Name: Protocole optimisé pour les Swiss Rolls intestinaux et la coloration immunofluorescente des tissus inclus dans la paraffine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Apprenez la technique du Swiss roll et la coloration immunofluorescente pour l'étude de l'intestin de souris. Cette méthode permet de visualiser toutes les régions intestinales dans un seul bloc de paraffine avec des résultats reproductibles.

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Cette étude a été financée par les subventions K01 DK121869 des National Institutes of Health (NIH) à l’ACE et cette publication a été financée en partie par les GM132055 T32 (RME), F31 DK139736 (SAD), T32 DK124191 (SAD), TL1 TR001451 (RS), UL1 TR001450 (RS) et les subventions HCS cornerstone à SAD & RS. Ce travail a été soutenu par des fonds de démarrage de l’Université médicale de Caroline du Sud (MUSC) à l’ACE et a été soutenu par le MUSC Digestive Disease Research Core Center (P30 DK123704) et le COBRE in Digestive and Liver Disease (P20 GM120475). L’imagerie a été réalisée à l’aide de la carotte d’imagerie cellulaire et moléculaire de MUSC.

Méthode efficace du Swiss Roll pour une immunocoloration de haute qualité du tissu intestinal

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<li>Hayashi, Y., Koike, M., Matsutani, M., Hoshino, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+fixation+time+and+enzymatic+digestion+on+immunohistochemical+demonstration+of+bromodeoxyuridine+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochemis%22%5BJournal%5D)">Effects of fixation time and enzymatic digestion on immunohistochemical demonstration of bromodeoxyuridine in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> J Histochem Cytochemis. 36 (5), 511-514 (1988).</li>
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<li>Han, B., Qi, S., Hu, B., Luo, H., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tgf-beta+i+promotes+islet+beta-cell+function+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tgf-beta i promotes islet beta-cell function and regeneration.</a> J Immunol. 186 (10), 5833-5844 (2011).</li>
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<li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cd36+inhibits+beta-catenin%2Fc-myc-mediated+glycolysis+through+ubiquitination+of+gpc4+to+repress+colorectal+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Cd36 inhibits beta-catenin/c-myc-mediated glycolysis through ubiquitination of gpc4 to repress colorectal tumorigenesis.</a> Nat Commun. 10 (1), 3981(2019).</li>
<li>Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+colitis+modeling+using+dextran+sulfate+sodium+%28dss%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine colitis modeling using dextran sulfate sodium (dss).</a> J Vis Exp. (35), e1652(2010).</li>
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<li>Garabedian, E. M., Roberts, L. J., Mcnevin, M. S., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examining+the+role+of+paneth+cells+in+the+small+intestine+by+lineage+ablation+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Examining the role of paneth cells in the small intestine by lineage ablation in transgenic mice.</a> J Biol Chem. 272 (38), 23729-23740 (1997).</li>
<li>Moshi, J. M., Ummelen, M., Broers, J. L. V., Ramaekers, F. C. S., Hopman, A. H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+antigen+retrieval+protocols+on+the+immunohistochemical+detection+of+epigenetic+DNA+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Impact of antigen retrieval protocols on the immunohistochemical detection of epigenetic DNA modifications.</a> Histochem Cell Biol. 159 (6), 513-526 (2023).</li>
<li>Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-induced+antigen+retrieval+for+immunohistochemical+reactions+in+routinely+processed+paraffin+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Heat-induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections.</a> Methods Mol Biol. 588, 103-119 (2010).</li>
<li>Pereira, E. S. A., Lourenco, A. L., Marmello, B. O., Bitteti, M., Teixeira, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+techniques+for+a+comprehensive+gut+histopathological+analysis%3A+Swiss+roll+versus+intestine+strips%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Comparison of two techniques for a comprehensive gut histopathological analysis: Swiss roll versus intestine strips.</a> Exp Mol Pathol. 111, 104302(2019).</li>
<li>Bolognesi, M. aO., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+validated+for+routinely+processed+tissues+stain+frozen+sections+unpredictably%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Techniques%22%5BJournal%5D)">Antibodies validated for routinely processed tissues stain frozen sections unpredictably.</a> Bio Techniques. 3 (3), 137-148 (2021).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ici, nous présentons une méthode optimisée de fixation tissulaire utilisant la technique du rouleau suisse pour préserver l’architecture intestinale et favoriser une immunocoloration précise. Une fois maîtrisée, cette technique peut être utilisée pour étudier une grande variété de questions de recherche impliquant la physiologie intestinale et la biologie cellulaire19. Plusieurs méthodes de laminage suisses optimisées ont été publiées et sont très utiles20,21. Un avantage de cette technique est la facilité d’ouvrir avec précision l’intestin sur du papier filtre. Cela permet aux tissus d’être fixés à plat, empêchant les tissus de s’enrouler vers l’intérieur lors du roulement, ce qui est particulièrement utile lors de l’analyse de tissus enflammés avec une musculaire épaissie. De plus, il est essentiel de souligner le rôle essentiel de la coupe tissulaire dans l’obtention de résultats fiables. Une coupe appropriée garantit la préservation de l’architecture tissulaire et facilite une immunocoloration précise, contribuant ainsi au succès des analyses en aval11. L’approche optimisée est moins difficile que celle d’autres protocoles, ce qui permet d’obtenir des résultats cohérents entre différents individus. La technique mise en avant dans cet article fournit également une architecture tissulaire bien préservée, une polyvalence et une immunocoloration hautement reproductible à l’aide de divers anticorps.
Un aspect critique de ce protocole est le temps de fixation et de traitement. Une fixation et un traitement inadéquats des tissus peuvent nuire aux analyses histochimiques. Les tissus trop fixés deviennent cassants, tandis que les tissus sous-fixés restent trop mous. Les tissus surfixés et sous-fixés sont difficiles à sectionner et compromettent l’immunomarquage. Une fois disséqué sur du papier filtre, le tissu doit être immédiatement placé dans du formol pour réduire les altérations post-mortem22. Dans ce protocole, le tissu murin est fixé dans du formol pendant la nuit. Plusieurs études ont utilisé ce temps de fixation 20,23,24. Cependant, Boenisch et al. ont montré que l’immunocoloration est constante dans les tissus fixés dans le formol jusqu’à 4 jours25. L’optimisation du temps de fixation et du fixateur est nécessaire en fonction des analyses souhaitées. Par exemple, le fixateur de Carnoy est souvent préféré pour la coloration du mucus26. Le choix des fixateurs et la durée du temps de fixation doivent être optimisés par chaque chercheur en fonction de son approche expérimentale. L’utilisation d’un processeur de tissus automatisé est recommandée pour garantir des temps de traitement précis et cohérents. Notre laboratoire utilise de petites broches pour maintenir le tissu intestinal en place sous forme de rouleaux. Sans broches, le tissu peut se dérouler pendant le traitement. Comme ces broches sont assez petites et tranchantes, des précautions doivent être prises. Nous vous conseillons d’utiliser des pinces coupantes pour retirer l’extrémité pointue de la goupille avant le traitement des tissus. Certaines carottes d’histologie n’acceptent pas les tissus avec des épingles ; Par conséquent, il est préférable de vérifier avant de l’utiliser. Une autre approche consiste à utiliser de la gélose pour ancrer les tissus avant le traitement27 ou des éponges à cassette pourraient être utilisées dans les cassettes pour aider à maintenir les rouleaux.
L’immunomarquage est un protocole qui nécessite une optimisation pour chaque anticorps. L’utilisation d’anticorps validés par knock-out est recommandée dans la mesure du possible. Cette méthode de fixation et de traitement des tissus permet une coloration claire, ce qui permet d’identifier facilement la liaison des anticorps par rapport au signal de fond lorsque des anticorps non validés sont utilisés. Le choix du fixateur, la récupération de l’antigène et la dilution de l’anticorps peuvent avoir un impact sur la spécificité de l’anticorps. Nous recommandons aux chercheurs d’évaluer et d’optimiser soigneusement le protocole en ajustant la fixation, la récupération de l’antigène et le temps d’incubation de chaque anticorps. Pour obtenir les meilleurs résultats, les anticorps doivent être testés à différentes dilutions pour déterminer la concentration optimale et dans différents tampons de récupération d’antigène. La récupération des épitopes améliore l’immunocoloration en brisant les ponts de méthylène formés lors de la fixation. Dans ce protocole, la récupération d’épitopes induite par la chaleur est utilisée plutôt que la récupération d’épitopes induite par les protéolytiques, car la digestion enzymatique est plus susceptible de perturber la morphologie des tissus28. Les tampons de récupération d’épitopes induits par la chaleur les plus courants sont le tampon de citrate, le tris-HCl et le tris-EDTA, le tampon de citrate étant le plus doux sur la morphologie tissulaire29. Le choix du tampon varie et doit être déterminé pour chaque anticorps. De nombreux tampons de récupération d’antigènes, solutions de blocage et diluants d’anticorps sont disponibles dans le commerce. Cependant, ces solutions peuvent être extrêmement coûteuses et prohibitives. Nous avons fourni des recettes de solutions courantes de récupération d’antigènes et de solutions de blocage et de diluant d’anticorps pour garantir la rentabilité. 
L’une des limites de cette méthode est que la fixation et le traitement peuvent modifier les tissus et masquer les épitopes. Une autre approche consiste à immunocolorer des tissus frais congelés. Les tissus frais congelés sont surgelés, ce qui permet d’éviter l’exposition à des fixateurs toxiques, de préserver la structure des protéines et d’améliorer l’accessibilité de certains épitopes. Cependant, l’architecture et la morphologie des tissus sont plus pauvres que celles des tissus fixes et inclus dans la paraffine. Parmi les autres défis posés par les tissus frais congelés, citons les matériaux et la logistique nécessaires à la section et au stockage des blocs et des lames congelés. L’analyse des rouleaux suisses par rapport aux bandelettes de tissu intestinal montre des différences dans la hauteur et la largeur des villosités et des différences dans les cellules immunitaires de la lamina propria, comme décrit dans un rapport antérieur30. Ces résultats suggèrent que les Swiss rolls intestinaux modifient certaines caractéristiques intestinales, ce qui devrait être pris en compte lors de la planification des expériences. De plus, une revalidation des anticorps est nécessaire car de nombreux anticorps qui se lient spécifiquement aux tissus fixés au formol et inclus dans la paraffine ne se colorent pas bien dans les tissus frais congelés31.
L’immunocoloration du tissu intestinal peut être utilisée pour répondre à une grande variété de questions concernant la biologie et la physiologie des cellules gastro-intestinales. Cette technique est largement utilisée pour identifier les altérations épithéliales dans le cadre de l’inflammation intestinale, à la suite d’une infection bactérienne et au cours de la progression du cancer. La méthode présentée ici est idéale pour la préservation des tissus intestinaux car elle est rentable, peu techniquement difficile et hautement reproductible. Afin d’obtenir les meilleurs résultats, nous encourageons l’optimisation des étapes décrites dans ce protocole en fonction du plan d’expérience et de l’hypothèse testée.

L’architecture cellulaire de l’intestin pose un défi unique pour maintenir son intégrité structurelle lorsque le tissu intestinal est préservé pour l’immunomarquage. L’intestin grêle est composé de structures allongées en forme de doigts appelées villosités1. Ces villosités se déforment souvent au cours des processus d’encastrement. Il est crucial de s’assurer que les chercheurs disposent de techniques pour intégrer correctement les intestins afin d’obtenir des coupes efficaces, permettant de visualiser toutes les régions de l’intestin, ainsi que les couches qui composent l’intestin (c’est-à-dire la musculeuse propria, la muqueuse et la séreuse), est crucial pour une analyse expérimentale robuste2. Une fixation inadéquate, une fixation excessive et une manipulation inappropriée des tissus compromettront l’intégrité des tissus, entraînant des dommages accidentels à l’épithélium intestinal 3,4. Endommager l’épithélium intestinal au cours de ces étapes peut diminuer considérablement la qualité des analyses ultérieures, comme l’immunofluorescence, indépendamment de l’efficacité des protocoles d’immunohistochimie et des anticorps utilisés.
L’immunomarquage, comme la bonne fixation des tissus, est une partie importante de la recherche biomédicale. Lorsqu’elle est bien faite, l’immunocoloration peut mettre en lumière des aspects jusque-là inconnus de la structure et de la fonction cellulaires. La coloration par immunofluorescence des sections de paraffine peut être difficile en raison des modifications physicochimiques résultant du processus de fixation et d’enrobage de la paraffine5. La fixation et l’intégration de la paraffine entraînent un masquage de l’antigène qui peut interférer avec la détection par immunofluorescence des épitopes d’intérêt6. Une fixation retardée peut induire une dégradation protéolytique, ce qui entraîne une coloration affaiblie ou absente des épitopes critiques7. De plus, les anticorps sont souvent imprécis avec des niveaux élevés de bruit de fond. Les protocoles d’immunomarquage qui favorisent une liaison cohérente et spécifique des anticorps et un rapport signal/bruit élevé peuvent fournir des informations précieuses aux chercheurs. 
Ici, nous fournissons un protocole complet conçu pour obtenir des images d’immunofluorescence de haute qualité grâce à la fixation des tissus intestinaux, à la préparation du rouleau suisse8 et à l’immunomarquage. Mettant l’accent sur les lignes directrices visant à préserver l’intégrité de l’intestin, le protocole vise à fournir aux chercheurs une méthodologie robuste pour améliorer la qualité et la fiabilité des études d’imagerie par immunofluorescence. Nous avons également cherché à utiliser des ressources rentables, notamment du papier filtre et une récupération d’antigène maison, des solutions de blocage et des diluants d’anticorps pour rendre le protocole plus accessible aux laboratoires qui peuvent disposer de fonds limités. Comme pour tous les protocoles expérimentaux, les chercheurs doivent optimiser le protocole actuel en fonction de leur approche expérimentale et de leurs domaines d’intérêt.

<table><tbody><tr><td>&beta ;-CATENIN</td><td>GeneTex</td><td>GTX101435</td><td></td></tr><tr><td>Papier filtre cellulose</td><td>Cytiva</td><td>10427804</td><td>Papier Whatman épais</td></tr><tr><td>Lames de verre chargé Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>23888114</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Epredia</td><td>152440</td><td></td></tr><tr><td>Broches de dissection taille 00</td><td>Phusis</td><td>B082DH4TZF</td><td></td></tr><tr><td>E-CADHERIN</td><td>R& D Systems</td><td>AF748</td><td></td></tr><tr><td>Gants de congélation</td><td>Tempshield</td><td>UX-09113-02</td><td></td></tr><tr><td>Bloc chauffant</td><td>Premiere</td><td>XH-2001</td><td>Chauffe-lames</td></tr><tr><td>Histo-Clear II</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>64111-04</td><td>Réactif d’élimination</td></tr><tr><td>Hoescht</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>Stylo hydrophobe</td><td>Millipore</td><td>402176</td><td></td></tr><tr><td>LAMININ</td><td>GeneTex</td><td>GTX27463</td><td></td></tr><tr><td>LAMP1</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-19992</td><td></td></tr><tr><td>Grandes cassettes</td><td>Tissue-Tek</td><td>4173</td><td></td></tr><tr><td>Pin’s minutien</td><td>Outils de science fine</td><td>NC9679721</td><td></td></tr><tr><td>réactif de blocage souris sur souris</td><td>Vector Laboratories</td><td>MKB-2213</td><td>Bloc souris sur souris</td></tr><tr><td>MUC2</td><td>GeneTex</td><td>GTX100664</td><td></td></tr><tr><td>PCNA</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2586S</td><td></td></tr><tr><td>Autocuiseur</td><td>Cuisinart</td><td>B000MPA044</td><td></td></tr><tr><td>ProLong gold antifade</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36934</td><td>Support de montage</td></tr><tr><td>Pince à action inverse</td><td>Dumont</td><td>5748</td><td></td></tr><tr><td>Rack à glissières</td><td>Tissue-Tek</td><td>62543-06</td><td></td></tr><tr><td>Kit de coloration de lames</td><td>Tissue-Tek</td><td>62540-01</td><td>Plats résistants aux solvants et cadre métallique</td></tr><tr><td>Petites cassettes</td><td>Fisherbrand</td><td>15-200-403B</td><td></td></tr><tr><td>Citrate de sodium dihydraté</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP327-1</td><td></td></tr><tr><td>Teleostein Gelatin</td><td>Sigma</td><td>G7765</td><td>Tampon de blocage</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A16046</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J20605-AP</td><td></td></tr><tr><td>Lingettes</td><td>KimTech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Xylenes</td><td>Fisher Chemical</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr><tr><td>&gamma ;-ACTIN</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-65638</td><td></td></tr></tbody></table>

protocole optimisé pour les swiss rolls intestinaux et la coloration immunofluorescente des tissus inclus dans la paraffine

Optimized Protocol for Intestinal Swiss Rolls and Immunofluorescent Staining of Paraffin Embedded Tissue

L’intestin est un organe complexe composé de l’intestin grêle et du gros intestin. L’intestin grêle peut être divisé en duodénum, jéjunum et iléon. Chaque région anatomique de l’intestin a une fonction unique qui se reflète dans les différences de structure cellulaire. L’étude des changements dans l’intestin nécessite une analyse approfondie des différentes régions tissulaires et des altérations cellulaires. Pour étudier l’intestin et visualiser de gros morceaux de tissu, les chercheurs utilisent couramment une technique connue sous le nom de rouleaux suisses intestinaux. Dans cette technique, l’intestin est divisé en chaque région anatomique et fixé dans une orientation plate. Ensuite, le tissu est soigneusement roulé et traité pour l’enrobage de paraffine. La fixation et l’orientation correctes des tissus sont une technique de laboratoire souvent négligée, mais elles sont d’une importance cruciale pour l’analyse en aval. De plus, un mauvais roulement suisse du tissu intestinal peut endommager l’épithélium intestinal fragile, entraînant une mauvaise qualité des tissus pour l’immunocoloration. S’assurer que les tissus sont bien fixés et correctement orientés avec des structures cellulaires intactes est une étape cruciale qui garantit une visualisation optimale des cellules intestinales. Nous présentons une méthode simple et rentable pour fabriquer des rouleaux suisses afin d’inclure toutes les sections de l’intestin dans un seul bloc inclus dans la paraffine. Nous décrivons également la coloration par immunofluorescence optimisée du tissu intestinal pour étudier divers aspects de l’épithélium intestinal. Le protocole suivant fournit aux chercheurs un guide complet pour obtenir des images d’immunofluorescence de haute qualité grâce à la fixation des tissus intestinaux, à la technique du Swiss-roll et à l’immunomarquage. L’utilisation de ces approches raffinées préserve la morphologie complexe de l’épithélium intestinal et favorise une compréhension plus profonde de la physiologie et de la pathobiologie intestinales.

Une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&amp;E) a été effectuée, comme décrit précédemment12. En utilisant la méthode optimisée, les Swiss Rolls intestinaux comprenaient les trois segments de l’intestin grêle et du gros intestin sur une seule lame. Le fait d’avoir l’intestin entier logé sur une lame permet aux chercheurs d’analyser les changements dans toutes les parties de l’intestin et de réduire les coûts de sectionnement et de coloration des réactifs (Figure 1). De plus, l’exposition simultanée de tous les segments intestinaux aux mêmes solutions lors de l’immunocoloration permet de garantir des résultats précis. La micrographie H&amp;E démontre l’architecture intestinale préservée de toutes les parties de l’intestin grêle et du gros intestin (Figure 2). La mesure des villosités duodénales n’a montré aucune différence significative dans la hauteur des villosités dans le tissu intestinal non ouvert par rapport à cette méthode suisse en rouleau, ce qui suggère que l’ouverture de l’intestin ne perturbe pas l’architecture tissulaire (Figure 2D). L’immunocoloration des Swiss rolls intestinaux montre les différentes couches de l’intestin ainsi que l’ensemble de l’axe de la crypte villeuse. Les images fluorescentes montrent de faibles niveaux de fond dus à la coloration primaire et secondaire des anticorps et décrivent clairement les cellules individuelles présentes dans l’épithélium. La figure 3 montre la morphologie des différents segments intestinaux et la coloration des cellules caliciformes (cellules positives MUC2)13, de la membrane apicale (γ-ACTIN)14, de la membrane latérale des cellules épithéliales (E-CADHERIN)15 et des noyaux. Ce protocole est adapté à l’identification de nombreux compartiments cellulaires différents, y compris les cellules prolifératives (PCNA)16, l’interstitium (LAMININ ; Graphique 4A) 17, le domaine lysosomal (LAMP1)14 et l’épithélium (β-TÉNINE ; Graphique 4B) 18. Aéroport international
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66977/66977fig01.jpg"> Figure 1 : Déroulement de la préparation et du traitement des petits pains intestinaux suisses. (A) Les segments intestinaux sont rincés à l’aide d’une seringue contenant du PBS, puis lavés au PBS. (B) Le tissu intestinal humide est ensuite placé sur du papier filtre sec. (C) L’intestin est ouvert longitudinalement sur du papier filtre et (D) légèrement écarté. (E) Un morceau de papier filtre est posé sur l’intestin ouvert, et l’intestin est doucement pris en sandwich entre le papier filtre et agrafé. Les segments intestinaux sont fixés pendant la nuit, et (F) est roulé à l’aide d’une pince. (G) L’intestin est doucement délogé de la pince à action inverse, et (H) a une apparence de rosette. (I, J) Le tissu intestinal est épinglé et placé dans une grande cassette. (K) Les quatre segments intestinaux sont placés dans la même cassette pour le traitement et l’intégration des tissus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66977/66977fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66977/66977fig02v2.jpg"> Figure 2 : Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine des quatre segments de l’intestin. (A) Le balayage des tuiles démontre la capacité de visualiser l’intestin entier en une seule lame avec des rouleaux suisses individuels du duodénum, du jéjunum, de l’iléon et du côlon. (B) Micrographie d’un rouleau suisse intestinal et (C) Encart à grossissement plus élevé pour montrer l’architecture des villosités et de la crypte. (D) La quantification de la longueur des villosités de l’intestin grêle ne montre aucune différence significative entre le tissu roulé suisse et le tissu non ouvert. Barres d’échelle = 1000 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66977/66977fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66977/66977fig03.jpg"> Figure 3 : Coloration par immunofluorescence des quatre segments de l’intestin. Des souris témoins adultes C57BL/6J ont été immunomarquées pour les noyaux (cyan), le marqueur de membrane latérale, E-CADHERIN (vert), les cellules caliciformes identifiées par MUC2 (jaune) et le marqueur de bordure en brosse apicale, γ-ACTIN, (magenta). Barres d’échelle = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66977/66977fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66977/66977fig04.jpg"> Graphique 4. Coloration par immunofluorescence de l’intestin. (A) Une micrographie représentative de la coloration par immunofluorescence de l’intestin de souris met en évidence les noyaux (cyan), les cellules prolifératives, le PCNA (vert) et la lamina propria, la LAMININE (magenta). (B) Image d’immunofluorescence identifiant les noyaux (cyan), le marqueur de membrane cellulaire β-CATÉNINE (vert) et le marqueur de lysosome LAMP1 (magenta) dans l’intestin. Barres d’échelle = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66977/66977fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

L’intestin est vital pour la digestion et l’absorption. Chaque région - duodénum, jéjunum, iléon, côlon - remplit des fonctions distinctes en raison de structures cellulaires uniques. L’étude de la physiologie intestinale nécessite une analyse méticuleuse des tissus. Ce protocole décrit la fixation et le traitement des tissus à l’aide de la technique du rouleau suisse, assurant une immunocoloration précise grâce à une préservation et une orientation appropriées des tissus.

Protocole optimisé pour les Swiss Rolls intestinaux et la coloration immunofluorescente des tissus inclus dans la paraffine

The intestine is a complex organ composed of the small and the large intestines. The small intestine can be further divided into duodenum, jejunum, and ...

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Research

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JoVE Journal

Biology

Biologie

Cette vidéo illustre une méthode basée sur l’immunofluorescence pour visualiser les cellules de touffes intestinales dans des cryosections de jéjunum de souris flottantes. Dans les villosités intestinales, la co-localisation de la fluorescence verte à l’extrémité luminale avec une masse radiculaire rouge étendue indique la présence de cellules touffues.

Procédé basé sur l’immunofluorescence pour visualiser des cellules de touffe dans des cryosections de jéjunum

Le protocole décrit ici concerne l’évaluation structurelle d’une préparation rétinienne entière. Cela comprend des descriptions de dissection tissulaire, de montage sur un insert de membrane en polytétrafluoroéthylène (PTFE) hydrophilisé, de chargement en bolus avec des marqueurs fluorescents et une comparaison de la fixation avec du carbodiimide et du paraformaldéhyde pour l’analyse immunohistochimique des composants cellulaires et synaptiques.

Protocole optimisé pour la rétine Wholemount Préparation pour l&#39;imagerie et immunohistochimie

Cellules souches épithéliales intestinales (CSI) sont entremêlées avec des cellules de Paneth. Ces cellules se différencient descendance de l'ISC, qui soutiennent la CSI et de fournir une protection antibactérienne. Ici, nous démontrons comment nous avons utilisé des modèles de souris transgéniques conditionnelles pour établir que les cellules de Paneth jouent un rôle crucial dans le maintien de l'épithélium intestinal.

Protocoles pour analyser le rôle des cellules de Paneth dans la régénération de l&#39;intestin murin utilisant conditionnelle<em&gt; Cre-lox</em&gt; Modèles de souris

l'identification et la localisation des cellules épithéliales le long de la paroi de la muqueuse intestinale précis sont essentiels pour définir différentes lignées cellulaires. l'imagerie correcte des tissus intestinaux est cruciale pour l'identification des motifs d'expression de protéine avec une résolution maximale. Cette étude vise à définir les méthodes et les conditions optimales pour les tissus intestinaux de traitement de la souris.

Amélioration Technique Swiss-laminage pour la préparation Intestinal des tissus pour immunohistochimique et immunofluorescence Analyses

Nous présentons des protocoles pour l’isolation de bâtiments 3D intestinales in vivo des tissus du et matrice de sous-sol en vitro intégrée organoïdes et différentes de fixation détail et souillant des protocoles optimisés pour l’immuno-marquage des microtubules, les protéines centrosomes et jonctionnelles ainsi que cell marqueurs dont la protéine des cellules souches Lgr5.

Immuno-fluorescence étiquetage des Microtubules et des centrosomes protéines dans les tissus intestinaux Ex Vivo et 3D In Vitro intestinale organoïdes

Kuga et coll. a découvert que des anticorps spécifiques contre l’actine liaison protéine girdin phosphorylé en tyrosine 1798 (pY1798)-État de phosphorylation peuvent être utilisés pour étiqueter des cellules touffe (TCs). Ce protocole permet la visualisation robuste de TCs en utilisant la coloration par immunofluorescence des cryosections jéjunum flottant avec des anticorps pY1798.

Utilisation des anticorps Anti-phospho-girdin pour visualiser la touffe Intestinal cellules de souris flottante jéjunum Cryosections

La notation systématique de l’inflammation intestinale utilisant un système informatique-aidé libre est un outil puissant pour comparer quantitativement des changements histopathologiques dans des modèles de colite caractérisés par la présence des ulcères et des changements inflammatoires. L’évaluation histologique de score de colite renforce des observations cliniques et facilite l’interprétation de données.

Analyse systématique de notation pour l’inflammation intestinale dans un modèle de colite induite par le sulfate de sodium murine dextran

Ce protocole simplifié détaille un flux de travail pour détecter et imager les bactéries dans des échantillons de tissus complexes, de la fixation du tissu à la coloration des microbes avec hybridation fluorescente in situ .

Visualisation des interactions entre le microbiote intestinal et l’hôte par hybridation in situ par fluorescence, coloration par lectine et imagerie

Notre protocole détaillé décrit la création et l’utilisation du modèle avancé d’intestin sur puce, qui simule la muqueuse intestinale humaine avec des structures 3D et divers types de cellules, permettant une analyse approfondie des réponses immunitaires et des fonctions cellulaires en réponse à la colonisation microbienne.

Modèle d’intestin sur puce immunocompétent pour l’analyse des réponses immunitaires de la muqueuse intestinale

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Cartographie spatiale améliorée des couches de muscles gastriques de souris à l’aide d’une technique modifiée du Swiss roll

Apprenez la technique du Swiss roll et la coloration immunofluorescente pour l'étude de l'intestin de souris. Cette méthode permet de visualiser toutes les régions intestinales dans un seul bloc de paraffine avec des résultats reproductibles.

Protocole optimisé pour les Swiss Rolls intestinaux et la coloration immunofluorescente des tissus inclus dans la paraffine

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