Name: Circuits immunométaboliques dans l’infection pour faire progresser les thérapies dirigées vers l’hôte (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Découvrez la conception de circuits synthétiques inductibles contrôlés par tétracycline pour éliminer Leishmania major et moduler l'expression des cytokines. Cette méthode offre une approche innovante pour les thérapies immunométaboliques dirigées vers l'hôte.

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Les auteurs tiennent à remercier le directeur du Conseil de recherche et d’innovation en biotechnologie - Centre national pour la science cellulaire (BRIC-NCCS), Pune, pour son soutien à notre recherche et à l’installation de bioinformatique BRIC-NCCS.

Conception de circuits synthétiques contrôlés par la tétracycline pour le traitement de la leishmaniose

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les résultats obtenus soulignent l’efficacité du pipeline, qui a été canalisé pour la conception et la mise en œuvre d’un circuit synthétique. La construction de ce circuit synthétique a été une étape vers le développement d’une médecine de précision pour les maladies infectieuses comme la leishmaniose. Grâce à l’assemblage in silico de parties génétiques et à la simulation déterministe, l’effet modulatoire distingué du système TetON a été surveillé. L’effet du circuit, notamment, aurait pu conduire à l’expression bistable réciproque de TetR et SDHA/GFP. L’expression de la SDHA était périodique, ce qui pourrait indiquer que son expression n’était augmentée qu’en présence de doxycycline. Pour observer les changements potentiels dans les modèles d’expression au cours d’une période, une unité de temps de 100 a été sélectionnée. Les résultats identifient que le circuit synthétique a montré un comportement périodique pour TetR et SDHA/GFP, probablement attribuable à sa nature orthogonale21. L’assemblage de parties génétiques à partir du registre des pièces iGEM a joué un rôle central, car il a fourni des composants génétiques nécessaires à la construction de circuits synthétiques22. L’arrangement modulaire des parties génétiques est essentiel car la traduction et le fonctionnement du circuit peuvent être affectés, ce qui peut conduire à une expression inefficace et à un effet modulateur dans les cellules23.
La taille de l’insert du circuit synthétique était d’environ 1,3 kb pour s’assurer que la taille du vecteur n’est pas trop grande, ce qui peut potentiellement réduire l’efficacité de la transformation24. La sélection d’un vecteur approprié est une étape critique car il doit posséder des parties génétiques, qui sont essentielles pour augmenter le nombre de copies dans le système bactérien et produire une copie plasmidique élevée, et sa machinerie d’expression doit bien s’adapter dans le système mammifère25. Le vecteur pEGFP-N1 est bien caractérisé dans la lignée cellulaire RAW264.7 et possède une structure plasmidique compacte avec un site de clonage multiple26. Des solutions tampons normalisées en laboratoire ont été utilisées pour l’isolement des plasmides afin d’assurer la production de plasmides hautement concentrés et purs, qui ont été validés par l’estimation spectrophotométrique et l’AGE. L’insertion du circuit synthétique dans le vecteur pEGFP-N1 a été validée par digestion de restriction, et les échantillons ont été analysés sur AGE et séquençage. Les résultats de l’AGE représentaient une bande de 1,3 kb d’insertion, une bande de 4,7 kb de vecteur pEGFP-N1 et une bande de 6 kb de l’ensemble du circuit synthétique. 
Une transfection à l’aide d’un rapport ADN :1, 1:2 et 2:1 a été effectuée, où le rapport observé de 1:1 a fonctionné le mieux sans perturber la morphologie cellulaire (données non présentées). Il est recommandé d’utiliser une concentration de 400 μg/mL à 1000 μg/mL de G418 pour la sélection des cellules transfectées27. Une dose de 500 μg/mL de G418 a été utilisée pour la sélection des cellules transfectées, car elle a efficacement inhibé la croissance des cellules non transfectées sans compromettre la croissance cellulaire ou la morphologie des cellules transfectées (données non présentées). Compte tenu de l’importance du phénotype cellulaire dans l’efficacité de la transfection, en particulier dans les lignées cellulaires de macrophages, qui peuvent subir une différenciation et devenir difficiles à transfecter, un faible nombre de passage de la lignée cellulaire RAW264.7 a été utilisé pour la transformation28. Le nombre de passages cellulaires peut également être un facteur critique dans l’efficacité de la transfection. Un nombre de passage élevé peut conduire à une transfectioninefficace 29. Dox est l’inducteur préféré pour le système d’induction Tet-ON en raison de son efficacité de liaison élevée à TetR, de sa distribution tissulaire favorable, de sa faible toxicité et d’une demi-vie de 24 h30. Après la transfection, les cellules ont été induites avec dox pendant 24 h, et elles ont été observées pour l’expression de la GFP. Pour les cellules RAW264.7, la concentration de dox utilisée pour l’induction de circuits synthétiques était de 1 μg/mL, ce qui se situe dans la plage recommandée de 1-2 μg/mL31 (données non présentées). Cependant, la régulation de la concentration de SDHA après l’induction était indéterminée. Dans l’ensemble, la détermination et la normalisation du nombre de passages cellulaires, de la concentration d’ADN : PEI, de la concentration du marqueur de sélection de la transfection chez les mammifères et de la concentration d’induction de la doxycycline sont des facteurs cruciaux dans le processus de transfection.
Suite à l’induction du circuit synthétique post-infection à différents points temporels, une réduction significative de la charge parasitaire intracellulaire a été observée. Une comparaison des charges parasitaires entre les échantillons infectés et IMTI a révélé une charge plus faible dans les cellules induites par le circuit synthétique, probablement attribuable à l’expression de la SDHA. Comme l’expression de SDHA est associée à la production de NO, on a observé que les cellules IMTI ont une forme morphologique irrégulière et rugueuse, ce qui se produit dans la lignée cellulaire RAW264.7 lorsque le NO est produit32. Les niveaux d’IL-10 et d’IL-12 après l’infection de 6 h étaient les plus élevés, car les deux cytokines ont été signalées comme étant régulées à la hausse à ce moment-là, ce qui subit une modification phénotypique pour produire plus d’IL-10 que d’IL-1219. Comme les taux d’IL-10 et d’IL-12 n’ont pas modifié de manière significative la post-transfection et dans les échantillons IMTI, un profilage des cytokines a été effectué pour détecter les réponses cytokiniques pro-inflammatoires et anti-inflammatoires. 
Des niveaux d’expression du TNF-α, de l’IFN-γ et du TGF-β ont été identifiés dans des échantillons d’infection après 6 h, d’IMTI et d’IMTI après 24 h. Pour éliminer les parasites intracellulaires, le TNF-α et l’IFN-γ sont principalement essentiels car ils induisent des explosions oxydatives par la production de NO. Les macrophages polarisés M2 expriment le TGF-β, qui régule à la baisse les cytokinespro-inflammatoires 33. L’échantillon IMTI de 24 heures a montré une augmentation de l’expression du TNF-α et de l’IFN-γ que celle du TGF-β, ce qui suggère que les macrophages, lors de la transfection et de l’infection par L. major, pourraient s’être polarisés en phénotype exprimant des cytokines pro-inflammatoires. L’étude donne donc un aperçu des altérations phénotypiques induites lors de la transfection avec un circuit synthétique et met en évidence la dynamique de l’infection. L’effet des circuits synthétiques en tant que thérapeutique peut être étudié car leur induction a augmenté l’expression des cytokines pro-inflammatoires de manière significative par rapport aux cytokines anti-inflammatoires. Ainsi, l’étude a non seulement établi la construction et l’administration du circuit synthétique, mais a également démontré son potentiel thérapeutique dans un modèle de leishmaniose grâce à la régulation positive des cytokines pro-inflammatoires dans les cellules hôtes touchées par Leishmania.

L’avancement de la médecine holistique et intégrative est un lien important qui a été identifié entre les altérations métaboliques dans les cellules immunitaires et leur capacité à moduler le phénotype des cellules immunitaires dans les maladies infectieuses. L’immunométabolisme offre de nouvelles perspectives pour élucider la pathogenèse des maladies infectieuses prévalentes chez l’homme. De plus, il fournit des techniques prometteuses pour le développement de vaccins et de médicaments en identifiant de nouvelles cibles d’intervention1. La reprogrammation métabolique des cellules immunitaires est identifiée dans diverses maladies infectieuses, y compris la leishmaniose. Leishmania spp. est responsable de la leishmaniose, dont Leishmania major (L. major) provoque la leishmaniose cutanée (CL). Les parasites L. major ont un impact significatif sur le métabolisme des cellules hôtes, en particulier dans les macrophages, pour la prolifération et la survie en tant que parasites intracellulaires2. Les macrophages peuvent généralement se polariser en sous-ensembles activés de manière classique (M1) ou activés (M2) où les cellules M1 possèdent une sécrétion élevée de cytokines pro-inflammatoires et une production d’oxyde nitrique (NO) par le métabolisme des espèces azotées. Les cellules M2 présentent des niveaux élevés de cytokines anti-inflammatoires et présentent une activité élevée de l’arginase par le métabolisme de l’azote3. Ainsi, les deux phénotypes diffèrent non seulement par leur réponse immunitaire, mais aussi par leurs voies métaboliques.
La biologie des systèmes de la leishmaniose vise à identifier des cibles moléculaires pour la conception de nouveaux traitements par la conception et le développement de médicaments. La reconstruction des réseaux de signalisation et des voies métaboliques aide à comprendre la leishmaniose en tant que modèle holistique et permet d’identifier le principal composant à l’origine de l’état pathologique. La modélisation mathématique est l’une des approches analytiques appliquées les plus privilégiées pour comprendre les complexités de la leishmaniose4. Des réseaux immunométaboliques et des modèles mathématiques ont permis d’identifier la succinate déshydrogénase (SDHA) comme un composant clé du phénotype M1, qui est exprimé pour éliminer le parasite5. La biologie synthétique a des applications dans le diagnostic, le développement de vaccins et les traitements contre la leishmaniose. Le métabolisme ciblant la modulation de la réponse immunitaire peut être réalisé à l’aide d’outils de biologie synthétique. Pour la modulation de l’inositol phosphoryl céramide synthase qui régule le métabolisme des sphingolipides et modifie la signalisation immunitaire de l’hôte, un circuit génétique possédant un comportement bisstable a été utilisé pour ajuster synthétiquement la robustesse intrinsèque du modèle d’infection à L. major 6,7. Par conséquent, la biologie des systèmes et la biologie synthétique peuvent fournir une plate-forme de génie génétique basée sur un modèle pour le développement de la médecine de précision dans le système modèle de Leishmania.
Le phénotype M1 est marqué par l’expression de réseaux de signalisation immunométaboliques où la production de cytokines inflammatoires et de voies métaboliques améliore de manière synergique l’élimination du parasite. La polarisation M1 signifie la production de cytokines pro-inflammatoires telles que l’interleukine-12 (IL-12), l’interféron-gamma (IFN-γ) et le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α). Les voies métaboliques fortement enrichies dans le phénotype M1 comprennent la glycolyse, la voie du pentose phosphate et le cycle tronqué de l’acide tricarboxylique (cycle TCA)5. Le cycle tronqué du TCA dirige la machinerie d’élimination des parasites grâce à l’augmentation des niveaux de succinate et de citrate, qui guident la production de NO3. L’accumulation de succinate par la SDHA conduit à l’activation du facteur de transcription 1-alpha inductible par l’hypoxie (HIF-1α), qui induit la production d’IL-1β8. Dans le phénotype M2, l’oxydation des acides gras, l’augmentation de l’utilisation de la glutamine et l’augmentation de la phosphorylation oxydative du glucose sont observées ainsi que la production de cytokines anti-inflammatoires telles que l’interleukine-10 (IL-10), le facteur de croissance transformant bêta (TGF-β), l’interleukine-4 (IL-4) et l’interleukine-13 (IL-13)3. M2 présente des mitochondries allongées comme une caractéristique distinctive, conduisant à une efficacité accrue dans la production d’énergie. Ils utilisent des acides gras, du glucose et de la glutamine comme substrats pour alimenter le cycle du TCA, générant ainsi de l’ATP par phosphorylation oxydative à un taux plus élevé pour favoriser la croissance et la prolifération du parasite9. L’enzyme SDHA responsable de l’accumulation de succinate par le biais du TCA tronqué peut non seulement favoriser la production de NO, mais également initier une consommation d’oxygène dépendante du succinate par le transport d’électrons10. Dans les macrophages infectés par Leishmania, la SDHA est régulée à la baisse de 2,17 fois, ce qui indique que la respiration aérobie pourrait également être régulée àla baisse par 11. Afin d’augmenter la consommation de succinate pour induire la production de NO médiée par les cytokines pro-inflammatoires et favoriser l’élimination du parasite, l’expression de la SDHA est essentielle.
Le circuit synthétique offre des thérapies ciblées avec précision qui peuvent modifier le système malade pour obtenir une oscillation bistable qui peut restaurer un phénotype sain au niveau spatio-temporel. La distribution et l’expression du circuit synthétique rendent le système dynamique et robuste. L’un des facteurs essentiels contribuant à l’avancement de la biologie synthétique réside dans la capacité d’assembler des parties et des éléments génétiques de manière modulaire pour permettre la génération d’architectures complexes et de fonctionnalités sur mesure12. Les contraintes associées aux techniques d’expression traditionnelles ont stimulé l’émergence de circuits synthétiques de plasmides inductibles à base d’opérons de tétracycline, permettant ainsi une évaluation rapide du plasmide et une distribution facile dans divers types de cellules13. La protéine répressrice sensible à la tétracycline (TetR), lorsqu’elle existe en tant que dimère, présente une forte affinité de liaison avec l’opéron tet (TetO), supprimant efficacement la transcription. Cependant, lors de l’interaction de son ligand, la doxycycline (dox), TetR subit une altération structurelle, entraînant sa dissociation de TetO, permettant ainsi à la transcription de se dérouler sans entrave. Ce circuit peut présenter un contrôle de traduction protéique14. Par conséquent, grâce à la méthodologie définie, le circuit synthétique plasmidique inductible à base d’opéron tétracycline conçu a été permis d’exprimer SDHA dans le vecteur pEGFP-N1. L’évaluation de l’efficacité de transformation du circuit et de son rendement a permis de mieux cerner la compétence de livraison. Grâce à la digestion par restriction du vecteur, la détermination de l’efficacité du clonage a été confirmée. De plus, une lignée cellulaire de macrophages de souris RAW264.7 transfectée dérivée de macrophages péritonéaux de souris Balb/c a été observée pour l’expression de la protéine fluorescente verte (GFP) dose-dépendante de la doxycycline dans les cellules transfectées. De plus, l’effet d’élimination du parasite dans les cellules transfectées a été corroboré par une expression du circuit synthétique. De plus, l’induction et l’expression de cytokines pro-inflammatoires ont été observées, ce qui a été dirigé par une augmentation du point temporel de l’infection dans le circuit synthétique transfecté et induit des cellules, ce qui était directement associé au fonctionnement du circuit synthétique.

<table><tbody><tr><td>10 &mu ; Embouts L</td><td>Tarson</td><td>521050</td><td></td></tr><tr><td>10X tampon de restriction</td><td>BioLabs</td><td>R0146S</td><td>Digestion de restriction</td></tr><tr><td>1mL embouts</td><td>Tarson</td><td>521016</td><td></td></tr><tr><td>tube de 1mL</td><td>Eppendorf</td><td>30121023</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu ; L tips</td><td>Tarson</td><td>521010</td><td></td></tr><tr><td>25cm2 flacon</td><td>Corning</td><td>430639</td><td>Pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-phénylindole</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>D1306</td><td>coloration nucléaire</td></tr><tr><td>Tube de 50mL</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de 60mm</td><td>Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>6X TrackIt Cyan/Orange Tampon</td> <td>de chargementThermoFischer Scientific</td><td>10488085</td><td>Chargement d’échantillons pour</td></tr><tr><td>AGE 96 plaque de fond de lamelle de puits</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>160376</td><td>Pour l’imagerie confocale et la transfection</td></tr><tr><td>Micro plaque de test à 96 puits à fond plat Tarson</td><td></td><td>941196</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td>Pour AGE</td></tr><tr><td>Assemblage d’électrophorèse sur gel d’agarose</td><td>GeNei</td><td>93</td><td>Pour AGE</td></tr><tr><td>Flux laminaire bactérien</td><td>ESCO Lifesciences</td><td>2120765</td><td>Pour la transformation</td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Merck</td><td>C4901</td><td>Préparation de tampons/réactifs</td></tr><tr><td>Culture cellulaire Flux d’air laminaire</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>1323TS</td><td>Pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Racleur de cellules</td><td>Genetix</td><td>90020</td><td>Pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Épandeur de cellules</td><td>Fischer Centrifugeuse</td><td>12822775</td><td></td>scientifique</tr><tr><td>pour tubes de 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>EP5404000537</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse pour faucon de 50 ml</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>75004210</td><td></td></tr><tr>Chlorofrom <td>Fischer Scientific</td><td>67-66-3</td> Pour<td>l’isolement de</td><td>l’ARN</td></tr><tr><td>Incubateur CO2</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>3110</td><td>Pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Cuvette</td><td>Eppendorf</td><td>6138000018</td><td>Estimation de la concentration plasmidique</td></tr><tr><td>CYTIVA IQ 500 imageur gel</td><td>Cytiva</td><td>29655893</td><td>Pour AGE</td></tr><tr><td>DEPC TREATED H2O 1000 ML</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>750023</td><td>Pour l’isolement de l’ARN</td></tr><tr><td>Doxycycline</td><td>Merck</td><td>33429</td><td>Pour l’induction de cellules transfectées</td></tr><tr><td>Bloc chauffant sec</td><td>Labnet</td><td></td><td>Pour la transformation et l’inactivation des enzymes de restriction</td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium</td><td>Centre national pour la science</td><td></td> cellulaire <td>Pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00983</td><td>Tampon / Préparation de réactif</td></tr><tr><td>Bromure d’éthidium</td><td>Sigma</td><td>E7637</td><td>Pour AGE</td></tr><tr><td>Acide éthylènediamine tétraacétique</td><td>Fischer Scientific</td><td>12635</td><td>Tampon / Préparation du réactif</td></tr><tr><td>Evos microscope à fond clair</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>AMEX1000</td><td></td></tr><tr><td>ExPasy</td><td>https://web.expasy.org/translate/</td><td></td> <td>pour la construction de circuit synthétique</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>Pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Logiciel FV31S-SW</td><td>Olypmus</td><td></td><td>Acquisition d’images</td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>Gibco</td><td>1563411</td><td>pour la transfection</td></tr><tr><td>Méthode d’assemblage Gibson pour le clonage</td><td>BIOMATIK</td><td></td><td>Construction du circuit synthétique</td></tr><tr><td>Prisme Graphpad</td><td></td><td></td><td>Analyse statistique</td></tr> Kit <tr><td>de transcription inverse de l’ADNc à haute capacité</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4368814</td><td>pour la synthèse de l’ADNc</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fischer Scientific</td><td>13825</td><td>Tampon / Préparation de réactif</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Sigma</td><td>60615</td><td>Pour la transformation et la sélection de la colonie</td></tr><tr><td>Bouillon Luria Bertini</td><td>Himedia</td><td>M1245</td><td>Pour la culture E.coli</td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP214</td><td>Préparation de tampon / réactif</td></tr><tr><td>Micro Filt Vertical Laminaire</td><td>Air Flow Microfilt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Fast 8 tubes, 0,1 mL</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4358293</td><td>pour qRT-PCR</td></tr><tr><td>MicroAmp Bandes optiques à 8 capuchons</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4323032</td><td>pour qRT-PCR</td></tr><tr><td>Four à micro-ondes</td><td>LG</td><td>MC-7649DW</td><td>pour AGE</td></tr><tr><td>Mm00434228_m1 (IFN-&gamma ;)</td><td>Sondes ThermoFischer Scientific</td><td>4331182</td><td>Taqman</td></tr><tr><td>Mm00443258_m1 (TNF)</td>Sondes <td>ThermoFischer Scientific</td><td>4331182</td><td>Taqman</td></tr><tr><td>Mm01321739_m1(TGFB)</td>Sondes <td>ThermoFischer Scientific</td><td>4331182</td><td>Taqman</td></tr><tr><td>Kit ELISA souris IL-10</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>BMS614</td><td>Pour ELISA</td></tr><tr><td>Kit ELISA souris IL-12</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>BMS616</td><td>Pour ELISA</td></tr><tr><td>Multiskan Sky avec écran tactile + &mu ; Plaque de chute</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>51119600DP</td><td>Pour</td></tr><tr><td>ELISA MX-M Mélangeurs de microplaques 96 puits Mélangeur à plaques de culture cellulaire Réglable 0-1500 tr/min Agitateur de laboratoire</td><td>DIAB</td><td></td><td></td></tr> Centre <tr><td>national de biotechnologie https://www.ncbi.nlm.nih.gov</td><td></td><td></td><td>pour la construction de circuit synthétique</td></tr><tr><td>Chambre de Neubauer</td><td>Marienfeld superior</td><td>640010</td><td>Pour la numération cellulaire</td></tr><tr><td>Non ventilé 25cm2 flask</td><td>Corning</td><td>353014</td><td>Pour l’élevage de parasites</td></tr><tr><td>NotI</td><td>BioLabs</td><td>R3189M</td><td>Enzyme de restriction</td></tr><tr><td>Eau sans nucléases</td><td>Biodesign</td><td>1QIA</td><td>Préparation de réactifs</td></tr><tr><td>Olympus Cell Sens Dimension Desktop 2.3 logiciel</td><td>Olypmus</td><td></td><td>Traitement d’images</td></tr><tr><td>Olympus FV 3000</td><td>Olympus</td><td></td><td>Pour l’imagerie confocale</td></tr><tr><td>Milieux OPTI-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td>pour la transfection</td></tr><tr><td>Vecteur pEGFP-N1 cloné avec circuit synthétique</td><td>Biomatik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>15070063</td><td>Pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Polyéthylénimine</td><td>MERCK</td><td>764965</td><td>pour transfection</td></tr><tr><td>Acétate de potassium</td><td>Fischer Scientific</td><td>YBP364500</td><td>Tampon / Préparation de réactif</td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP366</td><td>Tampon / Préparation de réactif</td></tr><tr><td>Phosphate de potassium Monobasique</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>Tampon / Préparation de réactif</td></tr><tr><td>Bloc d’alimentation</td><td>BIORAD</td><td>1645070</td><td>Pour AGE</td></tr><tr><td>Registre des pièces biologiques standard</td><td>https://parts.igem.org/Main_Page</td><td></td><td>pour la construction du circuit synthétique</td></tr><tr><td>ARNISO Plus</td><td>Takara</td><td>38220090</td><td>Pour l’isolement de l’ARN</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>12091021</td><td>Préparation tampon / réactif</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute Medium</td> Centre <td>national pour la</td><td></td><td>science cellulaire Pour la culture du parasite</td></tr><tr><td>Incubateur d’agitateur</td><td>REMI</td><td>CIS 24 plus</td><td>Pour la culture E.coli</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Qualigens</td><td>Q27605</td><td>Tampon / Préparation de réactif</td></tr><tr><td>Dodécyl de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td>Tampon / Préparation de réactif</td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Fischer Scientific</td><td>15895</td><td>Tampon / Préparation de réactif</td></tr><tr><td>Phosphate de sodium Dibasic</td><td>Sigma</td><td>S5136</td><td>Tampon / Réactif préparation</td></tr><tr><td>Spectrophotomètre</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Estimation de la concentration plasmidique</td></tr><tr><td>Spin win</td><td>Trason</td><td>1020</td><td></td></tr><tr><td>StepOne plus Système de PCR en temps réel</td><td>Technologies de la vie</td><td>272006777</td><td>Pour qRT-PCR</td></tr><tr><td>Version du logiciel StepOne 2.3</td><td>Technologies de la vie</td><td></td><td>Pour qRT-PCR</td></tr><tr><td>TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2X), sans AmpErase UNG</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4366072</td><td></td></tr><tr><td>Cellule</td><td></td><td></td> Tinker <td>Construction et simulation de circuits synthétiques</td></tr><tr><td>TrackIt 1 Kb Plus Échelle d’ADN</td><td>ThermoFischer Scientific</td> 10488085 <td>Pour AGE</td><td></td></tr><tr><td>Tris (hydroxyméthyl) Chlorhydrate d’aminométhane</td><td>Himedia</td><td>MB029</td><td>Préparation de tampon / réactif</td></tr><tr><td>Tris-acétate-EDTA</td><td>SERVA</td><td>42549.1</td><td>Tampon / Préparation de réactif</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>Pour la numération cellulaire</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>BioLabs</td><td>R0146S</td><td>Enzyme de restriction</td></tr></tbody></table>

circuits immunométaboliques dans l’infection pour faire progresser les thérapies dirigées vers l’hôte

Immunometabolic Circuits in Infection for Advancing Host Directed Therapies

L’immunométabolisme est un déterminant essentiel de la progression de la leishmaniose. L’approche basée sur la biologie synthétique a suscité beaucoup d’attention en tant qu’étape vers une intervention thérapeutique ciblant les facteurs associés à l’hôte qui sont à l’origine de la leishmaniose. La biologie synthétique implique l’ingénierie de composants génétiques de manière orthogonale et modulaire pour moduler avec précision les systèmes biologiques, conférant de nouvelles fonctions aux cellules. Dans l’étude présentée, l’élucidation d’un pipeline systématique pour le développement d’un circuit synthétique inductible contrôlé par la tétracycline (TetON) visait à délivrer de la succinate déshydrogénase en tant qu’agent thérapeutique pour faciliter l’élimination des parasites Leishmania intracellulaires. Le protocole décrit décrit la conception d’un circuit synthétique et sa validation ultérieure. La stratégie proposée se concentre également sur l’incorporation de circuits synthétiques dans le squelette plasmidique en tant que véhicule d’administration. De plus, des machines d’administration utilisant des nanoparticules à base de polyplexes pour l’administration de circuits synthétiques ont été utilisées dans des lignées cellulaires de macrophages murins sans compromettre la morphologie cellulaire. La standardisation de la méthode a été effectuée pour sélectionner les cellules transfectées et déterminer la concentration d’induction optimale pour l’expression en circuit synthétique. Les observations révèlent une nette réduction de la charge parasitaire intracellulaire dans les cellules transfectées par rapport aux cellules infectées. Les cytokines pro-inflammatoires ont été exprimées après l’infection dans des cellules transfectées et induites par un circuit synthétique comme mécanisme pour favoriser l’élimination du parasite. Cela souligne que la méthode basée sur la biologie synthétique est une approche puissante dans la leishmaniose en ciblant les facteurs de l’hôte associés à la progression de la maladie.

La disposition des parties génétiques formant le circuit synthétique pour exprimer le circuit synthétique est illustrée (Figure 1A). Les parties correspondantes ont été clonées dans le vecteur pEGFP-N1 de manière orthogonale et modulaire, ce qui est représenté sur la figure 1B. La simulation du circuit synthétique a révélé une dynamique oscillatoire à la fois dans le SDHA et le répresseur de tétracycline. Cette observation suggère un modèle d’expression réciproque caractérisé par des fonctions d’onde périodiques. L’augmentation de la concentration de SDHA peut être attribuée à l’induction de la doxycycline, tandis que l’expression de TetR peut résulter d’une baisse des niveaux de doxycycline (figure 1C). Compte tenu de l’expression oscillatoire inductible de SDHA et TetR observée in silico, une stratégie de livraison de circuit synthétique à travers le vecteur plasmidique pEGFP-N1 a été conçue et mise en œuvre.
Les pièces iGEM identifiées pour l’étude comprennent BBa_K1493803 pour TetO, BBa_K4344028 pour la séquence de Kozak, BBa_C0040 pour TetR et BBa_K1537016 pour P2A, respectivement. L’identifiant d’accession NCBI pour SDHA est NM_025848. Ces composants ont été assemblés pour construire un circuit synthétique TetON inductible par la doxycycline, couvrant un total de 1317 paires de bases (Fichier supplémentaire 1). Comme TetO fonctionne comme un élément régulateur de l’ADN, sa séquence n’a pas été traduite. La séquence en aval de la séquence de Kozak, s’étendant de 5' TetR à l’extrémité 3' de P2A, positionnée en aval de SDHA, a été choisie pour la validation in silico de la traduction. L’observation a révélé l’absence de codons stop internes, assurant une translation ininterrompue sur toute la longueur de la séquence (Fichier supplémentaire 2). Les parties régulatrices d’un circuit synthétique de 1317 pb ont été insérées entre les sites de restriction NotI et XhoI, qui se trouvent à 5' en amont de l’EGFP (Figure 1B). Les résultats du séquençage mettent en évidence que la séquence d’insertion a été clonée dans le plasmide (Fichier supplémentaire 3).
L’introduction d’un circuit immunométabolique dans la souche DH5α d’E. coli a conduit à la croissance de colonies transformées présentant une résistance à la kanamycine, l’antibiotique utilisé comme marqueur sélectif lors de la transformation bactérienne. La présence abondante de colonies transformées sur la plaque de sélection était plus élevée, ce qui suggère que les cellules compétentes présentaient un fort potentiel de transformation, révélateur de l’efficacité du protocole de transformation utilisé (Figure 1D).
Une seule colonie a été isolée et ensemencée dans 10 mL de LB supplémenté en kanamycine pour l’isolement du plasmide. Le rendement plasmidique dérivé d’une culture de 10 mL est détaillé dans le tableau 1. Une méthode standard d’isolement des plasmides a été utilisée pour cette procédure. Les solutions tampons ont été fraîchement préparées la veille de l’isolement des plasmides, et les conditions d’incubation ont été optimisées pour maximiser le rendement plasmidique. La concentration plasmidique obtenue a dépassé 1 μg/μL, avec des rapports 260/280 et 260/230 dépassant respectivement 1,8 et 2,0. Ces résultats indiquent que les plasmides isolés étaient de grande pureté et dépourvus de contaminants tels que les protéines, l’EDTA, les glucides et le phénol.
Le décalage de mobilité électrophorétique pour le circuit synthétique isolé a été évalué. La digestion par restriction a été effectuée à l’aide des enzymes de restriction NotI et XhoI, car c’étaient les sites de restriction où le circuit synthétique était inséré. Deux bandes ont été observées sur un gel d’agarose à 1 %, une bande près de 1500 pb et une entre 4 kb et 5 kb. Étant donné que la taille de l’insert est de 1317 pb, la bande à 1500 pb correspond probablement à l’insert. Le vecteur pEGFP-N1 a une taille de 4,7 kb. Par conséquent, la bande proche de 5 kb est présumée être le vecteur pEGFP-N1. Par conséquent, on a déduit qu’un circuit synthétique complet et intact était présent dans le vecteur de livraison. De plus, une bande d’environ 6 kb a été détectée pour le circuit synthétique intact non digéré, indiquant que le vecteur pEGFP-N1 héberge un insert de près de 1,3 kb dans le vecteur plasmidique (Figure 1E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66980/66980fig01.jpg"> Figure 1 : Conception et validation de circuits synthétiques. (A) Représentation de circuits synthétiques par l’assemblage de parties génétiques et de composants régulateurs. (B) Graphique de simulation déterministe montrant l’expression périodique de SDHA et TetR à 100 unités de temps. (C) Colonies transformées en circuit synthétique d’E. coli DH5α résistantes à la kanamycine. L’unité est une unité de 100 fois car il s’agit d’une simulation déterministe. (D) Électrophorèse sur gel d’agarose d’un circuit synthétique intact et digéré par restriction à l’aide d’enzymes de restriction NotI et XhoI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/66980fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Concentration du plasmide (μg/mL)</td>
			<td>260/280</td>
			<td>260/230</td>
		</tr><tr><td>1248.5</td>
			<td>1.95</td>
			<td>2.45</td>
		</tr><tr><td>1123.1</td>
			<td>1.89</td>
			<td>2.43</td>
		</tr><tr><td>1155.8</td>
			<td>1.87</td>
			<td>2.41</td>
		</tr><tr><td>1056.8</td>
			<td>1.94</td>
			<td>2.47</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Rendement de la construction du circuit synthétique obtenu après isolement du plasmide. Le tableau montre la concentration du plasmide en μg/mL, leur rapport 260/280 et 260/230.
Dans les cellules témoins et infectées, l’intensité de fluorescence observée était faible pour la GFP. Cependant, on a observé que la transfection du circuit synthétique avec un rapport de 1:1 de plasmide et de PEI avec 500 μg/mL de G418 et l’induction avec 1 μg/μL de dox induisait une expression élevée de la GFP dans les cellules IMT. Dans les cellules IMTI de 6 h, l’expression de la GFP était également significativement plus élevée, bien que l’expression de la GFP soit plus faible que dans l’échantillon IMT (Figure 2A,B). De plus, une augmentation de l’expression de la GFP a été observée dans les échantillons IMTI 12 h, IMTI 18 h et IMTI 24 h. Cette augmentation peut être due à une augmentation du temps d’infection, qui pourrait avoir induit des altérations métaboliques plus importantes dans les macrophages par le parasite résidentiel17. Les taux intracellulaires de SDHA peuvent être affectés en raison d’une augmentation du temps d’infection18. Comme le dox a été complété à ces échantillons IMTI, les niveaux de SDHA par les circuits synthétiques ont pu augmenter, conduisant ainsi à une augmentation de l’expression de la SDHA.
Une coloration au DAPI a été effectuée pour identifier le nombre de parasites résidentiels dans les macrophages. Dans les macrophages infectés par 6 h de L. major , le nombre observé de parasites intracellulaires était de 6 cellules par macrophage, ce qui est plus élevé par rapport à l’échantillon IMTI de 6 h, qui avait 1 à 2 parasites intracellulaires par macrophage. Après la transfection et l’induction dox, une réduction significative de la charge parasitaire intracellulaire a été observée à différents moments de l’infection (Figure 2C). Les observations suggèrent que les circuits synthétiques pourraient avoir induit des effets d’élimination des parasites en stimulant l’expression de la SDHA.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66980/66980fig02.jpg"> Figure 2 : Microscopie confocale à balayage laser. Images d’échantillons de contrôle, infectés, IMT et IMTI. (A) Analyse de l’expression de la GFP dans tous les échantillons expérimentaux avec une barre d’échelle de 50 μm pour le contrôle, 6 h infectés et IMT, 20 μm pendant 6 h IMTI, 10 μm pour 12 h IMTI, 18 h IMTI, 24 h IMTI respectivement. Les canaux utilisés étaient DIC, DAPI, GFP et les images fusionnées de tous les canaux. (B) ANOVA à un facteur avec test de correction de Tukey de tous les échantillons expérimentaux (n = 3) pour l’expression de la GFP (p &lt; 0,05 est considéré comme significatif) Les barres d’erreur représentent l’écart-type. (C) Une analyse de l’ANOVA à un facteur avec le test de correction de Tukey de la charge parasitaire dans 100 cellules de macrophages pour des échantillons de (A) (n = 3) a été réalisée (p &lt; 0,05 est considérée comme significative). Les barres d’erreur représentent l’écart-type. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/66980fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
La détection des taux d’IL-10 et d’IL-12 dans les milieux de tous les échantillons a révélé que les concentrations d’IL-10 et d’IL-12 étaient les plus élevées 6 heures après l’infection, avec une régulation à la baisse des niveaux de cytokines après l’infection de 24 heures. Il n’y avait pas de différence significative dans les niveaux d’IL-10 et d’IL-12 lors de la transfection et de l’induction de circuits synthétiques. De plus, il y avait une différence non significative dans les niveaux d’IL-10 et d’IL-12 dans les échantillons de points temporels de l’IMTI (figure 3). L’échantillon infecté de 6 h a déjà montré l’expression de l’IL-10 et de l’IL-1219,20, l’observation d’une différence non significative entre l’IL-10 et l’IL-12 nous a fait étudier l’effet du circuit synthétique sur d’autres cytokines.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66980/66980fig03.jpg"> Figure 3 : ELISA de l’IL-10 et de l’IL-12 pour identifier leurs niveaux sécrétoires dans les milieux de différents échantillons. Les échantillons (n = 2) comprennent le contrôle, 6 h infecté, 24 h infecté, IMT 6 h, IMTI 12 h, IMTI 18 h, IMTI 24 h. Une analyse de l’ANOVA à deux facteurs avec l’analyse du test de correction de Tukey a été réalisée (p &lt;,05 est considéré comme significatif). Les barres d’erreur représentent l’écart-type. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/66980fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
La détection des niveaux de transcrits du TNF-α, de l’IFN-γ et du TGF-β dans les échantillons infectés dans les 6 h, les échantillons IMT et les échantillons IMTI dans les 24 h a révélé qu’une augmentation significative du TNF-α à 2,5 fois a été observée dans les échantillons IMTI sur 24 h par rapport aux échantillons infectés et IMTI (figure 4). Dans l’échantillon de 24 h de l’IMTI, une augmentation de 35 fois des taux d’IFN-γ a été observée par rapport aux échantillons d’infection et de TMI. Les taux de TGF-β, bien qu’ils aient montré une régulation positive significative à 1,5 fois dans l’échantillon IMTI de 24 h, la variation relative du pli était plus faible par rapport au TNF-α et à l’IFN-γ, ce qui suggère que les cytokines pro-inflammatoires sont significativement régulées à la hausse dans l’échantillon IMTI de 24 h.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66980/66980fig04.jpg"> Figure 4 : Analyse qRT-PCR des cytokines (A) TNF-α, (B) IFN-γ et (C) TGF-β pour les échantillons infectés 6 h, IMT et IMTI 24 h (n = 2). Une ANOVA à un facteur avec le test de correction de Tukey a été réalisée (p &lt; 0,05 est considéré comme significatif). Les barres d’erreur représentent l’écart-type. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/66980fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Fichier supplémentaire 1 : Séquence nucléotidique de parties génétiques assemblées pour former le circuit synthétique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/Supplementary%20file%201_RE.docx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier supplémentaire 2 : Séquence traduite d’un circuit synthétique exprimant TetR, P2A et SDHA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/Supplementary%20file%202_RE.docx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier supplémentaire 3 : Résultat du séquençage du circuit synthétique cloné dans le plasmide pEGFP-N1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/Supplementary%20file%203_RE.docx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Ici, un protocole pour la conception, la construction et l’administration d’un circuit synthétique inductible à base de tétracycline contrôlé par la tétracycline est présenté. L’effet des circuits synthétiques sur l’élimination des parasites et l’expression des cytokines peut être étudié en canalisant le pipeline présenté. Ce protocole est pertinent pour les chercheurs qui étudient les thérapies basées sur des circuits synthétiques dans les maladies infectieuses.

Circuits immunométaboliques dans l’infection pour faire progresser les thérapies dirigées vers l’hôte

Immuno-metabolism is a pivotal determinant in the progression of leishmaniasis. Synthetic biology-based approach has garnered significant attention as a ...

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Les monocytes font partie intégrante du système immunitaire inné humain qui dépendent du métabolisme glycolytique lorsqu’ils sont activés. Nous décrivons un protocole de cytométrie en flux pour mesurer l’expression des transporteurs de glucose et l’absorption de glucose par les monocytes totaux et les sous-populations de monocytes dans le sang total frais.

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Ce protocole décrit comment inoculer des souris C57BL / 6J avec la souche EGD de Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) et de mesurer l' interféron-γ (IFN-γ) Réponses par tueuses naturelles (NK), T (NKT) des cellules tueuses naturelles, et adaptative des lymphocytes T post-infection. Ce protocole décrit également la façon de mener des études de survie chez les souris après l' infection avec une DL 50 dose modifiée de l'agent pathogène.

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Nous décrivons une cellule mononucléaire périphérique humaine de sang (PBMC) — modèle humanisé basé de souris de xénogreffe pour la recherche translationnelle d'immuno-oncologie. Ce protocole pourrait servir de ligne directrice générale pour établir et caractériser des modèles similaires pour l'évaluation de la thérapie I-O.

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Champ électrique contrôlé par les migrations des Réalisé cellules progénitrices neurales dans des environnements 2D et 3D

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