Name: Extraction d’ARN sur un seul animal et sur un seul tube pour la comparaison des niveaux relatifs de transcrits par qRT-PCR chez le tardigrade Hypsibius exemplaris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Découvrez une méthode rapide d'extraction d'ARN chez Hypsibius exemplaris pour l'analyse d'expression génique par qRT-PCR. Cette technique améliore l'efficacité de 200 fois et réduit le temps de 30%.

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<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66935/66935fig01.jpg"> 
Figure 1 : Pipeline monotube pour l’extraction d’ARN à partir d’un seul tardigrade. (A) Schéma montrant le protocole d’extraction d’ARN à partir d’un seul tardigrade, y compris six cycles de congélation-décongélation et la synthèse ultérieure de l’ADNc. Les échantillons peuvent ensuite être utilisés pour la RT-PCR et la qRT-PCR. (B) Image du cône de la micropipette utilisé pour l’élimination de l’eau. Barre d’échelle : 2 mm. (C) Image en fond clair d’un tardigrade dans un petit volume d’eau (ligne pointillée). L’élimination de la majeure partie de l’eau dans la mesure indiquée est nécessaire pour une extraction réussie et empêche la dilution du tampon de lyse. Barre d’échelle : 50 μm. (D) Image montrant l’immersion d’échantillons dans de l’azote liquide à l’aide de longues pinces pour geler-décongeler rapidement les échantillons en toute sécurité. Une partie du contenu a été créée dans BioRender. Kirk, M. (2022) BioRender.com/d93s511 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66935/66935fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
REMARQUE : La figure 1A montre un schéma de la procédure. Pour des procédures détaillées d’élevage de tardigrades et d’algues, veuillez consulter les rapports45, 46 et 47 publiés précédemment.
1. Stérilisation de l’eau de source
<ol>
	<li>Versez 2 L d’eau de source d’une cruche d’eau de 5 gallons (voir le tableau des matériaux pour plus de détails) dans une bouteille en verre de 2 L sans danger pour l’autoclave.</li>
	<li>Placez le bouchon sur la bouteille sans danger pour l’autoclave et fermez-la avec une petite quantité de ruban adhésif pour autoclave. Ne serrez pas la bouteille ; Placez le capuchon sur le dessus.</li>
	<li>Autoclavez l’eau de source pendant 50 min sur un cycle humide sans étape de séchage.</li>
	<li>Laissez l’eau revenir à température ambiante (RT) et fermez fermement le bouchon avant de le ranger à RT.</li>
</ol>
2. Tirage de micropipettes en verre (avec un extracteur de pipette)
<ol>
	<li>Fixez une micropipette en verre (D.E. : 1 mm, D.I. : 0,58 mm, Longueur : 10 cm) sur un extracteur de micropipette. Évitez tout contact avec le filament chauffant, car cela modifierait la forme de la pipette et endommagerait le filament.<ol>
		<li>Déterminez empiriquement le tirage de la pipette pour chaque filament et extracteur de pipette. Cependant, pour servir de point de départ à l’optimisation, utilisez 78 °C et un seul pas de traction d’un poids de traction de 182,2 g.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Laissez le filament chauffer et la gravité pour séparer la micropipette en verre en deux micropipettes en verre avec des pointes acérées (Figure 1B).</li>
	<li>Rangez ces micropipettes en verre tiré dans une boîte de Pétri fermée de 100 mm avec de la cire ou de l’argile pour les maintenir en place et éviter que les pointes pointues ne se cassent.</li>
</ol>
3. Tirage de micropipettes en verre (sans extracteur de pipette)
<ol>
	<li>Allumez un bec Bunsen ou une autre source de flamme contrôlée à basse température.</li>
	<li>Prenez une micropipette en verre avec une extrémité dans chaque main.</li>
	<li>Maintenez le centre de la micropipette en verre au-dessus de la flamme jusqu’à ce que le verre commence à fondre. Ensuite, séparez rapidement les deux extrémités. Cela créera deux pointes acérées très délicates.</li>
	<li>Cassez légèrement la pointe à l’aide d’une paire de pinces fines stériles.</li>
	<li>Rangez ces micropipettes en verre tiré dans une boîte de Pétri fermée de 100 mm avec de la cire ou de l’argile pour les maintenir en place et éviter que les pointes pointues ne se cassent.</li>
</ol>
4. Extraction de l’ARN
<ol>
	<li>Obtenez 0,5 L d’azote liquide dans un récipient cryo-safe. ATTENTION : L’azote liquide est cryogénique et peut provoquer des brûlures s’il est exposé à la peau ou aux yeux. Lors de la manipulation, utilisez des vêtements de protection, des lunettes anti-éclaboussures, des gants en nitrile, des cryogants, une blouse de laboratoire et des chaussures fermées. Assurez-vous que le récipient est sans danger pour l’azote liquide avant de transporter le liquide. L’utilisation d’un bain d’éthanol-glace carbonique pour cette étape peut également être possible.</li>
	<li>Préparez un mélange maître de synthèse d’ADNc : une solution de 10 μL contenant 1 μL d’amorce hexamère aléatoire, 2 μL de DNase, 4 μL de tampon 5x RT, 1 μL de mélange enzymatique, 1 μL de H2O et 1 μL de 10 mM de dNTP Conservez cette solution sur de la glace.</li>
	<li>Préparez un tampon de lyse tardigrade (5 mM de Tris (pH = 8), 0,5 % (v/v) Détergent 1, 0,5 % (v/v) Détergent 2, 0,25 mM d’EDTA dans de l’eau stérile sans nucléases). REMARQUE : Cette solution peut être conservée sur la paillasse pendant 6 mois. Cependant, maintenez la stérilité et évitez les sources potentielles de contamination de l’ARNase.</li>
	<li>Aliquote suffisamment de tampon de lyse pour les extractions (2 μL/ tardigrade).</li>
	<li>Ajouter l’inhibiteur de l’ARNase à la solution tampon de lyse tardive jusqu’à une concentration finale de 4 U/μL.</li>
	<li>Vortex et rotation de la solution à RT sur une centrifugeuse de paillasse à une vitesse de 2000 x g pendant 5 s avant de stocker la solution sur de la glace.</li>
	<li>Retirer de la culture autant de tardigrades que nécessaire pour l’expérience à l’aide d’une pipette P1000 à pointe filtrante stérile et les placer dans une boîte de Pétri stérile de 35 mm. REMARQUE : N’importe quel nombre de tardigrades peut être traité de cette manière. Habituellement, trois tardigrades par condition sont traités pour l’extraction.</li>
	<li>Lavez les tardigrades trois fois, à l’aide de 1 ml d’eau de source stérile autoclavée et d’une pipette P1000 stérile à pointe filtrante. Les pipeter lentement de haut en bas permet d’éliminer les contaminants d’algues.</li>
	<li>À l’aide d’un microscope de dissection à un grossissement de 25x à 50x, transférez un seul tardigrade de cette culture lavée dans une nouvelle boîte de Pétri stérile de 35 mm à l’aide d’une pipette P10 à pointe filtrante stérile.</li>
	<li>À l’aide d’une pipette P200 à pointe filtrante stérile, lavez le tardigrade unique dans 100 μL d’eau stérile sans nucléases. REMARQUE : Cette étape de lavage est utilisée pour éliminer davantage les contaminants, y compris les ribonucléases.</li>
	<li>Transférez le tardigrade lavé au fond d’un tube PCR propre et stérile dans 1 à 2 μL d’eau stérile sans nucléase à l’aide d’une pipette P10 stérile à pointe filtrante, en veillant soigneusement à ce que le tardigrade ne colle pas au côté de la pointe.</li>
	<li>Visualisez le tardigrade sous un microscope de dissection à un grossissement de 25x.</li>
	<li>Pour faciliter l’évacuation de l’eau par l’eau, cassez légèrement l’extrémité de la micropipette en verre tirée à l’extérieur du tube. Assurez-vous que le forage est assez grand pour tirer l’eau mais pas le tardigrade.</li>
	<li>À l’aide de l’action capillaire d’une micropipette en verre tiré, prélever l’eau jusqu’à ce que l’animal soit entouré d’une petite bulle d’eau d’environ deux longueurs de tardigrade de diamètre.</li>
	<li>Surveillez le processus d’élimination de l’eau à l’aide de la lunette de dissection pour vous assurer que le niveau d’eau est approprié et que le tardigrade reste hydraté. REMARQUE : La figure 1C offre un exemple de la quantité d’eau à évacuer. Il s’agit d’une étape cruciale. Une petite bulle d’eau entourera le tardigrade pour l’empêcher de se dessécher, mais il faut éliminer autant d’eau que possible pour éviter la dilution du tampon de lyse. Pour un exemple des niveaux d’eau restants, veuillez vous référer à la figure 1C.</li>
	<li>Immédiatement après avoir retiré l’eau, ajouter 2 μL de tampon de lyse tardigrade au fond du tube, agiter brièvement le vortex et centrifuger le tube à RT pendant 5 s à 2000 x g sur une centrifugeuse de table.</li>
	<li>Placez immédiatement les échantillons contenant les tardigrades dans un support de tube PCR et assurez-vous qu’ils sont bien maintenus par le support.</li>
	<li>Saisissez le support à l’aide d’une paire de longues pinces grossières et trempez doucement le support contenant les échantillons dans l’azote liquide jusqu’à ce qu’il soit complètement congelé (figure 1D).</li>
	<li>Retirez la grille de l’azote liquide et placez-la immédiatement sur de la glace. Laisser décongeler l’échantillon (prendre ~45 s à 1 min). Surveillez l’échantillon toutes les 15 s en le retirant de la glace et en l’inspectant visiblement. Une fois que l’échantillon est visiblement transparent, passez à l’étape suivante.</li>
	<li>Répétez les étapes 4.18-4.19 cinq fois de plus. Au total, six cycles de gel-dégel sont nécessaires pour maximiser la lyse et l’extraction (figures 2A, B).</li>
	<li>Une fois la congélation-décongélation terminée, placez les échantillons sur de la glace et passez immédiatement à l’étape suivante. Ne congelez pas les échantillons à ce stade pour les stocker, car cela diminuerait l’ARN disponible pour la préparation de l’ADNc.</li>
</ol>
5. Synthèse de l’ADNc
<ol>
	<li>Ajouter 2 μL de mélange maître de synthèse d’ADNc dans le tube PCR contenant du lysat de tardigrade. Agitez brièvement le tube et faites-le tourner à RT à 2000 x g pendant 5 s avec une centrifugeuse de table avant de replacer les échantillons sur de la glace.</li>
	<li>Placez les échantillons dans un thermocycleur et incubez à 25 °C pendant 10 min pour obtenir des amorces de recuit, à 55 °C pendant 30 min pour effectuer une transcription inverse, et enfin, inactivez thermiquement les enzymes à 85 °C pendant 5 min.</li>
	<li>Après l’incubation, placez immédiatement le tube sur de la glace et diluez l’échantillon jusqu’à un volume total de 25 μL en ajoutant 21 μL d’eau stérile sans nucléases. Pour les transcrits à faible nombre de copies, modifier cette étape de dilution telle qu’elle est déterminée empiriquement.</li>
</ol>
6. qPCR
<ol>
	<li>Déterminer la température de recuit de l’ensemble d’amorces à l’aide de l’ARN total préparé à partir de grandes quantités de tardigrades, par exemple, la méthode d’extraction en vrac présentée dans Boothby, 201843.</li>
	<li>Exécutez un gradient de température PCR pour déterminer la température de recuit optimale avant d’exécuter qRT-PCR (pour tous les paramètres PCR utilisés dans ce protocole, reportez-vous au Tableau 1 et au Tableau 2).</li>
	<li>Décongelez un tube de super mélange de colorant indicateur sur de la glace et isolez-le de la lumière. Placez une plaque de qPCR de 96 puits sur de la glace et placez 5 μL de super mélange, 2 μL d’eau, 1 μL de chaque amorce (10 μM) et 1 μL de produit d’ADNc dans le nombre de puits souhaité.</li>
	<li>Scellez la plaque de PCR avec le sceau de plaque et exécutez la qRT-PCR en utilisant une température de recuit appropriée pour le jeu d’amorces (pour tous les paramètres de qRT-PCR utilisés dans cet article, reportez-vous au tableau 3).</li>
</ol>
7. Quantification et interprétation des résultats
<ol>
	<li>Comparer quantitativement les résultats à un ou plusieurs gènes de contrôle ménager, dont l’expression est censée être constante dans les conditions imposées. Pour cette étude, le gène de l’actine a été utilisé.</li>
	<li>Obtenez et comparez les valeurst C ou le seuil de cycle pour chaque puits aux valeurs Ct des réactions géniques de contrôle de l’entretien. Calculez le changement de pli dans l’expression des gènes à l’aide de l’équation suivante : 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66935/66935eq01.jpg" style="margin: auto;"> 
	<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66935/66935eq02.jpg" style="margin: auto;"> 
	<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/66935/66935eq03.jpg" style="margin: auto;"> REMARQUE : L’expression du gène de pliage est tracée pour chaque transcrit et tardigrade sous la forme d’un 2-(ΔΔCt)48.</li>
	<li>Pour obtenir une estimation approximative du nombre de transcrits à partir de la valeurt C, utilisez l’équation suivante : 
	<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/66935/66935eq04.jpg" style="margin: auto;"> Où N est le nombre de transcrits et 2 est l’efficacité présumée de la PCR ou l’augmentation de la fluorescence par cycle de la PCR48.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Extraction optimisée de l’ARN pour la qRT-PCR dans des tardigrades individuels

<table><tbody><tr><td>10 et micro ; L Premium Barrier Tips à liaison basse, en rack, stérile</td><td>Genesee Scientific</td><td>23-401</td><td>Pipette P 10 à pointe de filtre stérile&nbsp ; Pointes</td></tr><tr><td>1000 & micro ; L&nbsp ; Pointes de pipette haut de gamme, à faible liaison, en rack, stériles</td><td>Genesee Scientific</td><td>23-165RS</td><td>Pipette P 1000 stérile à pointe de filtre&nbsp ; Pointes</td></tr><tr><td>200 & micro ; L&nbsp ; Pointes barrières de qualité supérieure à faible liaison, en rack, stérile</td><td>Genesee Scientific</td><td>23-412</td><td>Appelée pipette P 200 à pointe de filtre stérile&nbsp ; Pointes</td></tr><tr><td>4 étoiles droite forte pointe moyenne pince à épiler&nbsp ;</td><td>Excelta&nbsp ;</td><td>00-SA-DC</td><td>Appelé pince longue</td></tr><tr><td>Rack PCR 96 puits avec couvercle assorti, 5 racks/unité</td><td>Genesee Scientific</td><td>27-202A</td><td>Désigné Rack PCR</td></tr><tr><td>Andwin Scientific&nbsp ; RUBAN AUTOCLAVE SANS PLOMB 3M 1"</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>NC0802040</td><td>Appelé ruban autoclave.</td></tr><tr><td>Ruban autoclave</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB1170</td> Désigné <td>par PCR Plate Seals</td></tr><tr><td>Benchling v8</td><td>Benchling</td><td>N/A</td><td>Désigné par Benchling&nbsp ;</td></tr><tr><td>BioRadHard-Shell Plaque PCR 96 puits</td><td>BioRad&nbsp ;</td><td>HSS9641</td><td>Plaque PCR</td></tr><tr><td>Blouse de laboratoire BULWARK FR :&nbsp ;</td><td>Grainger&nbsp ;</td><td>26CF64</td><td>Désigné sous le nom de Lab Coat</td></tr><tr><td>C1000 Touch Bio-rad Thermocycleur&nbsp ;</td><td>BioRad</td><td>1851148</td><td>dénommé thermocycleur&nbsp ;</td></tr><tr><td>Thermocycleur C1000 Touch Bio-rad avec module optique CFX&nbsp ;</td><td>BioRad</td><td>1845097</td><td>Désigné sous le nom de thermocycleur qPCR&nbsp ;</td></tr><tr><td>Chloroccoccum hypnosporum.&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Carolina</td><td>152091</td><td>désignée sous le nom d’Algae</td></tr><tr><td>Corning&nbsp ; PYREX Bouteilles de stockage de supports réutilisables</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>06-414-1E</td><td>Désigné comme 2 L Bouteille en verre sans danger pour l’autoclave</td></tr><tr><td>Daigger & Entreprise Vortex-Genie 2 Mélangeur de laboratoire&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>3030A</td><td>Appelé Vortexer&nbsp ;</td></tr><tr><td>Direct-zol Micro Prep&nbsp ;</td><td>Zymo Research&nbsp ;</td><td>R2060</td><td>Désigné comme kit d’extraction d’ARN°</td></tr><tr><td>Dumont 5 Biologie Pince à épiler</td> Outils <td>de sciences fines&nbsp ;</td><td>11254-20</td><td>Référé Forceps</td></tr><tr><td>Fins EDTA&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500²</td><td>Désigné par le terme EDTA&nbsp ;</td></tr><tr><td>FIDJI v 2.14.0/1.54f&nbsp ;</td><td>ImageJ,N</td><td>/A</td><td>Référencé FIJI/ImageJ</td></tr><tr><td>Filament pour extracteur de pipette&nbsp ;</td><td>Tritech Research</td><td>PC-10H</td><td>Protégé</td></tr> par le Filament <tr><td>Fisherbrand Economy Impact Goggles</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-181-501</td> Protégé par le terme <td>Splash Goggles.</td></tr><tr><td>Micropipette en verre O.D. 1mm ID 0.58, Longueur 10 cm</td><td>TriTech Research</td><td>GD-1&nbsp ;</td><td>Désigné comme micropipette en verre</td></tr><tr><td>Hypsibius exemplaris Z151 Souches&nbsp ;</td><td>Carolina</td><td>133960</td><td>Désigné sous le nom de Tardigrades ou H. exemplaris.</td></tr><tr><td>Azote liquide Dewar 1 L</td><td>Agar Scientific&nbsp ;</td><td>AGB7475</td><td>Désigné comme un conteneur sans danger pour la cryogénie.</td></tr><tr><td>Kit de synthèse d’ADNc Maxima H Minus First Strand&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K1651</td><td>Désigné sous le nom de cDNA Synthesis Master Mix&nbsp ;</td></tr><tr><td>Narishige Extracteur de micropipette en verre à deux étages&nbsp ;</td><td>Tritech Research</td><td>&nbsp ; PC-10</td><td>Appelé extracteur de micropipettes</td></tr><tr><td>Gants en nitrile</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-000-314</td><td>Dénommés Gants en nitrile&nbsp ;</td></tr><tr><td>BOÎTE DE PÉTRI, PS, 35/10 mm, AVEC ÉVENTS</td><td>Grenier</td><td>627102</td><td>Appelée boîte de Pétri de 35 mm&nbsp ;</td></tr><tr><td>PIPETMAN P10, 1&ndash ; 10 et micro ; L, éjecteur métallique</td><td>Gilson</td><td>F144055M</td><td>désigné P 10 Pipette</td></tr><tr><td>PIPETMAN P1000, 100&ndash ; 1000 et micro ; L, éjecteur métallique</td><td>Gilson</td><td>F144059M</td><td>désigné par P 1000 Pipette</td></tr><tr><td>PIPETMAN P200, 20&ndash ; 200 et micro ; L, Éjecteur de métal</td><td>Gilson&nbsp ;</td><td>F144058M</td><td>dénommée P 200</td></tr><tr><td>livre de pipette cette pâte à modeler 4 couleurs.</td><td>Surplus scientifique américain</td><td>&nbsp ; 96517P001</td><td>Désigné par le terme Clay&nbsp ;</td></tr><tr><td>Prisme v10.0</td><td>GraphPad</td><td>n/a</td><td>fait référence à un prisme&nbsp ;</td></tr><tr><td>Sans RNAse, 8 bandelettes de 0,2 mL Tubes PCR avec capuchons&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>AM12230</td><td>désigné sous le nom de tube PCR stérile</td></tr><tr><td>RNasin inhibiteur de ribonucléase</td><td>Promega&nbsp ;</td><td>N2111</td><td>Appelé inhibiteur de l’ARNase.</td></tr><tr><td>Eau de source&nbsp ;</td><td>Nestlé Pure Life</td><td>44221229</td><td>dénommé eau de source</td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td><td>BIO RAD</td><td>1725271</td><td>dénommé colorant indicateur Super mix&nbsp ;</td></tr><tr><td>Système de stéréomicroscope avec optique et éclairage&nbsp ;</td><td>TriTech Research</td><td>SMT1</td><td>est désigné sous le nom de microscope de dissection</td></tr><tr><td>Supertek Scientific&nbsp ; Brûleurs Tirrill</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S09572B</td><td>dénommé bec Bunsen.</td></tr><tr><td>Centrifugeuse de table</td><td>Qualitron</td><td>&nbsp ; DW-41-115-NEW</td><td>Référencé comme centrifugeuse de table&nbsp ;</td></tr><tr><td>Bouclier temporissippi Cryo-Gloves</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-394-305</td><td>Dénommé Cryo Gloves&nbsp ;</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&nbsp ; Boîtes de Pétri Nunc</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-757-099</td><td>Appelée boîte de Pétri de 100 mm&nbsp ;</td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>T395-500&nbsp ;</td><td>Désigné par le terme Tris ou Tris Base.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka&nbsp ;</td><td>93443</td><td>Référencé en tant que détergent 1&nbsp ;</td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma aldrich</td><td>P1379-500&nbsp ;</td><td>Désigné comme détergent 2</td></tr><tr><td>Eau - Cellules de croissance sans nucléases certifiées PCR/RT-PCR</td><td></td><td>PCPW-0500</td>, <td>appelées eau stérile sans nucléases</td></tr></tbody></table>

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