Name: Identification guidée par bioessai de produits naturels pour le biocontrôle par chromatographie sur couche mince-bioautographie directe (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-26T14:35:00.000+00:00
Duration: 4 min 52 s
Description: Découvrez la bioautographie directe sur chromatographie en couche mince pour identifier des produits naturels antifongiques contre Sclerotinia sclerotiorum. Cette méthode permet de sélectionner de nouveaux biopesticides issus de microbes du sol.

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Nous remercions Agriculture et Agroalimentaire Canada pour le financement grâce auquel cette recherche a été rendue possible (projets J-001843 et J-002021). Nous remercions Brett van Heyningen d’avoir filmé le contenu vidéo de ce protocole. Nous tenons également à remercier les anciens étudiants des cycles supérieurs (Jennifer Vacon et Mark Nabuurs) pour leurs idées sur les méthodes décrites dans ce manuscrit.

Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.
1. Sélection des candidats au biocontrôle microbien
<ol><li>À l’aide d’essais sur plaque de compétition, sélectionner les isolats microbiens qui présentent un antagonisme contre l’agent pathogène d’intérêt. REMARQUE : Neuf isolats de Bacillus qui présentaient un antagonisme contre S. sclerotiorum ont été sélectionnés, y compris les espèces Bacillus atrophaeus, mojavensis et subtilis , pour démontrer ce protocole.</li>
</ol>2. Préparation des supports
<ol><li>Préparez la gélose au dextrose de pomme de terre (PDA) en dissolvant 39 g de milieu par litre d’eau.</li>
	<li>Préparez la gélose Pseudomonas F en ajoutant 45 g de média par litre d’eau.</li>
	<li>Préparez le bouillon de dextrose de pomme de terre (PDB) avec 1% d’agar en ajoutant 24 g de milieu et 0,24 g d’agar par litre d’eau.</li>
	<li>Préparez le bouillon levure-glucose-manganèse (YGM). Créer une solution tampon composée de 2,5 g de KH2PO4 et de 2,5 g de K2HPO4 dans 100 mL d’eau, ainsi qu’une solution saline composée de 0,58 g de MnSO4. H20, 0,5 g de NaCl et 0,05 g de FeSO4,7H 20 dans 100 mL d’eau.<ol><li>Ensuite, ajoutez 1 g d’extrait de levure, 1,25 g de dextrose, 400 ml d’eau, 5 ml de solution tampon, 5 ml de solution saline et 90 ml d’eau pour vous assurer que les sels métalliques ne précipitent pas en solution.</li>
	</ol></li>
	<li>Stérilisez le milieu à l’autoclave, versez la gélose dans des plaques de Pétri de 100 x 15 mm et laissez refroidir à température ambiante avant utilisation.</li>
</ol>3. Préparation des agents pathogènes
<ol><li>Cultivez cinq plaques de Sclerotinia sclerotiorum sur du PDA (préparé à l’étape 2.1) et incubez à 25 °C pendant 3 jours.</li>
</ol>4. Préparation d’extraits de produits naturels
<ol><li>Cultiver chaque isolat bactérien sur de la gélose Pseudomonas F (préparée à l’étape 2.2) et cultiver jusqu’à ce que des colonies individuelles soient observées.</li>
	<li>Sous-culture de colonies bactériennes uniques dans 25 mL de milieu YGM dans une centrifugeuse ou des tubes de culture et incubation en secouant pendant 3 jours.</li>
	<li>Transférez 5 mL d’aliquotes de chaque extrait dans 1 L de YGM et incubez dans les mêmes conditions pendant encore 3 jours.</li>
	<li>Centrifuger chaque culture à 3000 x g pendant 15 min à 25 °C pour granuler les cellules.</li>
	<li>Décanter et laver trois fois le surnageant avec de l’acétate d’éthyle pour extraire les métabolites du milieu de culture.</li>
	<li>Combinez et séchez la couche d’acétate d’éthyle de chacun en utilisant l’évaporation rotative.</li>
	<li>Dissoudre à nouveau l’extrait dans un minimum de méthanol, le transférer dans un petit flacon à scintillation et le sécher à nouveau par évaporation rotative. REMARQUE : Si l’extrait sèche en une matière huileuse ou résineuse, lyophiliser le matériau pour obtenir une poudre sèche qui peut être pesée avec précision.</li>
</ol>5. Préparation de la plaque CCM
<ol><li>Préparez l’assiette TLC de 20 cm x 20 cm en traçant une ligne à 2 cm du bas et à 2 cm du haut de l’assiette. Sur la ligne du bas, placez neuf points à 2 cm de distance. Au-dessus de la ligne du haut, placez quatre points à 4 cm de distance.</li>
	<li>Dissoudre 5 mg de chaque extrait dans 15 μL de méthanol et appliquer 5 μL de chaque extrait sur les neuf points marqués sur la ligne du bas à l’aide d’une pipette. Laissez sécher chaque point d’extrait sur la plaque TLC et appliquez une autre aliquote de 5 μL au même endroit. Répétez l’opération jusqu’à ce que tout le matériau soit chargé sur la plaque TLC.</li>
	<li>Mettre la plaque de CCM dans un réservoir de développement à l’aide d’une solution 1:2 de dichlorométhane et de méthanol jusqu’à ce que le solvant atteigne la ligne indiquée à 2 cm du haut de la plaque (environ 45 min).</li>
	<li>Une fois développé, retirez la plaque CCM et appliquez une série de contrôles positifs sur les quatre points marqués au-dessus de la ligne de solvant. Quatre concentrations du même témoin sont utilisées. Pour S. scl., 0,5 μg/mL, 5 μg/mL, 50 μg/mL et 500 μg/mL d’hygromycine B sont des témoins positifs.</li>
	<li>Avant que tout le solvant ne s’évapore de la plaque, placez-le dans une boîte de plaque TLC stérilisée à l’éthanol.</li>
</ol>6. Essai de bioautographie directe
<ol><li>Autoclave les matériaux à utiliser dans l’essai (composants en verre du pulvérisateur de chromatographie, spatule métallique, quatre feuilles d’essuie-tout, cellulose ou papier filtre, eau et support) dans un grand bécher recouvert de papier d’aluminium. REMARQUE : Les matériaux en papier (essuie-tout, papier cellulosique) doivent être enveloppés dans du papier d’aluminium pour éviter d’être mouillés dans l’autoclave.</li>
	<li>Connectez une source d’air, un manomètre et un pulvérisateur de chromatographie à l’aide d’un tube en PTFE stérilisé à l’éthanol. Connectez un filtre HEPA entre le pulvérisateur de chromatographie et le manomètre.</li>
	<li>Prélever le tapis mycélien des cinq plaques pathogènes à l’aide de la spatule métallique stérile dans un tube à centrifuger de 50 mL à l’aide d’une spatule stérile. REMARQUE : Utilisez un petit volume de bouillon liquide pour aider à déloger le mycélium si nécessaire, et transférez avec une pipette stérile.</li>
	<li>Ajouter 25 mL de PDB amendé avec de la gélose et des billes de verre stériles dans le tube de centrifugation de 50 mL et agiter pendant 5 minutes pour briser le tapis mycélien.</li>
	<li>Transférez la suspension mycélienne dans un pulvérisateur de chromatographie à l’aide d’une seringue stérile avec une pointe d’aiguille pour vous assurer que de gros morceaux de mycélium n’obstrueront pas le pulvérisateur de chromatographie.</li>
	<li>Placez les plaques de CCM précédemment développées sur des serviettes en papier stériles dans une hotte à flux laminaire pour réduire le contact des mains avec la plaque lors de l’application de la suspension du support.</li>
	<li>Augmentez la pression d’air à environ 4 bars et appliquez trois couches de suspension sur la plaque TLC, permettant à la plaque de sécher complètement entre les applications. REMARQUE : Trois couches se sont avérées être la quantité optimale. Moins que cela, et l’agent pathogène n’a pas assez de milieu pour se développer. De plus, le milieu est trop épais, ce qui peut ne pas permettre le contact des agents pathogènes avec les métabolites actifs.</li>
	<li>Ajoutez 500 ml d’eau stérile dans une boîte à plaques en plastique stérilisé et placez des feuilles de cellulose pliées stérilisées ou du papier filtre de chaque côté pour retenir l’humidité.</li>
	<li>Placez la plaque de test terminée sur quatre boîtes de Pétri vides dans la boîte.</li>
	<li>Incuber le test pendant 3 jours à 1 semaine ou jusqu’à ce qu’une couche uniforme de mycélium se développe uniformément sur la plaque TLC, sauf autour des témoins positifs et de la zone d’inhibition (ZOI).</li>
</ol>7. Analyse par chromatographie liquide par spectrométrie de masse
<ol><li>Imagez le test terminé à l’aide de la photographie.</li>
	<li>Calculez le facteur de rétention pour chaque zone d’inhibition en divisant la distance entre la ligne inférieure et le ZOI par la distance entre la ligne inférieure et la ligne supérieure.</li>
	<li>Grattez la silice des zones d’inhibition et placez-la dans des tubes de microcentrifugation.</li>
	<li>Ajoutez 500 μL de méthanol dans chaque tube et vortex pour extraire les métabolites de la silice.</li>
	<li>Centrifuger à 8 500 x g à 20 °C pendant 10 min et transférer le surnageant dans un petit flacon.</li>
	<li>S’évaporer à sec par évaporation rotative ou sous un courant d’azote.</li>
	<li>Remettre l’extrait en suspension dans 50 μL de méthanol dans un flacon LC.</li>
	<li>Analyser les métabolites dans la zone d’inhibition par LC-MS et les comparer aux métabolites de l’extrait brut afin de déterminer quels métabolites de l’extrait brut sont responsables de l’inhibition de l’agent pathogène16.</li>
	<li>À l’aide du genre et de l’espèce du micro-organisme source et des masses identifiées dans le ZOI, effectuez une recherche dans la littérature et les bases de données pertinentes telles que Antibase et le Dictionary of Natural Products pour identifier les métabolites.</li>
</ol>

Utilisation du test de bioautographie TLC-Direct pour identifier les produits naturels pour la biolutte

<ol><li>Fisher, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+fungal+threats+to+animal%2C+plant+and+ecosystem+health%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Emerging fungal threats to animal, plant and ecosystem health.</a> Nature. 484 (7393), 186-194 (2012).</li>
<li>Savary, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+burden+of+pathogens+and+pests+on+major+food+crops%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Ecol+Evol%22%5BJournal%5D)">The global burden of pathogens and pests on major food crops.</a> Nat Ecol Evol. 3 (3), 430-439 (2019).</li>
<li>Lin, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resilience+in+agriculture+through+crop+diversification%3A+Adaptive+management+for+environmental+change%5BTitle%5D)+AND+%22BioSci%22%5BJournal%5D)">Resilience in agriculture through crop diversification: Adaptive management for environmental change.</a> BioSci. 61 (3), 183-193 (2011).</li>
<li>Piquerez, S. J., Harvey, S. E., Beynon, J. L., Ntoukakis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+crop+disease+resistance%3A+Lessons+from+research+on+arabidopsis+and+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Improving crop disease resistance: Lessons from research on arabidopsis and tomato.</a> Front Plant Sci. 5, 671(2014).</li>
<li>Damalas, C., Koutroubas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+and+recent+developments+in+biopesticide+use%5BTitle%5D)+AND+%22Agriculture%22%5BJournal%5D)">Current status and recent developments in biopesticide use.</a> Agriculture. 8 (1), 13(2018).</li>
<li>Syed Ab Rahman, S. F., Singh, E., Pieterse, C. M. J., Schenk, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+microbial+biocontrol+strategies+for+plant+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Emerging microbial biocontrol strategies for plant pathogens.</a> Plant Sci. 267, 102-111 (2018).</li>
<li>Tudi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+routes+and+health+risks+associated+with+pesticide+application%5BTitle%5D)+AND+%22Toxics%22%5BJournal%5D)">Exposure routes and health risks associated with pesticide application.</a> Toxics. 10 (6), 335(2022).</li>
<li>Santos, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacillus+thuringiensis%3A+From+biopesticides+to+anticancer+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Bacillus thuringiensis: From biopesticides to anticancer agents.</a> Biochimie. 192, 83-90 (2022).</li>
<li>Kumar, J., Ramlal, A., Mallick, D., Mishra, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+some+biopesticides+and+their+importance+in+plant+protection+for+commercial+acceptance%5BTitle%5D)+AND+%22Plants%22%5BJournal%5D)">An overview of some biopesticides and their importance in plant protection for commercial acceptance.</a> Plants. 10 (6), 1185(2021).</li>
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<li>Ayilara, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biopesticides+as+a+promising+alternative+to+synthetic+pesticides%3A+A+case+for+microbial+pesticides%2C+phytopesticides%2C+and+nanobiopesticides%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biopesticides as a promising alternative to synthetic pesticides: A case for microbial pesticides, phytopesticides, and nanobiopesticides.</a> Front. Microbiol. 14, 1040901(2023).</li>
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<li>Zhao, Z., Liu, D., Ruan, L., Wang, T., Liang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+mechanism+of+Bacillus+amyloliquefaciens+SC-B15+and+its+application+in+cereal+mildewproof+and+grape+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Biosci%22%5BJournal%5D)">Antifungal mechanism of Bacillus amyloliquefaciens SC-B15 and its application in cereal mildewproof and grape preservation.</a> Food Biosci. 56, 103287(2023).</li>
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<li>Choma, I., Jesionek, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLC-direct+bioautography+as+a+high+throughput+method+for+detection+of+antimicrobials+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Chromatography%22%5BJournal%5D)">TLC-direct bioautography as a high throughput method for detection of antimicrobials in plants.</a> Chromatography. 2 (2), 225-238 (2015).</li>
<li>Attia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin-layer+chromatography-bioautographic+method+for+the+detection+of+arginase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Sep+Sci%22%5BJournal%5D)">Thin-layer chromatography-bioautographic method for the detection of arginase inhibitors.</a> J Sep Sci. 43 (12), 2477-2486 (2020).</li>
<li>Legerska, B., Chmelova, D., Ondrejovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLC-bioautography+as+a+fast+and+cheap+screening+method+for+the+detection+of+alpha-chymotrypsin+inhibitors+in+crude+plant+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">TLC-bioautography as a fast and cheap screening method for the detection of alpha-chymotrypsin inhibitors in crude plant extracts.</a> J Biotechnol. 313, 11-17 (2020).</li>
<li>Agatonovic-Kustrin, S., Doyle, E., Gegechkori, V., Morton, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+thin-layer+chromatography+linked+with+%28bio%29assays+and+FTIR-ATR+spectroscopy+as+a+method+for+discovery+and+quantification+of+bioactive+components+in+native+Australian+plants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Biomed+Anal%22%5BJournal%5D)">High-performance thin-layer chromatography linked with (bio)assays and FTIR-ATR spectroscopy as a method for discovery and quantification of bioactive components in native Australian plants.</a> J Pharm Biomed Anal. 184, 113208(2020).</li>
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</ol>

La Dre Susan Boyetchko est décédée avant la soumission de ces travaux (8 février 2023). Tous les autres auteurs ont déclaré n’avoir aucun conflit d’intérêts.

TLC-DB est un outil de recherche précieux et bien établi sur la NP et une alternative simple et peu coûteuse aux méthodes d’isolement guidées par biodosage sur microplaques17. Il nécessite un minimum de temps et de ressources matérielles par rapport aux tests sur microplaques, qui nécessitent une séparation des métabolites à l’aide de techniques de chromatographie liquide. Il s’agit d’un test très polyvalent qui peut être utilisé pour détecter les NP antibactériens, antifongiques, antiparasitaires et antioxydants en plus des inhibiteurs d’enzymes 18,19,20,21,22,23. Bien qu’elle soit le plus souvent utilisée pour détecter et identifier les composés phytochimiques bioactifs, la même méthode peut être appliquée aux nanoparticules bactériennes, comme l’explore le présent protocole18. De plus, le protocole peut être optimisé pour être utilisé avec une variété de sources de NP et d’agents pathogènes cibles afin de faciliter la découverte et l’évaluation de nouvelles NP bioactives.
Le milieu utilisé pour la croissance bactérienne et le solvant utilisé pour l’extraction peuvent avoir un impact considérable sur les résultats de la découverte de produits naturels. Les milieux utilisés dans ce protocole sont optimisés pour les bactéries qui produisent des lipopeptides cycliques, y compris Pseudomonas et Bacillus spp. Mais d’autres milieux et sources de nutriments doivent être pris en compte si l’on explore d’autres genres. On peut choisir de compléter la CCM-DB en utilisant le même micro-organisme cultivé dans une gamme de milieux pour évaluer toute l’étendue de la diversité des métabolites d’un isolat ou d’utiliser des conditions de croissance identiques pour une plus grande gamme d’isolats. Le choix du solvant d’extraction impacte également les produits naturels détectés. Il est généralement admis que la plupart des NP bioactifs ont une polarité faible à modérée, ce qui fait de l’acétate d’éthyle un choix approprié en raison de son faible point d’ébullition, ce qui le rend facile à éliminer. Cependant, si l’on souhaite également examiner les fractions polaires et non polaires, de multiples extractions avec d’autres solvants peuvent être effectuées. Alternativement, l’extrait acellulaire peut être lyophilisé et utilisé dans le test pour voir tous les métabolites libérés dans le milieu. Cependant, il sera souvent nécessaire de charger plus de matériau sur la plaque CCM pour tenir compte des composants du milieu séché dans le matériau lyophilisé. De même, si cette méthode est utilisée avec un agent pathogène différent, tel que l’inoculum, le milieu utilisé et les conditions d’incubation doivent être optimisés pour obtenir les 5 plaques de gélose de mycélium utilisées pour le dosage TLC-DB.
La TLC-DB est avantageuse par rapport à la bioautographie de contact et d’immersion, car elle utilise la couche la plus mince de gélose et d’inoculum, minimisant ainsi la dépendance à la diffusion des métabolites dans la couche de gélose, ce qui peut permettre à de plus petites quantités de produits naturels d’induire l’inhibition des agents pathogènes17. Des résultats précédemment publiés à l’aide de méthodes bioautographiques de la CCM ont utilisé une suspension de spores de l’agent pathogène pour compléter le test17. Bien que cela permette un contrôle précis de la concentration en suspension, il peut être extrêmement difficile et long d’induire la sporulation de certains champignons24. Cette modification simplifie grandement l’essai et permet de le compléter à l’aide d’agents pathogènes fongiques qui sont difficiles à sporuler et qui auraient pu être évités auparavant par cette méthode.
La masse d’extrait bactérien utilisée dans le test peut avoir un impact sur les résultats. Si trop peu d’extrait est appliqué sur la plaque CCM, il est possible que la concentration inhibitrice minimale d’un composé actif ne soit pas dépassée et que la bioactivité ne soit pas détectée. Par conséquent, dans certains cas, et comme le montrent les figures 1 et 2, il vaut la peine de surcharger la plaque CCM, compromettant la séparation pour la capacité de détecter facilement l’activité. De même, la charge d’agents pathogènes pulvérisée sur la plaque ne doit pas être trop faible, car il n’y aura pas assez de milieu appliqué pour favoriser la croissance des agents pathogènes. Cette méthode peut être facilement ajustée pour s’adapter à une variété d’extraits bactériens et d’agents pathogènes, et les quantités d’extrait microbien et d’inoculum décrites dans le protocole ont permis de détecter la bioactivité de plusieurs agents pathogènes et extraits microbiens. Si aucune zone d’inhibition n’est observée à la fin de l’essai, cela peut indiquer l’un des éléments suivants. Premièrement, les métabolites actifs peuvent ne pas être présents dans l’extrait appliqué en raison de milieux incompatibles utilisés pour la croissance bactérienne ou en raison de l’activité des bactéries qui n’est pas le résultat de la production de NP. Un test de diffusion discale avec l’extrait peut être effectué pour confirmer ou infirmer l’existence de NP actives dans l’extrait. Si l’essai de diffusion sur disque ne montre aucune suppression d’agents pathogènes, d’autres milieux peuvent être testés pour déterminer si d’autres conditions produisent des NP bioactifs. Si le test de diffusion sur disque indique que l’extrait supprime l’agent pathogène, il peut être nécessaire d’appliquer une plus grande masse d’extrait bactérien sur la plaque CCM, auquel cas un autre test peut être tenté.
La comparaison des métabolites du ZOI à l’extrait brut est essentielle pour identifier les NP actifs. Dans le dosage, les métabolites de l’extrait brut peuvent être métabolisés ou modifiés par l’agent pathogène, ce qui peut être observé par LC-MS. Ainsi, seuls les métabolites présents à la fois dans l’extrait brut et dans le ZOI peuvent être considérés comme des NP produits par la bactérie à l’étude. S’il n’est pas possible d’établir une corrélation entre les métabolites extraits du ZOI et les métabolites de l’extrait brut, une plaque de CCM peut être préparée, comme décrit à l’étape 5. Sans terminer l’essai de bioautographie, extraire les métabolites de la plaque CCM au même temps de rétention que celui observé dans l’essai terminé. Cela devrait permettre une corrélation plus facile entre les métabolites des ZOI et l’extrait brut, provoquant la suppression des agents pathogènes.
L’un des inconvénients de la TLC-DB est que la résolution de la TLC est considérablement inférieure à celle obtenue lors de l’utilisation des techniques traditionnelles de criblage de micropuits, qui nécessitent une chromatographie liquide pour la séparation. Ainsi, il est courant que plusieurs métabolites existent dans la zone d’inhibition où certains métabolites peuvent ne pas contribuer à la bioactivité. Ce problème peut être causé par la pratique consistant à surcharger la plaque CCM pour observer plus clairement la bioactivité. Des travaux récents ont été publiés à l’aide de la technologie TLC haute performance (HP-TLC), qui améliore considérablement la résolution et peut permettre l’automatisation du développement TLC, ce qui est autrement impossible avec l’utilisation de la TLC conventionnelle 14,21,22,23. De plus, des plaques peuvent être développées dans une deuxième dimension (2D-TLC) pour séparer davantage les métabolites ayant des temps de rétention similaires. Cela étant dit, il convient d’évaluer si l’augmentation du temps et du coût des matériaux est un compromis valable pour une résolution accrue obtenue avec HP- et 2D-TLC25.

Les agents pathogènes fongiques de l’agriculture causent des pertes importantes de qualité et de rendement des cultures dans le monde entier, contribuant aux défis économiques et d’approvisionnement d’un système de production alimentaire mondial stable 1,2. Les dommages causés par les agents pathogènes peuvent être évités en sélectionnant des cultivars résistants aux infections et en utilisant des systèmes de gestion intégrée des cultures, y compris la rotation des cultures et les pratiques de gestion des terres pour supprimer la prolifération des agents pathogènes 3,4. Bien que ces méthodes réduisent les dommages aux cultures, les pesticides chimiques sont généralement utilisés en tandem pour tuer activement les structures reproductrices fongiques dans le champ et prévenir davantage les dommages et les réductions de rendement. Bien qu’efficace, l’utilisation de pesticides chimiques présente de nombreux inconvénients, notamment des dommages aux écosystèmes environnants, une baisse de la fertilité des sols, des risques associés pour la santé humaine et le développement d’une résistance aux agents pathogènes, ce dernier entraînant des doses plus élevées de pesticides chaque année 5,6,7.
Les produits de lutte antiparasitaire et pathogène à base microbienne ont longtemps été considérés comme des alternatives potentielles ou des compléments aux pesticides synthétiques. Depuis le début des années 1900, Bacillus thuringiensis a été largement utilisé pour lutter contre les ravageurs et les agents pathogènes agricoles comme traitement des semences, comme pulvérisation foliaire et dans le traitement direct des sols8. Ces produits ont été nommés biopesticides et sont caractérisés comme des micro-organismes ou des produits biochimiques naturels qui peuvent tuer, supprimer ou réduire la vigueur d’un ravageur ou d’un agent pathogène cible. Les biopesticides peuvent contrôler la croissance d’un agent pathogène par divers mécanismes, mais le plus souvent par la sécrétion de métabolites secondaires9. Les métabolites secondaires, souvent appelés produits naturels, ne sont pas impliqués dans le métabolisme primaire, mais sont produits comme un avantage évolutif pour surpasser les autres micro-organismes10.
Les biopesticides offrent de nombreux avantages par rapport à leurs homologues synthétiques. Ils présentent un faible risque de toxicité pour l’environnement, la faune et les humains par rapport aux produits de lutte antiparasitaire synthétiques 9,10. Étant donné que la plupart des biopesticides existent naturellement dans l’environnement depuis des millénaires, les voies de biodégradation des métabolites microbiens existent dans l’environnement, limitant la possibilité de contamination du sol ou de l’écosystème et réduisant les temps de séjour qui contribuent à la destruction de l’environnement des pesticides synthétiques11. De plus, de nombreux biopesticides utilisés pour atténuer l’infection par des agents pathogènes présentent également des propriétés favorisant la croissance des plantes, ce qui peut augmenter la biodisponibilité des nutriments et induire une résistance systémique des plantes12.
Le plus souvent, les biopesticides sont appliqués sous forme d’inoculum microbien, et les NP sont sécrétés par des micro-organismes vivants in situ12,13. Dans un tel cas, l’identification de la source de l’activité d’un biopesticide est d’une grande valeur. Cela donne un aperçu du mécanisme d’action du biopesticide, aide à monter un dossier pour la protection d’un micro-organisme avec un brevet et peut avoir un impact scientifique significatif si leurs structures sont nouvelles. Plus important encore, cependant, l’identification de la source bioactive éclaire les possibilités de formulation d’un biopesticide en aval. Si le NP lui-même est actif, on peut utiliser le micro-organisme comme une usine de biomolécules pour la production de biopesticides à grande échelle. De plus, de nombreuses nanoparticules qui ont été explorées pour la lutte biologique ont également des applications potentielles en médecine humaine, ce qui les rend encore plus précieuses sur le plan économique8.
Les tests de chromatographie sur couche mince couplée à la bioautographie directe (TLC-DB) sont une méthode simple et peu coûteuse pour l’isolement et l’identification des métabolites biopesticides guidés par la bioactivité. Bien que la technique soit couramment utilisée pour séparer les tests de bioactivité des composés phytochimiques des extraits de plantes brutes, elle présente également un grand potentiel pour l’analyse des extraits microbiens14. La TLC permet une séparation rapide et peu coûteuse des NP dans un extrait microbien brut, et après enrobage d’une suspension d’agent pathogène dans un milieu, les zones contenant des métabolites actifs sont facilement visualisées. Ces zones peuvent être grattées de la plaque et extraites pour une analyse chimique par chromatographie liquide à ultra-haute performance couplée à la spectrométrie de masse (UPLC-MS) afin d’identifier les métabolites connus. Les métabolites qui ne correspondent pas aux composés précédemment signalés peuvent être isolés en plus grandes quantités par chromatographie liquide pour subir des études d’élucidation de structure à l’aide de techniques telles que la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire et la cristallographie aux rayons X15.
Cet article décrit un système modèle pour la découverte et l’identification des nanoparticules de biopesticides à l’aide de la TLC-DB avec Bacillus spp. et l’agent pathogène agricole Sclerotinia sclerotiorum. La figure 1 fournit une vue d’ensemble schématique de la procédure TLC-DB.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66967/66967fig01.jpg"> Figure 1 : Vue d’ensemble schématique des étapes 4 à 7 de la procédure de TLC-DB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66967/66967fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td>0,5-5 mL Pipette monocanal</td><td>VWR</td><td>CA11020-004</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pulvérisateur de chromatographie sur couche mince</td><td>VWR</td><td>KT422530-0010</td><td></td></tr><tr><td>100 x 15 mm Plaques de Pétri</td><td>VWR</td><td>89038-970</td><td></td></tr><tr><td>100-1000 & micro ; Pointes de pipette L</td><td>VWR</td><td>76322-164</td><td></td></tr><tr><td>100-1000 & micro ; Pipette monocanal L</td><td>VWR</td><td>76169-240</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger stériles de 15 mL</td><td>VWR</td><td>CA21008-918</td><td></td></tr><tr><td>Flacon en verre de 1 L</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS13951L</td><td>Doit être sans danger pour l’autoclave</td></tr><tr><td>Seringue stérile de 1 mL avec aiguille</td><td>Thomas Scientific</td><td>8935L75</td><td>Une aiguille détachable est recommandée</td></tr><tr><td>Tube de microcentrifugation de 2 mL</td><td>VWR</td><td>87003-298</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger stériles de 50 mL</td><td>VWR</td><td>CA21008-940</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette de 5 mL</td><td>VWR</td><td>CA11020-008</td><td></td></tr><tr><td>Flacons à scintilation de 7 mL VWR</td><td></td><td>76538-962</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol à 95 %</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A412-500</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Cole-Parmer</td><td>UZ-01850-34</td><td>8 L, 115 VAC</td></tr><tr><td>Gélose bactériologique</td><td>VWR</td><td>97064-336</td><td></td></tr><tr><td>bin</td><td>Thomas Scientific</td><td>1216H91</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>VWR</td><td>BDH9230-500G</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorométhane &ge ; 99,8 %</td><td>ACS VWR</td><td>BDH1113-4LG</td><td></td></tr><tr><td>Acétate d’éthyle &ge ; 99.8 % ACS</td><td>VWR</td><td>BDH1123-4LG</td><td></td></tr><tr><td>Papier filtre</td><td>VWR</td><td>CA28297-846</td><td></td></tr><tr><td>Billes de broyage</td><td>VWR</td><td>12621-148</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycine B</td><td>VWR</td><td>CA80501-074</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de fer Heptahydrate</td><td>VWR</td><td>97061-542</td><td></td></tr><tr><td>Hotte à flux laminaire</td><td>CleanTech</td><td>1000-6-A</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS</td><td>Eaux</td><td>LITR10064178</td><td>système TQD UPLC/MS/MS</td></tr><tr><td>Lyophiliseur</td><td>Labconco</td><td>700201000</td><td>Collecteur de température&nbsp ;-50 &deg ; C&nbsp ;</td></tr><tr><td>Sulfate de manganèse hydraté</td><td>VWR</td><td>CAAA10807-14</td><td></td></tr><tr><td>méthanol &ge ; 99,8 % ACS</td><td>VWR</td><td>BDH2018-5GLP</td><td></td></tr><tr><td>Essuie-tout</td><td>VWR</td><td>89402-824</td><td></td></tr><tr><td>Pomme de terre Dextrose Agar</td><td>VWR</td><td>CA90000-758</td><td></td></tr><tr><td>Bouillon de dextrose de pomme de terre</td><td>VWR</td><td>CA90003-494</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potsium dibasique</td><td>VWR</td><td>470302-246</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potsasium monobasique</td><td>VWR</td><td>470302-252</td><td></td></tr><tr><td>Manomètre 6mm Union Droite 0-10 bar (0-145 psi)</td><td>Tameson</td><td>F25U6</td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas F Agar</td><td>VWR</td><td>90003-352</td><td>Aussi connu sous le nom de Flo Agar</td></tr><tr><td>PTFE Tubing</td><td>Sigma Aldrich</td><td>58697-U</td><td>1/16 pouce de diamètre intérieur&nbsp ;</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>VWR</td><td>BDH9286-500G</td><td></td></tr><tr><td>Spatule</td><td>VWR</td><td>82027-490</td><td></td></tr><tr><td>Boucles d’inoculation stériles avec aiguille</td><td>VWR</td><td>76534-512</td><td></td></tr><tr><td>Papier d’aluminium</td><td>Thomas Scientific</td><td>1086F24</td><td>Peut être acheté au supermarché</td></tr><tr><td>TLC Silica Gel 60 RP-18 F254S 25 Plaques de verre 20 X 20 cm</td><td>Thomas Scientific</td><td>1205Q12</td><td></td></tr><tr><td>Pompe à vide</td><td>Labconco</td><td>1472100</td><td>98 L/min</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>76549-928</td><td>Doit accueillir des tubes à centrifuger de 15 mL et 50 mL</td></tr><tr><td>Whatman in-line HEPA-VENT</td><td>Millipore Sigma</td><td>WHA67235000</td><td>10 filtres, entrée/sortie</td></tr> 1/4 à 3/8 pouce <tr><td>VWR</td><td>97063-370</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

identification guidée par bioessai de produits naturels pour le biocontrôle par chromatographie sur couche mince-bioautographie directe

Bioassay-Guided Identification of Natural Products for Biocontrol by Thin Layer Chromatography-Direct Bioautography

La chromatographie sur couche mince couplée à la bioautographie directe (TLC-DB) est un essai biologique bien établi utilisé pour séparer et identifier les produits naturels (NP) qui sont antagonistes contre un agent pathogène cible. Il s’agit d’une option rapide, peu coûteuse et simple pour l’isolement et l’identification des NP guidés par essai biologique qui repose sur la séparation par CCM associée à l’application directe d’un agent pathogène cible pour examiner la bioactivité. Il est généralement utilisé pour l’analyse d’extraits de plantes bioactives, détectant l’activité inhibitrice contre les bactéries, les champignons et les enzymes. Cela étant dit, il a un grand potentiel pour la découverte de NP bactériennes, en particulier pour évaluer les NP bactériennes contre les agents pathogènes agricoles pertinents, ce qui est précieux pour la découverte et le développement de nouveaux biopesticides pour l’industrie agricole. De plus, il s’agit d’un protocole accordable qui pourrait être appliqué à d’autres pathogènes cibles ou sources de NP dans les programmes de recherche concernant la découverte et l’identification de composés bioactifs. Dans cet article, nous décrivons un système modèle permettant de découvrir et d’identifier les nanoparticules de biopesticides à l’aide de TLC-DB avec Bacillus spp. et l’agent pathogène agricole Sclerotinia sclerotiorum.

Lors de la séparation des extraits microbiens par CCM, les métabolites doivent être dispersés verticalement le long de la plaque CCM. Sous la lumière visible, il peut être difficile de voir les métabolites qui n’absorbent pas dans la gamme de la lumière visible. Ainsi, l’imagerie sous lumière UV peut aider à visualiser la séparation des métabolites, comme le montrent les figures 2A et B. Après la période d’incubation, l’agent pathogène devrait sembler se développer uniformément sur toute la plaque, à l’exception des témoins positifs et des zones d’inhibition où résident les métabolites actifs, illustrés à la figure 2C.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66967/66967fig02v2.jpg"> Figure 2 : Séparation des extraits microbiens par CCM. (A) Plaque CCM développée contenant neuf extraits de Bacillus imagés sous lumière visible et (B) sous une lumière UV de 320 nm avant l’application d’inoculum fongique. (C) Essai de bioautographie terminé avec croissance des agents pathogènes observée sur la plaque, sauf là où la croissance est inhibée autour des témoins positifs, et ZOI de chaque extrait. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66967/66967fig02largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Les métabolites extraits des zones d’inhibition sont analysés par LC-MS et comparés à l’extrait brut pour déterminer les NP responsables de l’antagonisme contre l’agent pathogène. Les métabolites correspondants doivent avoir le même temps de rétention et les mêmes espèces d’ions moléculaires pour être considérés comme compatibles. Une fois les métabolites actifs identifiés, la culture bactérienne peut être cultivée en vrac pour isoler les métabolites actifs d’intérêt pour la chimie structurale ou l’étude biologique.

Nous décrivons l’utilisation de la chromatographie sur couche mince, du test de bioautographie directe et de la chromatographie liquide-spectrométrie de masse pour identifier les produits naturels microbiens qui présentent un antagonisme contre les agents pathogènes fongiques, en utilisant l’agent pathogène Sclerotinia sclerotiorum et les isolats biopesticides de Bacillus comme système modèle.

Identification guidée par bioessai de produits naturels pour le biocontrôle par chromatographie sur couche mince-bioautographie directe

Thin layer chromatography-direct bioautography (TLC-DB) is a well-established bioassay used to separate and identify natural products (NPs) that are ...

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