'analyse des données.
- Permet une adaptation à diverses classes d'enzymes et à des modifications des substrats, selon la disponibilité commerciale des oligonucléotides.
- Peut être limité par la complexité de la conception des substrats ou par la compatibilité de l'enzyme avec des analogues synthétiques.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
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Introduction
2:24
Assembling and Annealing Nucleic Acid Duplexes for Characterizing Enzymatic DNA Processing with Modified Oligonucleotides
3:54
Urea‐Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE) for Probing DNA Enzyme Activities Employing Commercial Oligonucleotides
