Systèmes AAV et modèles murins pour l’étude de l’expression ectopique de Neurod1 dans des cellules transduites à des moments subaigus et chroniques post-AVC ischémique

Nous explorons l’expression ectopique des facteurs de transcription neurogènes médiée par l’AAV comme traitement potentiel de l’AVC ischémique. Notre objectif est de voir si l’expression de Neurod1 dans les cellules exprimant le GFAP pendant les phases subaiguës et chroniques après un AVC augmente les neurones transduits et est corrélée avec l’amélioration de la fonction motrice. Des résultats récents montrent que l’expression génique dans le cortex varie selon la région avec le même AAV Notre recherche a révélé que le promoteur GFAP est plus actif dans le cortex préfrontal médian que dans le cortex moteur, ce qui indique que les cellules transduites réagissent différemment à des promoteurs spécifiques.

Ainsi, les thérapies impliquant des facteurs de transcription neurogènes doivent être adaptées à la région cérébrale cible. Les défis actuels comprennent la variabilité de la taille des lésions de l’AVC en raison de variables telles que les taux d’injection d’ET-1 et l’efficacité de la transduction entre les régions du cerveau. Les titres d’AAV et le tropisme dans les régions du cerveau et les souches de souris peuvent affecter l’efficacité de la transduction, ce qui a un impact sur l’évaluation cellulaire de l’expression ectopique de Neurod1 après un AVC.

Le principal défi dans la conversion des astrocytes en neurones est de distinguer les neurones reprogrammés des neurones préexistants. Notre laboratoire vise à confirmer que cette reprogrammation se produit in vivo en développant de nouveaux outils. En fin de compte, nous cherchons à comprendre comment l’expression ectopique du facteur de transcription neuronal améliore la récupération chez les animaux cérébro-lésés.

Pour commencer, retirez l’animal anesthésié de la chambre et placez-le sur une surface propre. Après avoir nettoyé la zone chirurgicale de la souris, placez son nez dans le cône de nez stéréotaxique et stabilisez le crâne à l’aide de barres d’oreille. À l’aide d’une lame de scalpel numéro 10, faites une incision verticale parallèle au plan sagittal de l’arrière du point médian des yeux jusqu’à l’os pariétal.

Ensuite, rétractez doucement la peau pour exposer le crâne. Ensuite, utilisez un coton-tige pour perturber le fascia sur le crâne et laissez le crâne sécher pour exposer complètement le bregma. À l’aide d’une perceuse stéréotaxique à grande vitesse, percez trois trous de bavure aux coordonnées du cortex sensorimoteur droit.

Ensuite, remplacez la perceuse par une seringue de calibre 26 équipée d’une aiguille mesurant 0,375 pouce de longueur. Chargez 1,5 microlitre de solution d’endothéline-1 micromolaire de 400 micromolaires dissoute dans du PBS stérile dans la seringue. Libérez un petit volume d’endothéline-1 pour observer une goutte à l’extrémité de l’aiguille, assurant un bon écoulement.

Abaissez la pointe de l’aiguille au-delà du crâne dans le trou de la meule centrale sans percer la dure-mère. Une fois aligné, abaissez l’aiguille d’un millimètre dans le cerveau. À l’aide de la seringue Hamilton, distribuez 0,1 microlitre à la fois et attendez une minute avant d’injecter le prochain 0,1 microlitre.

Pour éviter que l’aiguille ne se bloque entre et après les injections, libérez un petit volume d’endothéline-1 jusqu’à ce qu’une goutte apparaisse à l’extrémité de l’aiguille. À l’aide d’un coton-tige stérile, essuyez l’excès d’endothéline-1 avant l’injection. Enfin, suturez la peau sus-jacente du crâne à l’aide d’une suture stérile 4-0 pour fermer la plaie.

Après avoir anesthésié la souris traitée à l’endothéline-1, transférez la souris dans le cadre stéréotaxique. À l’aide de ciseaux chirurgicaux, coupez les sutures sur la plaie. À l’aide d’une pince, retirez la croûte et rétractez la peau pour exposer le crâne.

Ensuite, utilisez un coton-tige stérile pour sécher la surface du crâne et localiser les trous de bavure. Installez les bras manipulateurs de l’appareil stéréotaxique. Placez un porte-aiguille portant une seringue de calibre 26 avec une aiguille mesurant 0,375 pouce de longueur.

Maintenant, chargez 3,4 microlitres de solution AAV dans la seringue. Abaissez la pointe de l’aiguille au-delà du crâne dans le premier trou de bavure le plus antérieur. Assurez-vous que l’aiguille ne perfore pas la dure-mère, puis abaissez-la d’un millimètre dans le cerveau.

À l’aide de la seringue Hamilton, injectez un microlitre de solution AAV en distribuant 0,1 microlitre à la fois, comme démontré précédemment. Suturez ensuite la peau sus-jacente sur le crâne pour fermer la plaie à l’aide d’une suture en polyester Polysorb 4-0. Retirez la souris du cadre stéréotaxique et transférez-la dans une cage propre et préchauffée dans la zone de récupération.