Détection robuste de l’amplification génique dans des échantillons fixés au formol et inclus dans de la paraffine par hybridation in situ en fluorescence
12 juillet 2024
Ce protocole fournit une méthode reproductible pour visualiser l’amplification génique dans des échantillons de tissus fixés au formol et inclus dans de la paraffine (FFPE).
L’amplification oncogène est un facteur critique du cancer. La caractérisation cytogénétique sur des échantillons FFPE est un moyen rentable d’étudier l’amplification des oncogènes. Nous présentons des instructions robustes et complètes pour l’étude de l’amplification des gènes focaux et des échantillons FFPE.
En examinant le modèle de signal FISH, il devient clair sans équivoque si et comment un locus de gène est amplifié. Les oncogènes amplifiés sous forme d’ADN extrachromosomique sont répandus dans le cancer humain, comme le cancer du poumon, du sein et du cerveau. Le séquençage du génome entier et le FISH sont les méthodes les plus utilisées pour détecter l’ADN extrachromosomique.
L’application de FISH aux tissus FFPE est difficile car les artefacts de réticulation et l’autofluorescence de fond compromettent souvent la qualité des données. Notre protocole comprend des procédures optimisées, notamment l’extraction et la digestion des protéines, la dénaturation thermique et les techniques d’extinction par autofluorescence pour améliorer la qualité des données pendant la FISH sur les échantillons FFPE, ce qui donnera des informations précieuses sur la progression du cancer chez les patients. Nous étudierons les fonctions moléculaires de l’ADN extrachromosomique et comment les cellules cancéreuses maintiennent l’ADN extrachromosomique.
À terme, nous visons à les éliminer pour traiter le cancer.
Aperçu
Ce protocole fournit une méthode reproductible pour visualiser l'amplification génique dans des échantillons tissulaires fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE). En utilisant des techniques de FISH, les chercheurs peuvent étudier efficacement l'amplification des oncogènes, un facteur important dans la progression du cancer.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Oncologie
- Génétique
- Cytogénétique
Contexte
- L'amplification de l'oncogène est un facteur déterminant critique du cancer.
- Les échantillons FFPE sont couramment utilisés pour la caractérisation cytogénétique.
- Les techniques FISH sont essentielles pour détecter l'amplification génique.
- Les difficultés incluent les artéfacts de réticulation et l'autofluorescence dans les tissus FFPE.
Objectif de l'étude
- Proposer des protocoles optimisés pour la FISH sur des échantillons FFPE.
- Étudier les fonctions moléculaires de l'ADN extrachromosomique dans les cellules cancéreuses.
- Améliorer la qualité des données et les connaissances sur la progression du cancer.
Méthodes utilisées
- Préparation de l'échantillon et prétraitement des lames FFPE.
- Extraction et digestion des protéines à l'aide de la protéinase K.
- Hybridation FISH et techniques d'imagerie.
- Analyse des données à l'aide d'algorithmes de projection maximale en 3D et de déconvolution.
Résultats principaux
- Des profils de signal FISH distincts observés dans des échantillons de cancer du sein triple négatif.
- Les échantillons positifs pour HER2 présentaient des signaux FISH abondants indiquant une amplification du gène.
- Des agrégats d'ADN extrachromosomique en forme de hubs ont été identifiés dans certains noyaux.
- Des méthodes optimisées ont amélioré la qualité des données FISH sur tissus FFPE.
Conclusions
- Le protocole améliore la capacité à étudier l'amplification des oncogènes dans le cancer.
- Des techniques améliorées peuvent conduire à une meilleure compréhension des mécanismes du cancer.
- Les recherches futures pourraient se concentrer sur l'élimination de l'ADN chromosomique supplémentaire pour traiter le cancer.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La détection robuste de l'amplification génique dans les échantillons FFPE par FISH répond à un besoin critique d'évaluation fiable des oncogènes dans les prélèvements cliniques archivés. Cette capacité renforce la confiance prédictive dans la validation des cibles et soutient des décisions adaptées au risque lors d'étapes clés de découverte et de translation. Des protocoles FISH standardisés sur tissus FFPE permettent une évaluation cohérente de l'amplification génique, ayant un impact direct sur la priorisation des portefeuilles en oncologie.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet la visualisation directe des événements d'amplification génique dans des contextes tissulaires cliniquement pertinents.
- Permet une validation fonctionnelle des cibles en confirmant le statut d'amplification d'oncogènes dans des échantillons tumoraux.
- Facilite la réduction des risques mécanistiques en distinguant l'amplification dirigée par l'ADN extrachromosomique (ecDNA) des événements chromosomiques.
- Améliore la confiance prédictive dans les tests d'hypothèses thérapeutiques en aval.
Développement de tests et criblage
- Propose un test cytogénétique standardisé pour quantifier l'amplification génique dans les échantillons FFPE.
- Garantit la reproductibilité et la comparabilité des résultats entre différentes archives de tissus.
- Fournit des sorties d'imagerie quantitatives adaptées à l'étalonnage des tests et à la validation des plateformes.
- Permet un dépistage fiable de biomarqueurs candidats dans les flux de recherche en oncologie.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne la détection de l'amplification génique avec des modèles tissulaires pertinents pour la maladie afin d'assurer une continuité translationnelle.
- Permet la stratification des patients guidée par des biomarqueurs dans les études précliniques.
- Facilite l'avancement des actifs en oncologie ajusté au risque, fondé sur le statut d'amplification validé.
- Offre un éclairage mécanistique sur la résistance aux traitements liée à l'ADN extrachromosomique (ecDNA) dans la progression du cancer.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Ce protocole FISH s'intègre dans la continuité entre découverte et recherche translationnelle en permettant une évaluation robuste de l'amplification génique dans des échantillons FFPE, reliant ainsi les étapes précoces de découverte, le développement de tests et les flux de travail de recherche translationnelle.
- Biologie du découverte : Soutient la vérification des hypothèses et l'élucidation des voies en confirmant l'amplification d'oncogènes dans des tissus archivés.
- Écrantage : Fournit des lectures FISH reproductibles et quantitatives pour la standardisation des tests et l'évaluation de composés.
- Analytique : Offre un imagerie haute résolution et une analyse quantitative des signaux pour des études comparatives.
- Recherche translationnelle : Assure la continuité de la validation des biomarqueurs du stade de découverte à celui des modèles précliniques, en utilisant des échantillons cliniquement pertinents.
- Réutilisation institutionnelle : Met en place un flux de travail standardisé et réutilisable pour la détection de l'amplification génique dans divers programmes d'oncologie.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles.
- Valeur opérationnelle : Améliore la standardisation, la reproductibilité et la montée en échelle des tests d'amplification génique dans les tissus FFPE.
- Valeur stratégique : Améliore la prise de décision « aller/ne pas aller » et l'efficacité du capital en permettant une évaluation robuste des biomarqueurs.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation et l'avancement ajustés au risque des actifs en oncologie, fondés sur des données validées d'amplification.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en cytogénétique et en imagerie par fluorescence pour une acquisition optimale des données.
- Exige un accès à des plateformes d'imagerie de haute qualité et à des logiciels analytiques pour la quantification des signaux.
- Implique une standardisation interéquipes des protocoles de préparation des échantillons et d'imagerie.
- Peut nécessiter des adaptations selon les types de tissus ou les cibles oncogéniques, en fonction des caractéristiques des échantillons.
- Les limites potentielles incluent l'autofluorescence et les artefacts de réticulation inhérents aux échantillons FFPE.
