Surveillance de l’activité d’une répétition riche en leucine contenant 8 canaux (LRRC8/VRAC) à l’aide du transfert d’énergie de résonance de Förster à émission sensibilisée (SE-FRET)

Nos recherches portent sur les propriétés et la fonction du transport membranaire, en particulier les transporteurs d’ions et les canaux tels que les canaux d’anions et d’osmolytes formés par LRRC8. Nous étudions leurs mécanismes biophysiques, leurs processus de régulation et leurs fonctions physiologiques cellulaires. En fin de compte, nous visons également à élucider comment leur dysfonctionnement peut conduire à des troubles chez l’homme.

De nombreux laboratoires ont fait progresser notre compréhension des canaux LRRC, en résolvant les structures des complexes LRRC8, en élucidant les propriétés électrophysiologiques et en découvrant divers rôles physiologiques. Cependant, une question cruciale demeure : comment ces canaux sont-ils régulés biochimiquement et physiologiquement et comment la composition des sous-unités influence-t-elle leur activation et leurs rôles au sein de la cellule ? Cette méthode permet d’observer l’activité du canal LRRC8 dans des compartiments généralement inaccessibles pour l’électrophysiologie, tels que les compartiments intracellulaires, sans perturber la composition cytosolique comme le ferait le patch-clamp à cellules entières.

Ses résolutions subcellulaires permettent de surveiller les canaux LRRC8 activés différentiellement au sein d’une seule cellule et permettent une surveillance continue pendant les processus physiologiques. Avec ce capteur basé sur FRET, nous étudierons la régulation et la fonction des canaux VRAC LRRC8 dans différentes conditions physiologiques. Les questions clés sont les suivantes : comment les sous-unités réorganisent leur confirmation ; quels processus de transduction du signal sont impliqués avec différents stimuli, et s’il existe des différences entre les différents paralogues de LRRC8 ; et s’il existe des différences subcellulaires dans les processus physiologiques.

Pour commencer, préparez les tampons isotoniques, hypotoniques et hypertoniques. À l’aide d’un osmomètre, mesurez l’osmolarité du tampon. La veille de la transfection, ensemencez une fois dix à la puissance cinq cellules HeLa dans deux millilitres de milieu de culture cellulaire sur une parabole de 35 millimètres.

Cultivez les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Le lendemain, goutte à goutte, ajoutez la solution de transfection en spirale dans le plat. Déplacez le plat cinq fois horizontalement et verticalement sur la surface du banc pour mélanger la solution.

Cultivez les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Le lendemain, vérifiez la transfection au microscope fluorescent. Prenez les cellules exprimant à la fois les constructions donneuse et accepteuse et aspirez le milieu de culture cellulaire.

Lavez les cellules trois fois avec deux millilitres de tampon isotonique. Après avoir aspiré le tampon isotonique, ajoutez trois millilitres de tampon isotonique dans les cellules et placez la boîte d’échantillon sur la platine du microscope. Chargez les paramètres FRET de la microscopie ou configurez les canaux nécessaires pour une expérience FRET :excitation du donneur-émission du donneur, DD ; et accepteur-accepteur, AA. Trouvez un champ de vision avec au moins une cellule exprimant à la fois les constructions donneuse et accepteuse et ajustez les paramètres du canal si nécessaire.

Retirez la plaque de la platine du microscope et remettez-la dans l’incubateur jusqu’à l’expérience. Prenez les cellules exprimant uniquement la construction donneuse et aspirez le milieu de culture. Lavez les cellules trois fois avec deux millilitres de tampon isotonique.

Après le dernier lavage, ajoutez trois millilitres de tampon isotonique dans les cellules et placez la boîte d’échantillon sur la platine du microscope. Trouvez un champ de vision avec au moins une cellule exprimant la construction donneuse. Imagez tous les canaux donneur-donneur, accepteur-accepteur et donneur-accepteur.

Dessinez une région d’intérêt ou un retour d’intérêt autour des cellules et mesurez l’intensité moyenne des canaux donneur-accepteur et donneur-donneur. Pour la soustraction de l’arrière-plan, dessinez un retour d’intérêt dans les canaux donneur-accepteur et donneur-donneur où seul le signal de fond se trouve et mesurez l’intensité moyenne. Après avoir imager les cellules, dessinez un retour d’intérêt autour des cellules et mesurez l’intensité moyenne du canal donneur-accepteur et accepteur-accepteur.

Pour la soustraction de l’arrière-plan, dessinez un retour d’intérêt dans les canaux donneur-accepteur et accepteur-accepteur où seul le signal de fond se trouve et mesurez les intensités moyennes. Enfin, calculez les facteurs de correction, bêta et gamma, à l’aide des valeurs déterminées pour l’IDA corrigé en arrière-plan, l’IDD corrigé en arrière-plan et l’IAA corrigé en arrière-plan. Pour commencer, aspirez le tampon des cellules HeLa préalablement préparées exprimant le donneur et l’accepteur.

Lavez les cellules avec trois millilitres de tampon isotonique et placez la boîte d’échantillon sur la platine du microscope. Pour l’aspiration du tampon isotonique, fixez et ajustez une canule de tuyau de sorte que son extrémité atteigne le fond du plat. Pour ajouter des tampons, fixez et ajustez le tube pour permettre au flux tampon entraîné par gravité de tomber dans le plat.

Trouvez un champ de vision avec au moins une cellule exprimant simultanément la construction donneuse et accepteuse et acquérez une image. Pour la soustraction de fond pour le signal FRET, dessinez un ROI dans le canal donneur-accepteur où seul le signal de fond se trouve et mesurez l’intensité moyenne. Pour la quantification SE-FRET, dessinez un retour d’intérêt autour de la cellule et mesurez l’intensité moyenne dans les canaux donneur-donneur, donneur-accepteur et accepteur-accepteur pour toutes les images de la série chronologique.

Mettez en place une expérience time-lapse pour les canaux donneur-donneur, donneur-accepteur et accepteur-accepteur avec un intervalle de 10 secondes et une durée pour couvrir toutes les conditions de la séquence de stimulation. Lancez l’acquisition de l’imagerie time-lapse et tracez les traces SE-FRET. Après la mesure de base, remplacez le tampon par un écoulement par gravité.

Dans l’expérience en direct, aspirez le tampon isotonique à l’aide de la canule du tuyau, en appliquant un vide à l’aide d’une seringue. Ajouter trois millilitres du tampon de la condition suivante par écoulement gravitaire tout en continuant l’imagerie time-lapse. Pour mesurer une autre condition, lavez l’échantillon dans le tampon suivant comme indiqué précédemment tout en continuant l’imagerie en accéléré.

À l’aide de la méthode basée sur FRET, l’activité du canal anionique LRRC8 régulé en volume a été surveillée pendant la stimulation osmotique et la réduction SE-FRET corrélée à l’hypotonicité extracellulaire. Dans d’autres expériences, l’activation de LRRC8 VRAC par des stimuli isosmotiques tels que la signalisation du diacylglycérol ou l’activation des myocytes a également été détectée. L’activité VRAC de LRRC8 a été surveillée lors de l’induction de l’apoptose dans les cellules HeLa exprimant LRRC8A mCerulean3 et LRRC8E mVenus.

Le facteur de nécrose tumorale alpha et le cycloheximide ont provoqué une forte diminution du SE-FRET, qui s’est rétablie dans un milieu hypertonique. Le traitement au DMSO n’a pas réduit le SE-FRET, confirmant la spécificité du LRRC8 VRAC.