Name: Surveillance de l’activité d’une répétition riche en leucine contenant 8 canaux (LRRC8/VRAC) à l’aide du transfert d’énergie de résonance de Förster à émission sensibilisée (SE-FRET) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Découvrez une méthode FRET pour surveiller l'activité des canaux anioniques LRRC8 dans des cellules HeLa vivantes. Cette approche permet d'étudier la régulation de ces canaux sous différentes conditions osmotiques.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Méthode basée sur FRET pour surveiller l’activité du canal LRRC8 sans électrophysiologie

Des canaux ioniques composés d’hétéromères de protéines de la famille LRRC8 (LRRC8) riches en leucine sont présents dans les cellules des vertébrés, participant à un large éventail de fonctions physiologiques 1,2. Ces canaux LRRC8, d’abord identifiés comme canaux anioniques régulés en volume (VRAC) ou canaux de rectification vers l’extérieur sensibles au volume (VSOR), jouent un rôle crucial dans la diminution du volume régulateur cellulaire 3,4. Ils facilitent l’expulsion des ions chlorure et des osmolytes organiques, qui est suivie d’un efflux d’eau en réponse au gonflement osmotique. Au-delà de leur rôle dans la réponse au stress osmotique, leur rôle dans la régulation du volume cellulaire a été lié à la prolifération et à la migration cellulaires, à l’apoptose, à la spermiogenèse et à l’intégrité épithéliale 5,6,7. Il a été démontré que l’altération du potentiel membranaire lors de l’activation de LRRC8/VRAC contribue à la différenciation des myotubes8 et à la sécrétion d’insuline par les cellules β pancréatiques 9,10,11. De plus, les canaux LRRC8 conduisent une variété d’osmolytes organiques tels que les molécules de signalisation purinergiques ATP et cGAMP ou l’acide aminé excitateur glutamate, plaçant ces canaux dans la communication cellule-cellule dans le système immunitaire ou l’interaction glia-neurone 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 et 22. Même les xénobiotiques, tels que le colorant fluorescéine, l’antibiotique blasticidine S ou le médicament anticancéreux cisplatine, sont conduits par les canaux LRRC8 23,24,25.
Il existe de nombreux rapports sur la transduction du signal conduisant à l’activation de LRRC8/VRAC 26,27,28. Cependant, le mécanisme reste incertain, et la littérature présente un large éventail de mécanismes potentiels qui pourraient dépendre du processus physiologique spécifique. Il s’agit notamment des modifications de l’intensité des ions cytosoliques, de l’interaction avec le cytosquelette, de la composition membranaire, des protéines G, de l’état redox et des cascades de phosphorylation 2,27,29,30,31.
Les canaux LRRC8/VRAC contiennent LRRC8A en tant que sous-unitéessentielle 3,4 qui doit s’hétéromériser avec au moins un de ses paralogues LRRC8B-E pour former des canaux physiologiquement fonctionnels 4,14,32. La composition des sous-unités détermine les propriétés biophysiques du canal, telles que l’inactivation dépendante de la rectification et de la dépolarisation 4,29,32,33,34, la spécificité du substrat 15,17,20,21,24,35 et certaines voies d’activation 36,37. Les structures de cryo-microscopie électronique (cryo-EM) montrent que les homomères LRRC8A, ainsi que les hétéromères, s’assemblent en hexamères 38,39,40, tandis que les chimères LRRC8A/LRRC8C qui forment des canaux fonctionnels sont des heptamers41. La partie N-terminale de toutes les protéines LRRC8 comprend quatre hélices transmembranaires, et la partie C-terminale contient un domaine avec des répétitions riches en leucine (LRRD). Les structures complexes LRRC8 disponibles fournissent la preuve que les LRRD, qui s’étendent dans le cytosol 3,4,23, peuvent subir des réarrangements conformationnels lors de la régulation des canaux 34,42,43. Cette notion est corroborée par la découverte que la fusion C-terminale des protéines fluorescentes entraîne l’activité du canalbasal 14 et que la liaison des nanocorps aux domaines peut moduler l’activité du canal44. De plus, des altérations conformationnelles des extrémités C ont été mises en évidence par un transfert d’énergie par résonance de Förster (FRET) intra-complexe45.
La méthode la plus courante pour étudier l’activité des canaux ioniques est les mesures électrophysiologiques46, qui ont été largement appliquées dans l’étude des VRAC avant leur identification moléculaire47. Cependant, il existe plusieurs autres moyens de surveiller indirectement l’activité de la VRAC, notamment la mesure de ses substrats conduits -ions halogénures ou osmolytes organiques- ou son effet sur le volume cellulaire48. En fait, l’identification des protéines LRRC8 comme VRAC reposait sur un test basé sur l’extinction d’une protéine fluorescente sensible aux halogénures49 par l’iodure pénétrant dans la cellule par les VRACSactivés 3,4. Une autre méthode de surveillance de l’activité des canaux LRRC8/VRAC utilise le mouvement des domaines cytosoliques qui peuvent être observés, comme dans d’autres canaux ioniques 50,51,52,53, par des modifications de FRET45. À cette fin, les protéines fluorescentes qui servent de paires FRET, telles que la protéine fluorescente cyan (CFP)/mCerulean3 comme donneuse et la protéine fluorescente jaune (YFP)/mVenus comme accepteur, ont été fusionnées aux extrémités C des protéines LRRC8 (Figure 1). La FRET intra-complexe entre les sous-unités LRRC8 a été mise en évidence par des expériences de photoblanchiment par accepteur45. En évitant la méthode destructrice de photoblanchiment, les changements de FRET au fil du temps ont été surveillés par FRET À ÉMISSION SENSIBILISÉE (SE-FRET), où l’émission sensibilisée de l’accepteur lors de l’excitation du donneur en raison du chevauchement du spectre d’émission du donneur avec le spectre d’excitation de l’accepteur est mesurée. L’application de l’hypotonicité extracellulaire, un stimulus pour l’activation de LRRC8/VRAC, a entraîné une réduction réversible de l’intensité SE-FRET45. Il est important de noter que les mesures simultanées du patch-clamp sur cellules entières et la surveillance FRET pendant le traitement hypotonique ont montré que cette réduction de FRET reflétait effectivement l’activation de LRRC8/VRAC45. Cette méthode, qui évite de perturber la membrane plasmique ou d’altérer l’environnement intracellulaire par une solution de pipette, offre une alternative pour surveiller l’activité LRRC8/VRAC. Il est particulièrement utile dans les contextes physiologiques où le maintien du cytosol natif est crucial, la résolution subcellulaire est nécessaire ou l’observation prolongée de l’activité des canaux est requise.
Ici, nous présentons un protocole pour étudier LRRC8/VRAC avec une telle lecture basée sur FRET. Le protocole décrit comment manipuler et transfecter les cellules, acquérir des échantillons et des images de contrôle, analyser les données et calculer les valeurs FRET D’ÉMISSION SENSIBILISÉE (SE-FRET).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66953/66953fig01v2.jpg"> 
Figure 1 : Schéma du système de paires FRET LRRC8. mCerulean3 est représenté en cyan et mVenus est représenté en jaune. Après l’ouverture du VRAC, la distance (et/ou l’orientation spatiale) entre les fluorophores change, ce qui entraîne une réduction du transfert d’énergie entre le donneur (Don) et l’accepteur (Acc) et, par conséquent, une diminution du FRET observé. Créé avec BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66953/66953fig01largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td>0,05 % Trypsine-EDTA</td><td>gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Appareil photo DFC9000GTC</td><td>Leica</td><td>11547007</td><td></td></tr><tr><td>CFP-18aa-YFP</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>Elder et al. 2009 PMCID : PMC2706461 ; Don de C.F. Kaminski (Université de Cambridge, Royaume-Uni)</td></tr><tr><td>Cycloheximide (CHX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>66-81-9</td><td></td></tr><tr><td>D(-)-Mannitol</td><td>Carl Roth</td><td>4175.1</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose</td><td>Carl Roth</td><td>HN06.1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium)</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-03590</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline)</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>Roue à filtres anti-émission (460/80, 535/70, 590/50, 642/80, 100 %)</td><td>Leica</td><td>11525480</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Sérum de veau fœtal)</td><td>PAN-Biotech</td><td>P30-3302</td><td></td></tr><tr><td>Cube filtrant CYR71010</td><td>Leica</td><td>11525416</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE</td><td>Promega</td><td>E2691</td><td></td></tr><tr><td>Plats de culture à fond de verre 35 mm</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Cellules HeLa</td><td>Leibniz Forschungsinstitut DSMZ</td><td>ACC 57</td><td>Carcinome du col de l’utérus chez les mammifères/ Obtenu auprès de Leibniz Forschungsinstitut DSMZ</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth</td><td>9105.4</td><td></td></tr><tr><td>ibidi &micro ;-Disch 35 mm</td><td>ibidi</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>KCl (Chlorure de potassium)</td><td>Carl Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>LAS X FRET Wizard</td><td>Leica</td><td></td><td></td>11640862</tr><tr><td>Source lumineuse LED8</td><td>Leica</td><td>11504256</td><td></td></tr><tr><td>LRRC8A-mCerulean3</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>K&ouml ; nig et al., 2019</td></tr><tr><td>LRRC8E-mVenus</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>K&ouml ; nig et al. 2019</td></tr><tr><td>Luna-II Automated Cell Counter</td><td>logos biosystems</td><td>L40002</td><td></td></tr><tr><td>Luna-II Cell Counter Slides</td><td>logos biosystems</td><td>L12001</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 (Chlorure de magnésium)</td><td>Carl Roth</td><td>KK36.1</td><td></td></tr><tr><td>Microscope THUNDER Imager cellule vivante</td><td>Leica</td><td>11525681</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (Chlorure de sodium)</td><td>Carl Roth</td><td>9263</td><td></td></tr><tr><td>Objectif HC PL APO 63x/1.40 OIL</td><td>Leica</td><td>11506349</td><td></td></tr><tr><td>Opti-Minimal Essential Medium (MEM)</td><td>gibco</td><td>11058</td><td></td></tr><tr><td>Osmomètre OM807</td><td>Vogel</td><td>V04807</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline Streptomycine (Pen Step)</td><td>gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Solution de bleu de trypan (0,4 %)</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Facteur de nécrose tumorale (TNF)-a</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94948-59-1</td><td></td></tr><tr><td>Système de perfusion par gravité contrôlée par valve</td><td>ALA Scientific Instruments</td><td>VC3-4xG</td><td></td></tr></tbody></table>

surveillance de l’activité d’une répétition riche en leucine contenant 8 canaux (lrrc8/vrac) à l’aide du transfert d’énergie de résonance de förster à émission sensibilisée (se-fret)

Monitoring Leucine-Rich Repeat Containing 8 Channel (LRRC8/VRAC) Activity Using Sensitized-Emission F&#246;rster Resonance Energy Transfer (SE-FRET)

Avec cette méthode basée sur FRET, l’activité LRRC8/VRAC peut être surveillée pendant la stimulation osmotique, et la réduction de SE-FRET est corrélée avec le degré d’hypotonicité extracellulaire45. Des résultats représentatifs de l’activation du canal induite par l’hypotonicité sont également présentés ici (Figure 3 et Figure 4). De plus, l’activation de LRRC8/VRAC par différents stimuli isosmotiques, tels que la manipulation de la signalisation du diacylglycérol45 ou lors de l’activation des myocytes56, peut être observée.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66953/66953fig04.jpg"> 
Figure 4 : Traces SE-FRET. (A) Traces SE-FRET apparentes provenant de 5 expériences indépendantes. Les données représentent la moyenne ± ET de N = 2 à N = 7 cellules par champ de vision (FOV). (B) Moyenne ± ET de toutes les cellules (N = 31 cellules). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66953/66953fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Comme les canaux LRRC8/VRAC sont également impliqués dans la diminution du volume apoptotique24,57, l’observation de l’activité des canaux lors de l’induction de l’apoptose serait une autre application de la méthode décrite ici. En conséquence, le protocole de surveillance de SE-FRET dans les cellules HeLa exprimant LRRC8A-mCerulean3 et LRRC8E-mVenus a été mis en œuvre lors de l’application de médicaments induisant l’apoptose médiés par les récepteurs de mort. Il a été démontré que le facteur de nécrose tumorale (TNF)-α et le cycloheximide (CHX) évoquent des courants VRAC en quelques minutes58. Après l’ajout de 2 ng/mL de TNF-α et de 1 μg/mL de CHX dans un tampon isotonique, on a observé une diminution robuste du SE-FRET (figure 5). En remplaçant le tampon par un milieu hypertonique, même s’il contenait du TNF-α et du CHX, les valeurs SE-FRET se sont rétablies près de la ligne de base (Figure 5A), ce qui correspond à une diminution des courants VRAC dans une solution de bain hypertonique pendant le traitement avec le ligandFas 58 induisant l’apoptose. Le traitement des cellules avec du DMSO, le solvant pour le TNF-α et le CHX, n’a pas entraîné de réduction du SE-FRET. TNF-α + CHX n’a pas affecté le SE-FRET du CFP-18aa-YFP, une construction en tandem EYFP et ECFP comme contrôle FRET59, démontrant la spécificité pour LRRC8/VRAC (Figure 5B).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66953/66953fig05v2.jpg"> 
Figure 5 : Activation isosmotique de VRAC par apoptose médiée par le récepteur de mort. (A) Valeurs SE-FRET normalisées des cellules HeLa exprimant LRRC8A-mCer/LRRC8E-mVen (n = 8 plats, 23 cellules) au fil du temps. Après 15 cycles dans un tampon d’imagerie isotonique (ligne de base), la solution de bain a été remplacée par un tampon isotonique complété par 2 ng/mL de TNF-α et 1 μg/mL de cycloheximide (CHX) pendant 30 cycles, suivis de 20 cycles de tampon d’imagerie hypertonique avec TNF-α et CHX. La valeur moyenne brute SE-FRET de chaque retour sur investissement et point temporel a été normalisée à la moyenne de la valeur de base (isotonique) pour le retour sur investissement respectif. (B) Quantification des valeurs SE-FRET normalisées des cellules HeLa exprimant LRRC8A/E comme dans A avec une solution isotonique contenant du DMSO comme véhicule de contrôle pour CHX (n = 5 boîtes, 12 cellules) ou un tampon isotonique contenant des inducteurs d’apoptose comme dans A (n = 8 boîtes, 23 cellules), ou des cellules HeLa exprimant CFP-18aa-YFP avec des inducteurs d’apoptose (n = 3 boîtes, 9 cellules). Les données représentent la moyenne des 10 derniers points temporels dans la mémoire tampon respective des cellules individuelles (symboles) et la moyenne de toutes les cellules ± SD ; ** p &lt; ANOVA unidirectionnelle ordinaire de 0,01 suivie du test post-hoc de comparaison multiple de Tukey. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66953/66953fig05largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Surveillance de l’activité d’une répétition riche en leucine contenant 8 canaux (LRRC8/VRAC) à l’aide du transfert d’énergie de résonance de Förster à émission sensibilisée (SE-FRET)

Members of the LRRC8 protein family form heteromeric ion and osmolyte channels with roles in numerous physiological processes. As volume-regulated anion ...

monitoring-leucine-rich-repeat-containing-8-channel-lrrc8vrac

Research

Recherche

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimie

On démontre FRET entre le polymère conjugué polydiacétylène (PDA) et un fluorophore attaché à la surface des liposomes PDA pour la détection de biomolécules. Liposomes PDA contient également des molécules réceptrices sur leurs surfaces de biomolécules à être utilisées en tant que sondes. Interactions ligand-récepteur entraîner des changements dans l'efficacité de FRET entre le fluorophore et PDA qui est la base du mécanisme de détection.

Surveillance en temps réel des interactions ligand-récepteur avec Fluorescence Resonance Energy Transfer

Nous décrivons ici une méthode améliorée Transfert Luminescence Resonance Energy (LRET) où nous introduisons un site de clivage de protéase entre les sites de fluorophores donneur et accepteur. Cette modification permet d'obtenir des signaux de LRET spécifiques découlant de protéines membranaires d'intérêt, ce qui permet l'étude de protéines de la membrane sans la purification des protéines.

Luminescence Resonance Energy Transfer pour étudier les changements conformationnels dans des protéines membranaires exprimés dans les cellules de mammifères

Actuellement, la plupart des indicateurs calciques disponibles sont utilisés pour quantifier les transitoires calciques cytoplasmiques en tant que mesures indirectes du calcium libéré par le réticulum sarcoplasmique dans les cellules musculaires lisses en culture. Ce protocole décrit l’utilisation d’un indicateur spécifique basé sur le FRET qui permet de mesurer directement les signaux calciques dans la lumière du réticulum sarcoplasmique.

Imagerie confocale à base de FRET mesure des fluctuations de calcium à l&#39;intérieur du réticulum sarcoplasmique de Cultured cellules musculaires lisses Utilisation

La présente étude décrit une méthode simple de détecter des taux endogènes de la phosphorylation de Rab10 de leucine-rich repeat kinase 2.

Rab10 détection de Phosphorylation par LRRK2 l’activité à l’aide de SDS-PAGE avec une balise de Phosphate-binding

Cette étude présente une procédure détaillée pour effectuer des expériences de transfert d’énergie par résonance de fluorescence à molécule unique (smFRET) sur des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) en utilisant un marquage spécifique au site via l’incorporation d’acides aminés non naturels (UAA). Le protocole fournit un guide étape par étape pour la préparation des échantillons smFRET, les expériences et l’analyse des données.

Visualisation de la dynamique conformationnelle des récepteurs membranaires à l’aide d’une seule molécule FRET

Le transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET) est une technique d’imagerie permettant de détecter les interactions protéiques dans les cellules vivantes. Ici, un protocole FRET est présenté pour étudier l’association des enzymes modifiant les histones avec des facteurs de transcription qui les recrutent vers les promoteurs cibles de la régulation épigénétique de l’expression génique dans les tissus végétaux.

Étude des interactions entre les enzymes modifiant l’histone et les facteurs de transcription in vivo par transfert d’énergie par résonance de fluorescence

Les régions intrinsèquement désordonnées (IDR) sont des domaines protéiques flexibles qui modifient leur conformation en réponse aux changements environnementaux. Le transfert d’énergie par résonance de fluorescence d’ensemble (FRET) peut estimer les dimensions des protéines dans différentes conditions. Nous présentons une approche FRET pour évaluer la sensibilité structurelle de l’IDR dans les cellules vivantes de Saccharomyces cerevisiae sous stress hyperosmotique.

Estimation de la sensibilité structurelle de régions intrinsèquement désordonnées en réponse à un stress hyperosmotique dans des cellules vivantes à l’aide de FRET

Ce protocole décrit un test basé sur BRET pour mesurer les interactions de la kinase CRAF avec les protéines 14-3-3 dans des cellules vivantes. Le protocole décrit les étapes de préparation des cellules, de lecture des émissions BRET et d’analyse des données. Un exemple de résultat avec l’identification des contrôles appropriés et le dépannage pour l’optimisation du test est également présenté.

Dosage basé sur le transfert d’énergie par résonance de bioluminescence (BRET) pour mesurer les interactions de CRAF avec les protéines 14-3-3 dans les cellules vivantes

Les auteurs décrivent un protocole pour cartographier la distribution spatiale de l’activité enzymatique d’une enzyme qui génèrent nicotinatmide adénine dinucléotide phosphate (NAD(P)H) + H + directement dans les échantillons de tissus.

Métabolisme de cartographie : Surveiller l’activité de la Lactate déshydrogénase directement dans le tissu

Interactions protéines-protéines sont essentielles pour les systèmes biologiques, et des études de la cinétique de liaison donnent un aperçu de la dynamique et la fonction de complexes protéiques. Les auteurs décrivent une méthode qui quantifie les paramètres cinétiques d’une protéine complexe à l’aide de transfert d’énergie de fluorescence par résonance et la technique de flux stoppé.

À l’aide au transfert d’énergie Fluorescence in Vitro pour étudier la dynamique des protéines Complexes à une échelle de temps de milliseconde

Découvrez une méthode FRET pour surveiller l'activité des canaux anioniques LRRC8 dans des cellules HeLa vivantes. Cette approche permet d'étudier la régulation de ces canaux sous différentes conditions osmotiques.

Surveillance de l’activité d’une répétition riche en leucine contenant 8 canaux (LRRC8/VRAC) à l’aide du transfert d’énergie de résonance de Förster à émission sensibilisée (SE-FRET) (Vidéo) | JoVE Journal

Surveillance de l’activité d’une répétition riche en leucine contenant 8 canaux (LRRC8/VRAC) à l’aide du transfert d’énergie de résonance de Förster à émission sensibilisée (SE-FRET)

Explorer plus de vidéos