Name: Administration constante du virus adéno-associé par injection latérale dans la veine caudale chez des souris adultes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-23T13:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Apprenez l'injection latérale dans la veine caudale chez la souris adulte pour administrer l'AAV en thérapie génique. Cette méthode optimise la transduction virale systémique et améliore la reproductibilité des expériences.

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Les auteurs tiennent à remercier le personnel de l’établissement de soins aux animaux du NINDS pour son soutien. Ce travail a été soutenu par la Division de la recherche intra-muros des NIH, NINDS (rapport annuel numéro 1ZIANS003129). Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health.

Thérapies à base d’AAV par injection intraveineuse dans des modèles murins précliniques

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Les auteurs n’ont aucune divulgation pertinente pour le travail publié dans cet article.

Les thérapies à base d’AAV présentent un grand potentiel pour les troubles monogéniques en raison de la polyvalence de l’AAV en tant que vecteur de thérapie génique, ce qui permet de personnaliser les AAV pour répondre aux divers besoins d’administration de différents troubles 4,5,7,9. Les AAV sont couramment administrés par injection IV dans des modèles murins précliniques pour tester l’innocuité et l’efficacité de traitements potentiels16. Étant donné que différentes doses d’AAV injectées peuvent entraîner des différences marquées dans les résultats expérimentaux, il est essentiel que les expérimentateurs soient en mesure d’injecter systématiquement la dose d’AAV prévue pour garantir la validité et la robustesse des données in vivo générées28. Les injections IV sont largement utilisées, mais elles sont techniquement difficiles et nécessitent une formation approfondie et une pratique continue pour développer et maintenir un niveau de compétence qui garantit des injections toujours réussies 16,17,18,19. En plus de l’injection correcte de l’AAV, il est généralement souhaitable d’utiliser des tests pour évaluer la biodistribution de l’AAV injecté et l’efficacité de l’administration dans les tissus ou les cellules cibles29,30.
Ce protocole vise à aider les expérimentateurs à effectuer facilement des injections IV avec succès et de manière cohérente en décrivant en détail les détails d’un protocole d’injection IV optimisé pour administrer l’AAV chez des souris non sédatives âgées de 7 à 9 semaines. Il est important de noter que les souris qui sont nettement plus petites ou plus grandes que les souris de type sauvage dans la tranche d’âge utilisée ici peuvent présenter un plus grand défi en raison d’une visibilité réduite des veines ou d’une incompatibilité avec les dispositifs de retenue utilisés dans cette méthode. Il a déjà été signalé que les injections par voie intraveineuse ne sont pas appropriées pour l’administration de réactifs par voie intraveineuse chez les souris de moins de 6 semaines en raison de la petite taille des vaisseaux31. Bien que possible, il peut être difficile d’injecter régulièrement des souris pesant moins de 22,0 g avec succès. Les chercheurs utilisant des souris de taille atypique peuvent avoir besoin d’adapter la procédure. Ce protocole décrit également plusieurs tests qui peuvent être utilisés pour évaluer la biodistribution et l’efficacité de la transduction des AAV.
Certains points critiques doivent être gardés à l’esprit lors du suivi de ce protocole. Lors de l’injection, les aiguilles de 29 G offrent une plus grande résistance si l’aiguille n’est pas à l’intérieur de la veine. Cela réduit le volume perdu lors d’une injection périvasculaire accidentelle de la solution lors de tentatives d’injection infructueuses. Les seringues à insuline ont des volumes morts plus petits que les seringues ordinaires. Si vous utilisez une seringue et/ou une aiguille différentes de celles énumérées ici, il peut être nécessaire de préparer un volume d’injection supplémentaire aux étapes 1.1.3.3 du protocole pour tenir compte d’un volume d’espace mort plus important (p. ex., ajouter 30 μL à la dose prévue au lieu de 15 μL).
Si de fines bulles d’air provoquées par l’aspiration se forment sur les côtés de la seringue lors de l’aspiration de la dose d’AAV dans la seringue, tirez lentement l’injectat plus haut dans la seringue. Cela éliminera la plupart des petites bulles d’air. Chargez au moins 10 à 15 μL supplémentaires d’AAV au volume prévu à injecter. Ce volume supplémentaire doit tenir compte de tout volume qui pourrait être perdu lors de l’expulsion de bulles d’air ou d’éventuelles tentatives d’injection infructueuses. (p. ex., si le volume cible à injecter est de 150 μL, chargez 165 μL dans la seringue (à mi-chemin entre les marques de 160 μL et de 170 μL sur l’échelle de la seringue). Si l’aiguille est correctement placée à l’intérieur de la veine et que le volume de la seringue est de 165 μL immédiatement avant la tentative d’injection réussie, délivrez le réactif jusqu’à ce qu’il reste 15 μL dans la seringue (à mi-chemin entre les marques de 10 μL et de 20 μL), délivrant ainsi 150 μL (165 μL - 150 μL = 15 μL)). L’alignement de la lumière du biseau (biseau vers le haut) avec l’échelle de la seringue permet de suivre le volume délivré pendant l’injection.
Certains expérimentateurs préféreront peut-être placer la souris sur le côté de manière à ce que l’une de ses veines soit droite et facilement accessible par rapport à une souris sur ses pieds. Cependant, la queue d’une souris sur le côté sera inclinée à des angles différents en fonction de la taille de la souris, ce qui nécessite un ajustement de l’angle d’injection lors de l’injection de souris de différentes tailles. Cela pourrait avoir un impact négatif sur la cohérence du succès de la procédure. Lors des premières tentatives d’entraînement, les expérimentateurs peuvent essayer les deux orientations de contention des souris pour déterminer leur approche préférée. Le fait d’avoir la souris sur ses pieds permet un accès rapide et facile aux deux veines latérales de la queue. Cela réduit le temps de contention lorsque l’accès aux deux veines est nécessaire en cas de tentatives d’injection multiples infructueuses.
Si vous injectez la veine latérale près de la base de la queue (plus près du corps de la souris) (en particulier pour les souris pesant >30 g), ajustez l’angle d’injection de parallèle à la veine à 5°-10° par rapport à la veine, car la veine à la base de la queue est légèrement plus profonde qu’elle ne l’est distalement.
Les protocoles de digestion de la RNase et de contrôle de la contamination par l’ARN énumérés ici ont été vérifiés sur des échantillons d’ADN isolés de tissus hépatiques fraîchement congelés contenant un total de 175 à 700 ng d’acides nucléiques dans 20 μL. Le protocole de digestion de la RNase a également été testé sur des échantillons d’ADN isolés de tissus hépatiques fraîchement congelés et de cellules triées par FACS pour confirmer la présence du génome du vecteur et du génome de la souris après la digestion de la RNase. Les résultats ont été visualisés à l’aide de l’électrophorèse sur gel d’agarose de l’amplification PCR finale des amplicons cibles.
Suivre la méthodologie décrite peut réduire le temps de formation et de pratique nécessaire pour maîtriser les injections IV et entraîner un taux d’injection réussi plus élevé, ce qui permettrait d’économiser des réactifs. Ce protocole utilise des outils simples et couramment utilisés sans avoir besoin d’équipements avancés ou de configurations qui pourraient ne pas être facilement disponibles. De plus, les étapes d’injection IV énumérées ici peuvent être appliquées à une large gamme d’injections qui doivent être administrées par voie intraveineuse, telles que les oligonucléotides antisens (ASOs), avec les modifications appropriées apportées aux étapes de préparation de l’injection en fonction de l’injection.

Les maladies monogéniques représentent 80 % des maladies rares, qui touchent collectivement 300 millions de personnes dans le monde 1,2. Il n’existe actuellement aucun traitement curatif approuvé pour la majorité de ces maladies rares très débilitantes 1,2,3. Cependant, les troubles monogéniques sont des candidats idéaux pour les thérapies géniques qui peuvent remplacer, compléter, corriger ou réduire au silence les gènes dysfonctionnels 4,5. À l’heure actuelle, de multiples vecteurs sont mis au point et utilisés pour administrer des thérapies géniques à des types de cellules spécifiques 4,6. L’un de ces vecteurs est le virus adéno-associé (AAV). L’AAV est un parvovirus non pathogène qui est de plus en plus utilisé comme vecteur de thérapie génique7. Comparé à d’autres vecteurs viraux, l’AAV a une immunogénicité plus faible, un potentiel d’intégration plus faible dans le génome de l’hôte et la capacité de transduire efficacement les cellules en division et non divisées dans divers tissus 7,8. De plus, de multiples approches ont été développées pour concevoir et identifier des AAV présentant des caractéristiques souhaitables telles qu’un tropisme tissulaire spécifique ou une immunogénicité encore réduite, ce qui améliore considérablement la polyvalence des AAV en tant que vecteur viral pour différentes indications9. Ces facteurs ont fait de l’AAV un vecteur de thérapie génique largement étudié et ont conduit au développement de plusieurs thérapies géniques à base d’AAV approuvées par la FDA10.
Les modèles murins sont couramment utilisés pour tester des thérapies géniques potentielles in vivo et mieux comprendre les mécanismes pathologiques des maladies monogéniques. Cela est dû à la récapitulation par les modèles murins des pathologies de différentes conditions, à la similitude de leur génome avec le génome humain et à la facilité relative de manipulation, d’entretien et de génération de souris 11,12,13. Les tests in vivo sont particulièrement importants lorsqu’il s’agit d’étudier des troubles qui affectent plusieurs systèmes ou régions du corps, tels que les dystrophies musculaires. Pour ces troubles, les tests in vitro peuvent ne pas être suffisants pour évaluer de manière exhaustive l’innocuité, l’efficacité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique des traitements destinés à atteindre différentes régions du corps après une administration systémique14.
Diverses voies d’administration systémique peuvent être utilisées pour administrer des médicaments. Chaque voie a ses avantages, ses inconvénients et son degré de compatibilité avec le modèle animal et le médicament étudiés15. L’injection intraveineuse latérale (IV) dans la veine caudale est une voie couramment utilisée pour l’administration systémique d’AAV chez la souris16. Les injections latérales de la veine caudale permettent une administration rapide et directe de l’injectat dans la circulation sanguine de la souris, assurant une biodisponibilité élevée du médicament dans la circulation systémique17. Ils nécessitent également des outils relativement simples et couramment disponibles pour être exécutés. Cependant, principalement en raison du petit diamètre de la veine de la queue et de la difficulté à localiser la veine, les injections latérales de la veine de la queue sont techniquement difficiles et nécessitent un haut degré de compétence et une pratique constante pour éviter les tentatives d’injection ratées ou l’administration incomplète de la dose 16,17,18,19. Ceux-ci peuvent entraîner la perte de réactifs coûteux ou des résultats imprécis, surtout si l’injection incomplète n’est pas reconnue lors de l’injection. Notre expérience résumée ici est basée sur des protocoles rapportés dans des articles bien documentés que nous avons adaptés à notre usage, en optimisant les différentes étapes de la procédure d’injection latérale de la veine caudale pour assurer des injections toujours réussies 20,21,22,23,24,25,26,27.
Ici, nous décrivons ce protocole d’injection latérale optimisé et détaillé de la veine caudale pour administrer de l’AAV à des souris non sédatives âgées de 7 à 9 semaines à l’aide d’outils simples et couramment disponibles. De plus, nous fournissons les protocoles pour les méthodes utilisées pour évaluer l’administration et la biodistribution des AAV. Ces protocoles couvrent la collecte de tissus post-injection, la fixation tissulaire, l’extraction de l’ADN et la quantification du génome du vecteur par génome diploïde (vg/dg) par réaction en chaîne par polymérase numérique (dPCR). Le protocole d’injection IV et les conseils fournis ici visent à améliorer la facilité d’effectuer avec succès des injections latérales de la veine caudale. Cela pourrait aider à réduire le temps nécessaire pour maîtriser les compétences d’injection tout en améliorant simultanément la précision et la cohérence des injections.

<table><tbody><tr><td>0,22 et micro ; Filtre à seringue</td><td>Millipore</td><td>SLGVM33RS</td><td></td></tr><tr><td>seringues à insuline de 0,3 mL avec aiguille 29G</td><td>BD Biosciences</td><td>324702</td><td></td></tr><tr><td>microcentrifugeuse de 1,7 mL Crystalgen</td><td></td><td>23-2051</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 10 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>100 % EtOH</td><td>The Warner Graham Company</td><td>201096</td><td></td></tr><tr><td>10x tamponné au phosphate solution saline (PBS)</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td>Utilisé pour préparer 1x PBS pour la fixation tissulaire</td></tr><tr><td>Tube conique</td><td>Corning</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Porte-tube conique 15 mL</td><td>Sources multiples</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>190 alcool éthylique à l’épreuve The</td><td>Warner Graham Company</td><td>6810-01-113-7320</td><td>Utilisé pour préparer de l’éthanol à 70 %</td></tr><tr><td>1x stérile PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de stockage de tissus de microcentrifugeuse de 2 ml</td><td>Eppendorf</td><td>022363344</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldéhyde à 4 % (PFA)</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>157-4</td><td></td></tr><tr><td>Virus adéno-associé (AAV)</td><td>Charles River</td><td>N/A</td><td>ADN simple brin (ADNsb) AAV a été emballé pour délivrer la recombinase Cre en tant que transgène entraîné par le promoteur du CMV</td></tr><tr><td>Écouvillon d’alcool</td><td>BD Biosciences</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>Tube de lyse de billes</td><td>Next Advance</td><td>GREENE5</td><td></td></tr><tr><td>BsuRI (HaeIII)</td><td>enzyme de restriction Thermo Fisher Scientific</td><td>ER0151&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Mélangeur de balles</td><td>Next Advance</td><td>BBX24B</td><td></td></tr><tr><td>Souris dérivées d’Ai14 de la souche JAX 007914 (patrimoine génétique : C57BL/6J)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Des souris contenant l’allèle Ai14 Cre-reporter ont été achetées auprès de JAX (numéro de catalogue : 007914)</td></tr><tr><td>Coussinets absorbants jetables</td><td>Fisherbrand</td><td>1420662</td><td></td></tr><tr><td>Pince à dissection</td><td>Fine Science Tools (F.S.T)</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux de dissection</td><td>Outils de science fine (F.S.T)</td><td>14085-08</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de dégradation de l’ADN (DNAZap)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9890</td><td></td></tr><tr><td>Extraction de l’ADN RNase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td>Pour la digestion de l’ARN pendant l’extraction d’acide nucléique</td></tr><tr><td>RNase sans DNase pour le nettoyage de l’ADN</td><td>&nbsp ;F. Hoffmann-La Roche</td><td>11119915001</td><td>Pour la digestion de l’ARN après acide nucléique sonde</td></tr><tr><td>dPCR d’extraction Kit PCR</td><td>Qiagen</td><td>250102</td><td></td></tr><tr><td>logiciel dPCR</td><td>Qiagen&nbsp ;</td><td>N/A&nbsp ;</td><td>Suite logicielle QIAcuity&nbsp ;</td></tr><tr><td>Plate-forme surélevée Sources</td><td>multiples</td><td>N/A</td><td>Une boîte vide d’embouts de pipette a été utilisée pour élever la retenue de la souris pendant le réchauffement de la queue</td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence Sources</td><td>multiples</td><td>N/A</td><td>Modèle utilisé ici : Logiciel de</td></tr> microscope à fluorescence Nikon Eclipse Ti<tr><td>&nbsp ;</td><td>Sources multiples&nbsp ;</td><td>N/A&nbsp ;</td><td>Logiciel utilisé ici : NIS-Elements&nbsp ;</td></tr><tr><td>Gaze</td><td>Covidien</td><td>9022</td><td></td></tr><tr><td>Bloc chauffant</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer 5350</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse à grande vitesse</td><td>Eppendorf</td><td>22620689</td><td></td></tr><tr><td>Récipient métallique</td><td>Vollrath</td><td>80125</td><td></td></tr><tr><td>Méthylbutane</td><td>J.T. Baker</td><td>Q223-08</td><td></td></tr><tr><td>Qualité de l’eau de qualité moléculaire</td><td>Biologique</td><td>351-029-131</td><td></td></tr><tr><td>Dispositif de contention de tube de souris</td><td>Braintree Scientific</td><td>TV-RED-150-STD</td><td></td></tr><tr><td>Mini centrifugeuse Myfuge</td><td>Benchmark Scientific</td><td>C1012</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycleur à réaction en chaîne par polymérase</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1851148</td><td>Modèle : C1000</td></tr><tr><td>Touch Lingettes de précision</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>7552</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Qiagen</td><td>19131</td><td></td></tr><tr><td>QIAcuity dPCR Nanoplate 26k 24 puits</td><td>Qiagen</td><td>250001</td><td></td></tr><tr><td>QIAcuity One système dPCR</td><td>Qiagen</td><td>911020</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen DNeasy Blood & Kit de tissus</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>Utilisé pour l’extraction d’ADN à partir de tissus</td></tr><tr><td>Qiagen QIAamp DNA Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td>Utilisé pour le nettoyage de l’ADN génomique et l’isolement de l’ADN à partir de petits volumes de sang prtocotol a été utilisé pour l’extraction d’ADN à partir de cellules triées par FACS</td></tr><tr><td>Cône de retenue de rongeurs</td><td>Braintree Scientific</td><td>MDC-200</td><td></td></tr><tr><td>Scale</td><td>Ohaus</td><td>72212663</td><td></td></tr><tr><td>Boîte en polystyrène</td><td>Sources multiples</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Nettoyant et désinfectant de surface</td><td>Peroxigard</td><td>29101&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Minuterie</td><td>Sources multiples</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pince de transfert</td><td>Outils de sciences fines (F.S.T)</td><td>91113-10</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Daigger & Entreprise</td><td>22220A</td><td>Modèle : Daigger Vortex Genie 2</td></tr></tbody></table>

administration constante du virus adéno-associé par injection latérale dans la veine caudale chez des souris adultes

Consistent Delivery of Adeno-Associated Virus via Lateral Tail-Vein Injection in Adult Mice

De nombreux troubles affectent plusieurs organes ou impliquent différentes régions du corps, il est donc essentiel d’administrer des traitements de manière systémique pour cibler les cellules affectées situées dans différents sites. L’injection intraveineuse est une voie d’administration systémique largement utilisée dans les études précliniques qui évaluent les traitements destinés à une administration à l’échelle du corps. Chez les souris adultes, il implique l’administration intraveineuse de l’agent thérapeutique dans les veines latérales de la queue de la souris. Lorsqu’elles sont maîtrisées, les injections de la veine caudale sont sûres et rapides, et ne nécessitent que des outils simples et couramment disponibles. Cependant, les injections de la veine caudale sont techniquement difficiles et nécessitent une formation approfondie et une pratique continue pour assurer l’administration précise de la dose prévue.
Nous décrivons ici un protocole d’injection latérale de la veine caudale détaillé et optimisé que nous avons développé sur la base de notre expérience et des recommandations qui avaient déjà été rapportées par d’autres groupes. Outre les dispositifs de contention pour souris et les seringues à insuline, ce protocole ne nécessite que des réactifs et du matériel facilement disponibles dans la plupart des laboratoires. Nous avons constaté que le respect de ce protocole permet une administration intraveineuse réussie et constante du virus adéno-associé (AAV) dans les veines de la queue de souris âgées de 7 à 9 semaines non sédatives. De plus, nous décrivons les protocoles optimisés pour la détection histologique des protéines rapporteures fluorescentes et la quantification du génome du vecteur par génome diploïde (vg/dg) utilisés pour évaluer la transduction et la biodistribution des AAV. L’objectif de ce protocole est d’aider les expérimentateurs à effectuer facilement des injections de la veine caudale avec succès et cohérence, ce qui peut réduire le temps de pratique nécessaire pour maîtriser la technique.

Des souris mâles âgées de sept à neuf semaines ont reçu une injection d’AAV par injection latérale dans la veine de la queue à 1,5 × 1012 vg par souris dans un volume d’injection de 150 à 200 μL. L’AAV ssDNA utilisé ici a délivré le transgène Cre recombinase piloté par le promoteur CMV. Les souris injectées étaient homozygotes pour l’allèle Cre reporter Ai14. Lorsqu’elles sont exposées à la recombinase Cre, les cellules contenant l’allèle Ai14 expriment la protéine fluorescente tdTomato. Étant donné que l’expression de tdTomato est causée par la recombinaison génomique induite par Cre, les cellules exprimant tdTomato indiquent des cellules qui ont été soit directement transduites par l’AAV, soit étaient des cellules de descendance de cellules transduites. Les données présentées ici concernent des souris auxquelles on a injecté de l’AAV9-CMV-Cre à 1,5 × 1012 vg/souris administrées dans 160 μL (5,8-5,9 × 1013 vg/kg). Les souris ont été sacrifiées 28 jours après l’injection, et les tissus ont été prélevés comme décrit ci-dessus. Quelques muscles squelettiques et lobes hépatiques ont été digérés, et leurs cellules ont été collectées à l’aide de FACS. Quelques lobes du foie ont été congelés immédiatement à l’aide de méthylbutane prérefroidi pour l’extraction des acides nucléiques. Quelques muscles squelettiques et lobes hépatiques ont été congelés pour l’imagerie histologique de la tomate td fluorescente. tdTomato a été exprimé de manière diffuse dans le foie (figure 2A) et le quadriceps (figure 2C), ce qui indique que l’AAV9 a largement atteint et transduit différentes régions des deux tissus.
L’ADN extrait de foie fraîchement congelé et de cellules triées par FACS a été utilisé pour quantifier vg/dg à l’aide de la dPCR. La quantification Vg/dg peut être utilisée pour évaluer la cohérence de l’injection et l’efficacité de transduction de l’AAV dans l’échantillon analysé. Les diagrammes de dispersion des gouttelettes 1D de l’échantillon de tissu hépatique fraîchement congelé et des cellules triées par FACS ont été utilisés pour garantir la validité du test (figures 3A, C). Le nuage de points a montré la présence de partitions positives et négatives, une séparation claire entre les partitions positives et négatives qui permet une détermination précise du seuil de détection, et la présence de gouttelettes peu ou pas nombreuses entre les partitions positives et négatives, ce qui peut réduire la précision du test dPCR. Le fait de répondre à tous ces critères indiquait que les résultats de l’essai dPCR étaient valides. Le nombre de copies du gène Polr2a dans chaque échantillon a été quantifié pour déterminer le nombre de génomes diploïdes de souris (2 copies du gène Polr2a/génome diploïde de souris), et des amorces/sondes contre la séquence du transgène de la recombinase Cre ont été utilisées pour quantifier le génome viral (1 copie de transgène/génome viral, tableau 1). La valeur vg/dg a été quantifiée pour l’échantillon de tissu hépatique fraîchement congelé et les cellules triées par FACS et a montré la présence de 187,7 vg/dg et 4,7 vg/dg dans chaque échantillon, respectivement (figures 3B,D). Des échantillons de souris injectées de PBS et de témoins non matriciels ne contenant pas d’acides nucléiques ont été utilisés comme témoins négatifs.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66934/66934fig01.jpg"> Figure 1 : Vue d’ensemble de la station d’injection intraveineuse. (A) Outils nécessaires pour effectuer l’injection IV. On y voit (1) la minuterie, (2) le dispositif de retenue du tube de souris, (3) les cônes de retenue en plastique non coupés et (4) coupés, (5) le tampon d’alcool, (6) la boîte d’embouts de pipette vide utilisée comme plate-forme pour élever le dispositif de retenue du tube de souris, (7) les tampons absorbants jetables, (8) le tube conique de 15 ml avec de l’eau chaude, (9) le porte-tube de 15 ml, (10) la gaze et (11) la seringue à insuline. (B) La souris est d’abord placée à l’intérieur du tube de retenue. Ensuite, le cône de retenue coupé est inséré pour créer un manchon de retenue autour de la souris, si la souris est trop petite pour être retenue par le tube de retenue uniquement. Assurez-vous que la respiration de la souris n’est pas obstruée par les dispositifs de contention. Le tube de retenue est placé sur le dessus de la plate-forme surélevée pour permettre le placement de la queue de souris dans de l’eau chaude. (C) Positionnement de la queue de souris et angle de maintien de l’aiguille immédiatement avant d’effectuer l’injection. Tirez sur la queue pour que la queue soit étirée et que le site d’injection soit complètement horizontal. L’aiguille est parallèle à la queue et à la veine, et le biseau est tourné vers le haut. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66934/66934fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66934/66934fig02.jpg"> Figure 2 : Détection de la protéine rapporteure fluorescente après l’injection IV. Des souris mâles âgées de sept à neuf semaines hébergeant l’allèle rapporteur Cre Ai14 ont reçu par voie intraveineuse soit AAV9-CMV-Cre à 1,5 × 1012 vg/souris administrées dans 160 μL (5,8-5,9 × 1013 vg/kg) ou PBS. Images représentatives de fluorescence de coupes du foie (A) ou du quadriceps (C) de souris après l’injection de Cre IV par AAV9. (B) Des coupes du foie ou (D) du quadriceps de souris injectées de PBS ont été imagées pour servir de témoins négatifs. Les tissus ont été prélevés et congelés 28 jours après l’injection IV. Après l’exposition Cre, la protéine tdTomato fluorescente est exprimée dans les cellules transduites et les cellules de descendance des cellules transduites. Des coupes de 10 μm d’épaisseur ont été imagées à un grossissement de 10x. Barres d’échelle = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66934/66934fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66934/66934fig03.jpg"> Figure 3 : Quantification du génome du vecteur par génome diploïde (vg/dg). Nuage de points 1D de la quantification des génomes des vecteurs dPCR dans (A) le tissu hépatique ou (C) les cellules triées par FACS prélevées sur des souris injectées avec AAV9-CMV-Cre ou PBS. Les nuages de points montrent les partitions dPCR positives et négatives, ainsi que le seuil de détection indiqué par la ligne horizontale traversant les échantillons. Quantification (B,D) vg/dg après quantification des génomes diploïdes de souris et des génomes de vecteurs dans le tissu hépatique (B) ou (D) des échantillons de cellules triés par FACS. Les résultats présentés ici proviennent d’une seule souris injectée d’AAV9 et d’une seule souris injectée de PBS avec un duplicata technique dPCR pour chaque souris. Les barres d’erreur indiquent l’intervalle de confiance à 95 % pour chaque échantillon. Abréviations : NTC = Non-template control ; dPCR = PCR numérique ; FACS = tri cellulaire activé par fluorescence. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66934/66934fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Amorce</td>
			<td>Séquence</td>
		</tr><tr><td>Cre apprêt avant</td>
			<td>CTGACGGTGGGAGAATGTTAAT</td>
		</tr><tr><td>Apprêt inversé Cre</td>
			<td>CATCGCTCGACCAGTTTAGTT</td>
		</tr><tr><td>Sonde Cre </td>
			<td>/56-FAM/CGCAGGTGT/ZEN/AGAGAAGGCACTTAGC/3IABkFQ/</td>
		</tr><tr><td>Apprêt avant Polr2a </td>
			<td>GACTCCTTCACTCACTGTCTTC</td>
		</tr><tr><td>Amorce inversée Polr2a </td>
			<td>TCTTGCTAGGCAGTCCATTATC</td>
		</tr><tr><td>Sonde Polr2a </td>
			<td>/5HEX/ACGAGATGC/ZEN/TGAAAGAGCCAAGGT/3IABkFQ/</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Séquences d’amorces et de sondes utilisées pour la quantification vg/dg. Des amorces et une sonde Cre ont été utilisées pour quantifier le génome du vecteur. Des amorces et une sonde Polr2a ont été utilisées pour quantifier le génome diploïde de la souris.

Nous détaillons ici un protocole optimisé pour l’injection latérale de la veine caudale chez la souris afin d’administrer systématiquement le virus adéno-associé (AAV) chez les souris adultes. De plus, nous décrivons les protocoles des tests couramment utilisés pour évaluer la transduction des AAV.

Administration constante du virus adéno-associé par injection latérale dans la veine caudale chez des souris adultes

Many disorders affect multiple organs or involve different regions of the body, so it is critical to deliver therapeutics systemically to target the ...

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Recherche

JoVE Journal

Medicine

Médecine

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Apprenez l'injection latérale dans la veine caudale chez la souris adulte pour administrer l'AAV en thérapie génique. Cette méthode optimise la transduction virale systémique et améliore la reproductibilité des expériences.

Administration constante du virus adéno-associé par injection latérale dans la veine caudale chez des souris adultes

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