Name: Mesures par microscopie à force atomique du cartilage dans des membres axolotls intacts et en régénération (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Découvrez la microscopie à force atomique pour mesurer les propriétés mécaniques du cartilage d'axolotl en régénération. Cette méthode permet d'étudier les signaux mécaniques guidant la régénération tissulaire.

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<meta charset="utf8"></head><body>Caractérisation mécanique de la rigidité tissulaire lors de la régénération d’un membre axolotl

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</ol>

<table><tbody><tr><td>Affinity Designer</td><td>Affinity</td><td>&nbsp ; version 1.10.4</td><td>Pour l’assemblage de figures</td></tr><tr><td>Agarose Low Melt</td><td>Roth</td><td>6351.1</td><td>Pour la préparation</td></tr><tr><td>d’échantillons Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td>Pour colorer les tissus</td></tr><tr><td>Axiozoom</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Pour imager l’échantillona sous l’AFM</td></tr><tr><td>Benzocaïne</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1501</td><td>Pour anesthésier les animaux</td></tr><tr><td>Butorphanol (+)-tartrate sel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp ; B9156</td><td>Comme analgésique</td></tr><tr><td>Cantilever</td><td>NanoWorld</td><td>Arrow TL1</td><td>Pour les mesures d’indentation AFM</td></tr><tr><td>Configuration Cellhesion 200 équipée d’un étage moteur</td><td>JPK/Bruker</td><td></td><td>Pour les mesures d’indentation AFM</td></tr><tr><td>CellSense Entry</td><td></td><td></td><td>Pour l’imagerie dans le stéréoscope Olympus UC90</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Saline tamponnée au phosphate (DPBS, 1x)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Pour nettoyer les échantillons et la section sous vibratome</td></tr><tr><td>FIJI (ImageJ2)</td><td>https://imagej.net/software/fiji</td><td>version 2.9.0/1.53t</td><td>Pour le traitement d’images</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Software</td><td>(version 8.4.3)</td><td>Pour représenter graphiquement et analyser statistiquement les données</td></tr><tr><td>FBS inactivé par la chaleur</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>Pour cellule milieu de culture</td></tr><tr><td>Colle histoacrylique (2-butyl-cyanoacrylate)</td><td>Braun</td><td></td><td>Pour coller l’échantillon sur des boîtes de Pétri</td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Abcam</td><td>ab228550</td><td>Pour colorer les tissus</td></tr><tr><td>Insuline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5500</td><td>Pour milieu de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Microscope confocal inversé</td><td>Zeiss</td><td>780 LSM</td><td>Pour imager des coupes de tissus</td></tr><tr><td>Microscope confocaux inversé</td><td>Zeiss</td><td>980 LSM</td><td>Pour l’imagerie de coupes de tissus</td></tr><tr><td>Logiciel de traitement de données JPK/</td><td>Bruker JPK/Bruker</td><td>SPM 6.4</td><td>Pour l’analyse des courbes force-distance</td></tr><tr><td>Milieu L15 (Leibovitz)</td><td>Sigma</td><td>L1518</td><td>Pour milieu de culture cellulaire</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td>Pour milieu de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Pour cellule milieu de culture</td></tr><tr><td>billes de polystyrène ( 20 & micro ; m de diamètre) ; )</td><td>microParticles</td><td></td><td>Pour les mesures d’indentation AFM</td></tr><tr><td>Pyjibe</td><td>écrit par Paul M&uuml ; ller https://github.com/AFM-analysis/PyJibe</td><td>0.15.0</td><td>Pour l’analyse viscoélastique</td></tr><tr><td>Stéréoscope Olympus SX10</td><td>Olympus</td><td>SX10</td><td>Pour l’amputation de membres et le montage de tissus</td></tr><tr><td>Stéréoscope Olympus UC90</td><td>Olympus</td><td>UC90</td><td>Pour l’imagerie</td></tr><tr><td>Vibratome Leica</td><td>Leica VT</td><td>1200S</td><td>Pour la coupe de tissus</td></tr></tbody></table>

mesures par microscopie à force atomique du cartilage dans des membres axolotls intacts et en régénération

Atomic Force Microscopy Measurements of Cartilage in Intact and Regenerating Axolotl Limbs

En utilisant le protocole décrit ci-dessus, nous avons mesuré le module de Young apparent des tissus cartilagineux des membres axolotls dans des conditions homéostatiques (« intactes »), au cours de l’histolyse précoce du cartilage et des stades ultérieurs de condensation du cartilage (Figure 1A). Nous avons également sondé les propriétés mécaniques des éléments squelettiques dans différentes régions, y compris leur centre et leur périphérie, comme le montrent les images illustrant la position en porte-à-faux (Figure 1B). Pour montrer l’architecture tissulaire et la corréler avec des mesures de rigidité, des coupes tissulaires transversales ou le bloc tissulaire où les mesures ont été effectuées ont été fixées et colorées pour les filaments d’actine et les noyaux avec la phalloïdine conjuguée Alexa Fluor 488 et Hoechst, respectivement (Figure 1C). Dans les membres intacts, le rayon est nettement plus grand que le cubitus, mais les deux éléments squelettiques cartilagineux ont une morphologie similaire, avec des noyaux ronds uniformément répartis au centre, entourés d’un anneau de noyaux aplatis correspondant au périchondre24. Au cours de la phase d’histolyse, des changements spectaculaires dans l’architecture tissulaire ont été détectés, avec des noyaux désorganisés et moins densément emballés à l’intérieur des éléments squelettiques. Lors de la phase ultérieure de condensation du cartilage, les noyaux se réorganisent, avec une délimitation claire entre le cartilage nouvellement formé et les tissus environnants en régénération. Cependant, à ce stade, la plupart des noyaux sont aplatis et il n’y a pas de différences morphologiques claires entre le centre et la périphérie.
Lorsque des sections transversales des deux éléments squelettiques présents dans la région zeugopodiale (radius et cubitus) ont été mesurées, des modules de Young apparents indiscernables dans les membres intacts ont été détectés, avec des valeurs médianes de 10,95 ± 11,69 kPa et de 15,71 ± 6,49 kPa, respectivement (Figure 2D, à gauche), ce qui correspond à leurs similitudes anatomiques (Figure 1C). Il est intéressant de noter que l’analyse du centre du cartilage par rapport à la périphérie a montré que, dans des conditions intactes, les modules de Young apparents au centre étaient plus élevés qu’à la périphérie, avec des valeurs médianes de 16,48 ± 6,86 kPa contre 7,53 ± 4,63 kPa, respectivement (Figure 2E, à gauche). Le jour 5 après l’amputation, correspondant à la phase d’histolyse, les modules de Young apparents dans le radius et le cubitus ont considérablement diminué (0,03 ± 0,02 kPa et 0,13 ± 0,09 kPa, respectivement, Figure 2D, à droite), mais les différences entre le centre et la périphérie ont également disparu, avec des modules de Young médians de 0,11 ± 0,07 kPa et 0,27 ± 0,34 kPa, respectivement (Figure 2E, à droite). Lors de l’analyse des propriétés du cartilage au cours d’une étape ultérieure de régénération, au moment où le cartilage commence à se condenser, une augmentation significative des modules de Young apparents a été détectée, atteignant des valeurs intermédiaires entre les phases intacte et histolytique (0,77 ± 0,29 kPa, Figure 2F).
Comme on peut le voir dans les exemples de courbes fournis (Figure 2B), une hystérésis s’est produite entre la plupart des paires de courbes d’approche et de rétraction, indiquant une réponse viscoélastique du tissu sous la force. Nous avons ensuite entrepris d’analyser plus en détail les propriétés viscoélastiques des différents tissus. Étant donné que les mesures oscillatoires sur plusieurs fréquences sont chronophages et quelque peu critiques en ce qui concerne la préservation de l’intégrité des tissus, en particulier lors de la cartographie de plusieurs régions tissulaires, nous avons utilisé une méthode précédemment publiée par Abuhattum et al. qui permet d’ajuster la partie approche des courbes force-distance avant la rétraction immédiate du porte-à-faux26. Le modèle est basé sur des éléments du modèle Kelvin-Voigt Maxwell et a déjà été appliqué pour l’analyse des propriétés viscoélastiques des cellules et des hydrogels26, ainsi que du tissu pancréatique27. Les modules médians non relâchés (intacts : 23,05 kPa, histolyse : 0,20 kPa et cartilage de condensation : 1,60 kPa) et les modules de Young apparents (intacts : 17,54 kPa, histolyse : 0,07 kPa et cartilage de condensation : 1,54 kPa) calculés pour les tissus aux différents stades de régénération ont révélé des différences significatives (Figure 2G-H). Dans l’ensemble, une réponse principalement élastique des tissus à la déformation a été observée à la vitesse de déformation choisie, comme en témoigne la grande similitude des modules élastiques non relâchés et apparents (Figure 2G,H). Des valeurs médianes de viscosité apparente significativement plus faibles ont été obtenues pour le stade histolytique (0,72 Pa·s) par rapport aux stades du cartilage intact (2,06 Pa·s) et condensant (2,32 Pa·s) (Figure 2I). Comme prévu, les modules de Young apparents de l’analyse PyJjibe (Figure 2H) étaient en fort accord avec les valeurs obtenues par le logiciel de traitement de données JPK (Figure 2F).
En conclusion, la caractérisation mécanique reflète une restructuration tissulaire dynamique au cours du processus de régénération. Ces mesures sont conformes aux observations anatomiques, où la rigidité tissulaire diminue en même temps que les altérations observées de l’architecture tissulaire (Figure 1C) et est progressivement récupérée au cours de la régénération.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66946/66946fig01v2.jpg"> Figure 1 : Mesures d’indentation du cartilage d’un membre axolotl pendant la régénération. (A) Représentation schématique des étapes de régénération. La ligne pointillée indique le site approximatif de la section transversale générée par le vibratome où les mesures ont été effectuées. (B) Images représentatives des mesures du centre (en haut) et de la périphérie (en bas) dans le cartilage des membres. La pointe noire est le cantilever. Barre d’échelle : 100 μm. (C) Architecture tissulaire des membres intacts (à gauche), des tissus en cours d’histolyse (au milieu) et du cartilage en condensation (à droite). Vert : noyaux (Hoechst), magenta : filaments d’actine (Phalloidin). Barre d’échelle : 500 μm. C’Région agrandie délimitée dans le panneau. Barre d’échelle : 100 μm. Les grilles d’indentation de 70 μm x 70 μm sont indiquées par des carrés pointillés blancs (centre) et jaunes (périphérie). Dans les panneaux B et C, les lettres R et U indiquent respectivement le Rayon et le Cubitus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66946/66946fig01largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66946/66946fig2v5.jpg"> Figure 2 : Mesure de la rigidité du cartilage lors de la régénération d’un membre axolotl avec AFM. (A) Schémas de l’expérience d’indentation AFM montrés comme la force en fonction du temps (ci-dessus) et la force en fonction de la distance entre le pénétrateur et l’échantillon (ci-dessous). Les courbes d’approche et de rétraction sont affichées en bleu et en rouge, respectivement. Le point de contact est indiqué par une ligne pointillée verticale noire. Les courbes force-indentation ont été ajustées dans la partie d’approche de la courbe, soit à l’aide du modèle Hertz/Sneddon (logiciel de traitement de données JPK et Pyjibe), soit à l’aide de l’extension du modèle KVM viscoélastique dans Pyjibe. (B) Courbes force-distance représentatives des mesures AFM dans les membres intacts et en régénération pendant les stades d’histolyse et de condensation du cartilage. Le pourcentage de courbes analysables (c’est-à-dire sans artefacts) est indiqué dans le coin supérieur droit de chaque courbe. (C) Exemples d’artefacts typiques dans les courbes d’indentation de force, par exemple, en raison d’un contact inapproprié du pénétrateur avec la surface. Les exemples présentés correspondent à des membres intacts, mais des types équivalents d’artefacts ont été observés dans toutes les conditions. Pour B-C : Des courbes force-distance représentatives ont été ajustées et affichées à l’aide de Pyjibe. La courbe bleu clair représente la partie d’approche de la courbe, et la courbe rouge clair est la partie rétraction. La ligne bleue plus foncée est l’ajustement Hertz/Sneddon appliqué pour un pénétrateur sphérique. Les valeurs résiduelles respectives de l’ajustement sont indiquées ci-dessous pour les courbes force-distance inférieures. Les valeurs résiduelles tracées représentent la différence entre les valeurs d’ajustement et de force réelle. (D) Modules apparents de Young du radius et des centres du cubitus mesurés dans des membres intacts et subissant une histolyse. (E) Modules de Young apparents du centre du cartilage par rapport à la périphérie (Peri) dans les membres intacts et pendant l’histolyse. (F) Modules de Young apparents mesurés pour le centre du cartilage aux stades analysés de la régénération. Pour D-F : Chaque point est dérivé d’une courbe force-distance analysée avec succès, et les points plus grands correspondent aux valeurs médianes par échantillon. Les modules de Young apparents ont été obtenus à l’aide de l’ajustement du modèle Hertz/Sneddon du logiciel JPK Bruker. (G-I) Le module non relâché (G), le module de Young apparent (H) et la viscosité apparente (I) calculés à l’aide de PyJibe (extension KVM) à partir de mesures du centre du cartilage aux stades analysés de la régénération. Chaque point est dérivé d’une courbe force-distance analysée avec succès. Les lignes correspondent aux valeurs médianes de toutes les mesures par condition. Pour D-I : Kruskal-Wallis avec le test de comparaisons multiples de Dunn. Des lettres différentes représentent des conditions statistiquement différentes les unes des autres (p &lt; 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66946/66946fig2v5large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Mesures par microscopie à force atomique du cartilage dans des membres axolotls intacts et en régénération

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