Name: Ciblage génique rétroviral médié par CRISPR/Cas9 pour l’étude de la différenciation Th17 in vitro (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-15T13:20:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Découvrez le ciblage génique rétroviral médié par CRISPR/Cas9 pour étudier la différenciation Th17 in vitro. Cette méthode permet d'analyser la fonction des gènes dans les cellules T primaires de souris transgéniques Cas9.

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<meta charset="utf8"></head><body>Transduction rétrovirale de l’ARN guide pour l’édition de gènes dans la différenciation Th17

<ol><li>Wu, B., Wan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+control+of+pathogenic+th17+cells+in+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunopharmacol%22%5BJournal%5D)">Molecular control of pathogenic th17 cells in autoimmune diseases.</a> Int Immunopharmacol. 80, 106187(2020).</li>
<li>Dong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th+17+cells+in+development%3A%3A+An+updated+view+of+their+molecular+identity+and+genetic+programming%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Th 17 cells in development:: An updated view of their molecular identity and genetic programming.</a> Nat Rev Immunol. 8 (5), 337-348 (2008).</li>
<li>Patel, D. D., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th17+cell+pathway+in+human+immunity%3A+Lessons+from+genetics+and+therapeutic+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Th17 cell pathway in human immunity: Lessons from genetics and therapeutic interventions.</a> Immunity. 43 (6), 1040-1051 (2015).</li>
<li>Ghoreschi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+pathogenic+Th17+cells+in+the+absence+of+TGF-%CE%B2+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of pathogenic Th17 cells in the absence of TGF-β signalling.</a> Nature. 467 (7318), 967-U144 (2010).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+molecular+signature+of+pathogenic+th17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction and molecular signature of pathogenic th17 cells.</a> Nat Immunol. 13 (10), 991-999 (2012).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li>
<li>Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+genetically+modified+mice+using+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Nat Protoc. 9 (8), 1956-1968 (2014).</li>
<li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+sgrna+design+to+maximize+activity+and+minimize+off-target+effects+of+crispr-cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Optimized sgrna design to maximize activity and minimize off-target effects of crispr-cas9.</a> Nat Biotechnol. 34 (2), 184-191 (2016).</li>
<li>Holst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+t-cell+receptor+retrogenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of t-cell receptor retrogenic mice.</a> Nat Protoc. 1 (1), 406-417 (2006).</li>
<li>Ordonez, P., Bishop, K. N., Stoye, J. P., Groom, H. C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+SAMHD1+restriction+by+flow+cytometry+in+human+myeloid+U937+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of SAMHD1 restriction by flow cytometry in human myeloid U937 cells.</a> J Vis Exp. (172), (2021).</li>
<li>Akcakaya, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+CRISPR+editing+with+no+detectable+genome-wide+off-target+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations.</a> Nature. 561 (7723), 416-419 (2018).</li>
<li>Bae, S., Park, J., Kim, J. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas-OFFinder%3A+A+fast+and+versatile+algorithm+that+searches+for+potential+off-target+sites+of+cas9+rna-guided+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Cas-OFFinder: A fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of cas9 rna-guided endonucleases.</a> Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).</li>
<li>Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+transduction+of+helper+T+cells+as+a+genetic+approach+to+study+mechanisms+controlling+their+differentiation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Retroviral transduction of helper T cells as a genetic approach to study mechanisms controlling their differentiation and function.</a> J Vis Exp. (117), e54698(2016).</li>
<li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pCL+vector+system%3A+Rapid+production+of+helper-free%2C+high-titer%2C+recombinant+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).</li>
<li>Cante-Barrett, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+gene+transfer+into+human+and+murine+hematopoietic+stem+cells%3A+Size+matters%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Lentiviral gene transfer into human and murine hematopoietic stem cells: Size matters.</a> BMC Res Notes. 9, 312-312 (2016).</li>
<li>Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+transduction+of+T-cell+receptors+in+mouse+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells.</a> J Vis Exp. (44), 2307(2010).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA (pH 8,0)</td><td>Solarbio</td><td>E1170</td><td></td></tr><tr><td>Plat de culture cellulaire et tissulaire 100 mm</td><td>BIOFIL</td><td>TCD010100</td><td></td></tr><tr><td>1 M Hepes (acide libre, stérile)</td><td>Solarbio</td><td>H1090</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture cellulaire et tissulaire 24 puits</td><td>NEST</td><td>702002</td><td></td></tr><tr><td>48 puits Plaque de culture cellulaire et tissulaire</td><td>NEST</td><td>748002</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin Une solution (1 000x)</td><td>Anticorps</td><td></td> CD4 anti-souris BioLegend 420601 <td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 650 (RM4-5)</td>Anticorps monoclonal <td>BioLegend</td><td>100546</td><td></td></tr><tr><td>CD3e (145-2C11), grade fonctionnel, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>16-0031-82</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal CD44 (IM7), PE, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>12-0441-83</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal CD62L (L-Selectin) (MEL-14), APC, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>17-0621-82&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Compteur de cellules</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>Cellometer Auto 2000</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer (40 &mu ; m)</td><td>Filtre cellulaire biosharp</td><td>BS-40-CS</td><td></td></tr><tr><td>(70 &mu ; m)</td><td><a name="GAMME ! Centrifugeuse B14">biosharp</a></td><td>BS-70-CS</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>eppendorf</td><td>5425&nbsp ; Centrifugeuse R</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix</td><td>Vazyme</td><td>Q411-02</td><td></td></tr><tr><td>ClonExpress II Kit de clonage en une étape</td><td>Vazyme</td><td>C112</td><td></td></tr><tr><td>DH5&alpha ; Cellules compétentes</td><td>Sangon Biotech</td><td>B528413</td><td></td></tr><tr><td>Direct-zol RNA Miniprep</td><td>ZYMO RESEARCH</td><td>R2050</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Medium</td><td>BasalMedia</td><td>L110KJ</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Mouse CD4+ T Cell Isolation Kit</td><td>STEMCELL</td><td>19852</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 660</td><td>Invitrogen</td><td>65-0864-18</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Mini Plasmid Kit II</td><td>TIANGEN</td><td>DP118-02</td><td></td></tr><tr><td>ExFect Réacteur de transfection</td><td>Vazyme</td><td>T101-01</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal, Premium Plus Gibco</td><td></td><td>A5669701</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-souris IL-17A Anticorps (TC11-18H10.1)</td><td>BioLegend</td><td>506907</td><td></td></tr><tr><td>Solution de formaldéhyde</td><td>Macklin</td><td>F864792</td><td></td></tr><tr><td>HiScript IV RT SuperMix pour qPCR ?+essuie-glace d’ADNg?</td><td>Vazyme</td><td>R423-01</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycine</td><td>Beyotime</td><td>S1672</td><td></td></tr><tr><td>Mitomycine C</td><td>Maokang Biotechnology</td><td>7/7/1950</td><td></td></tr><tr><td>Souris GRCm38</td><td>NCBI</td><td>RefSeq v.108.20200622</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM Sérum réduit Medium</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td>sérum réduit</td></tr><tr><td>Medium Pacific Blue anticorps anti-souris CD4 (RM4-5)</td><td>BioLegend</td><td></td><td></td>100531</tr><tr><td>Anticorps anti-souris CD25 PE/Cyanine7 (PC61)</td><td>BioLegend</td><td>102015</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps CD4 anti-souris PE/Cyanine7 (GK1.5)</td><td>BioLegend</td><td>100422</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PMA/TPA&nbsp ;</td><td>Beyotime</td><td>S1819</td><td></td></tr><tr><td>R26-CAG-Cas9 souris&nbsp ;</td><td>Centre d’organismes modèles de Shanghai</td><td>N° de catalogue NM-KI-00120</td><td></td></tr><tr><td>Protéine TGF-bêta 1 humaine recombinante (exprimée par CHO), CF</td><td>R& D Systems</td><td>11409-BH</td><td></td></tr><tr><td>Analyseur de cellules de recherche Recombinant Murine IL-6</td><td>PeproTech</td><td>216-16</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>BD LSRFortessa</td><td></td></tr><tr><td>Trieur de cellules de recherche</td><td>SONY</td><td>MA900</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>BasalMedia</td><td>L210KJ</td><td></td></tr><tr><td>SimpliAmp Thermal Cycler Système PCR</td><td>Applied Biosystems</td><td>A24811</td><td></td></tr><tr><td>Solution de pyruvate de sodium (100 mM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-LEAF Purifié anti-souris CD28 Anticorps (37.51)</td><td>BioLegend</td><td>102121</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-LEAF Purifié anti-souris IFN-&gamma ; Anticorps (XMG1.2)</td><td>BioLegend</td><td>505847</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-LEAF Anticorps anti-souris IL-4 purifié (11B11)</td><td>BioLegend</td><td>504135</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-LEAF Purified anti-souris IL-12/IL-23 p40 Anticorps (C17.8)</td><td>BioLegend</td><td>505309</td><td></td></tr><tr><td>&beta ;-Mercaptoethanol (50 mM)</td><td>Solarbio</td><td>M8211</td><td></td></tr></tbody></table>

ciblage génique rétroviral médié par crispr/cas9 pour l’étude de la différenciation th17 in vitro

Retroviral CRISPR/Cas9-Mediated Gene Targeting for the Study of Th17 Differentiation in Vitro

Dans l’étude, nous avons cloné la cible de l’ARNsg en séquences codantes non ciblées de Rorc et d’ARNsg dans le vecteur pMX-U6-MCS avec la protéine fluorescente mCherry (Figure 1A,B). La production de rétrovirus a été effectuée selon le protocole décrit à la figure 2. La transfection a été amorcée le jour 0 et la récolte rétrovirale a eu lieu le jour 2. L’efficacité de la transfection peut être testée par l’intensité de fluorescence mCherry (Figure 1C). Avant de récolter le virus, des lymphocytes T CD4+ naïfs ont été triés et activés. Ces lymphocytes T CD4+ activés ont ensuite été infectés par infection de spin, suivie de la poursuite des étapes de différenciation décrites ci-dessous. Enfin, l’efficacité de la transduction et les résultats de la différenciation ont été évalués à l’aide de l’analyse par cytométrie en flux et de l’analyse qPCR.
La figure 3 illustre la stratégie de contrôle appliquée pour trier les lymphocytes T CD4+ naïfs. Après avoir sélectionné la population cellulaire principale et les cellules singulet (comme le montrent les deux premières portes de la figure 3), les cellules FVD-CD4+ ont été contrôlées pour distinguer les cellules T CD4 polarisées en cellules Th17 de celles des APC. Enfin, l’IL-17A produite par les lymphocytes T CD4 représente l’efficacité de différenciation Th17, ce qui indique l’efficacité de knock-out. Le pourcentage de cellules mCherry positives reflète l’efficacité de l’infection rétrovirale, tandis que l’efficacité de l’inactivation est indiquée par le pourcentage de cellules IL-17A positives. Afin d’améliorer la viabilité cellulaire et de minimiser la durée du tri, les splénocytes ont été enrichis à l’aide d’un kit d’isolement de lymphocytes T CD4+ de souris, ce qui a permis d’obtenir une efficacité d’enrichissement supérieure à 90 %.
L’efficacité de l’infection par le rétrovirus, indiquée par la présence de cellules mCherry-positives, est généralement d’environ 40 % (Figure 4A). Bien que l’efficacité de l’infection puisse être augmentée par la concentration du virus, cette approche se fait au détriment d’une durée d’expérimentation prolongée et de coûts plus élevés. Dans nos expériences, des cellules infectées cultivées sans le cocktail de différenciation cellulaire Th17 ont servi de contrôle négatif de différenciation Th17, désigné comme Th0. Un ARNsg non ciblé a été utilisé comme témoin positif, appelé sgNT. Pour l’édition de gènes, nous avons utilisé l’ARNg ciblant le gène RORγt (sgRNA-Rorc), ce qui a considérablement réduit l’efficacité de la différenciation Th17 (Figure 4A). Cette intervention a également entraîné une diminution substantielle des niveaux d’expression de Rorc et d’IL-17a (Figure 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66966/66966fig1.jpg"> 
Figure 1 : Exemple de sous-clonage d’ARNsg dans un vecteur rétroviral et efficacité de transfection. Le vecteur pMX-U6-MCS a été utilisé comme construction initiale. L’échafaudage de l’ARNg, ainsi que les séquences de l’ARNsg (la partie orange) ciblant le site brouillé (A) et (B) le Rorc, ont été insérés en aval du promoteur U6 (la partie verte sous forme de section pour le séquençage avec des amorces U6). L’emplacement des amorces contenant de l’ARNsg et les sites des amorces de séquençage sont indiqués sous le vecteur circulaire. Les noms complets des abréviations sur le plasmide sont les suivants. Abréviations : AmpR = résistance à l’ampicilline, à la carbénicilline et aux antibiotiques apparentés ; LTR = répétition terminale longue ; MMLVψ = signal d’emballage du virus de la leucémie murine de Moloney ; gag = gène gag tronqué du virus de la leucémie murine de Moloney (MMLV) dépourvu du codon de départ. (C) Imagerie microscopique de mCherry dans des cellules Plat-E transfectées d’ADN plasmidique. Barre d’échelle : 500 px. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66966/66966fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66966/66966fig2.jpg"> 
Figure 2 : Illustration schématique du protocole. La veille de la transfection, la densité des cellules Plat-E doit être ajustée à une plage appropriée. Le lendemain (jour 0), effectuez la transfection et le remplacement du fluide 12 h plus tard. Le jour 1, triez et activez les lymphocytes T naïfs de souris exprimant Cas9. Par la suite (jour 2), récoltez le surnageant de culture contenant le virus et combinez-le avec les lymphocytes T activés pour la transduction rétrovirale. Les cellules infectées sont ensuite différenciées en cellules Th17 pendant 3 à 4 jours et analysées à l’aide de FACS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66966/66966fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66966/66966fig3.jpg"> 
Figure 3 : Stratégie de contrôle pour trier les lymphocytes T naïfs de CD4. Une coloration de surface a été effectuée sur les lymphocytes T CD4 enrichis pour marquer CD4, CD25, CD44 et CD62L. La stratégie de déclenchement employée était la suivante : initialement, les lymphocytes étaient bloqués en fonction des paramètres de diffusion vers l’avant et de diffusion latérale. Par la suite, des cellules uniques ont été identifiées à l’aide du FSC-H et du FSC-W. Les cellules CD4+CD25- ont ensuite été contrôlées pour exclure les cellules T régulatrices (Tregs). Enfin, des lymphocytes TCD44 faiblementCD62Lnaïfs ont été identifiés. Les lymphocytes T isolés naïfs CD4+ ont été prélevés pour des expériences ultérieures. Abréviations : FSC = diffusion vers l’avant ; SSC = diffusion latérale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66966/66966fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66966/66966fig4.jpg"> 
Figure 4 : Exemple de transduction réussie de lymphocytes T activés et de différenciation Th17. (A) L’efficacité de différenciation de Th17 est considérablement réduite, ce qui est modifié par l’ARNg RORγt (gating on mCherry+ IL-17a+population). (B) Expression de l’ARNm relatif à Rorγt et IL-17a dans Th0 (cellules infectées cultivées sans cocktail de différenciation cellulaire Th17), sgNT (sgRNA non ciblant) et sgRNA-Rorc (sgRNA ciblant le gène RORγt ). p &lt; 0,001 (test t de Student bilatéral non apparié ; les données sont présentées sous forme de moyenne ± MEB). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66966/66966fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Composants de réaction PCR</td>
			<td colspan="4">Programme PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Composant</td>
			<td>Volume (μL)</td>
			<td>Pas</td>
			<td>Intérimaire.</td>
			<td>Heure</td>
			<td>Cycle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 × Phanta Mix (Dye Plus)</td>
			<td>25</td>
			<td>1</td>
			<td>95 ºC</td>
			<td>3 minutes</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>jjH20</td>
			<td>20</td>
			<td>2</td>
			<td>95 ºC</td>
			<td>15 s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amorce-F (10 μM)</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>56 ºC</td>
			<td>15 s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Amorce-R (10 μM)</td>
			<td rowspan="2">2</td>
			<td rowspan="2">4</td>
			<td rowspan="2">72 ºC</td>
			<td rowspan="2">5 min 30 s</td>
			<td>Passez à l’étape 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 ×</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modèle (~30 ng)</td>
			<td>1</td>
			<td>5</td>
			<td>72 ºC</td>
			<td>Durée : 5 minutes</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>6</td>
			<td>12 ºC</td>
			<td>∞</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 1 : Composants de réaction PCR et programme PCR pour la construction de vecteurs d’ARNg.

Ciblage génique rétroviral médié par CRISPR/Cas9 pour l’étude de la différenciation Th17 in vitro

T helper cells that produce IL-17A, known as Th17 cells, play a critical role in immune defense and are implicated in autoimmune disorders. CD4 T cells ...

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