Name: Analyse quantitative des métabolites alimentaires de la vitamine A dans les tissus oculaires et non oculaires murins à l’aide de la chromatographie liquide à haute performance (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Découvrez l'analyse quantitative des métabolites de la vitamine A par chromatographie liquide à haute performance dans les tissus oculaires et hépatiques de souris transgéniques. Cette méthode permet d'étudier les fonctions physiologiques des transporteurs STRA6 et RBPR2.

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<meta charset="utf8"></head><body>Analyse des métabolites de la vitamine A dans le tissu murin pour les études de la fonction de la rhodopsine

<table><tbody><tr><td><réactif fort></fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-octanol, adapté à la HPLC, &ge ; 99,5 %</td> <td>Sigma-Aldrich, Millipore Sigma</td><td>203-917-6</td><td></td></tr><tr><td>1,4-dioxane, adapté à la HPLC, &ge ; 99,5 %</td><td>Sigma-Aldrich, Millipore Sigma</td><td>204-661-8</td><td></td></tr><tr><td>11-cis-rétinal</td><td>National Eye Institute</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>11-cis-rétinol</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>TRC-R252105</td><td></td></tr><tr><td>13-cis-retinal</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>TRC-R239900</td><td></td></tr><tr><td>13-cis-retinol</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>TRC-R252110</td><td></td></tr><tr><td>Produits chimiques de recherche entièrement trans-rétiniens</td><td>de Toronto</td><td>TRC-R240000</td><td></td></tr><tr><td>Produits chimiques de recherche entièrement trans-rétinol</td><td>de Toronto Acétate d’éthyle</td><td>TRC-R252002</td><td></td></tr>, <tr><td>adapté à la CLHP, etc. ; 99,7 %</td><td>Sigma-Aldrich, Millipore Sigma</td><td>205-500-4</td><td></td></tr><tr><td>Hexane, HPLC Grade</td><td>Fisher Scientific, Spectrum Chemical</td><td>18-610-808</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol (HPLC)</td><td>Fisher Scienctific</td><td>A452SK-4</td><td></td></tr><tr><td>Palmitate de rétinyle</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>TRC-R275450</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (cristallin/certifié ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1260 Collecteur de fractions analytique Infinity II</td><td>Agilent</td><td>G1364F</td><td></td></tr><tr><td>1260 Pompe binaire Infinity II</td><td>Agilent</td><td>G7112B</td><td></td></tr><tr><td>1260 Détecteur à barrettes de diodes Infinity II</td><td>Agilent</td><td>G7115A</td><td></td></tr><tr><td>1260 Infinity II Thermostat multicolonnes</td><td>Agilent</td><td>G7116A</td><td></td></tr><tr><td>1260 Infinity II Vialsampler</td><td>Agilent</td><td>G7129A</td><td></td></tr><tr><td>ST40R Centrifugeuse réfrigérée</td><td>Thermo Scientific</td><td>TSST40R</td><td></td></tr><tr><td>Vacufuge Plus Concentrateur de centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>22820168</td><td></td></tr><tr><td>Consommables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 mL Flacons à vis ambrée</td><td>Agilent</td><td>5188-6535</td><td></td></tr><tr><td>Capuchon à sertir avec septa en PTFE/caoutchouc rouge, 11 mm</td><td>Agilent</td><td>5183-4498</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger coniques en verre jetables</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS9950215</td><td></td></tr><tr><td>Tube à bouchon à vis, 15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Insert de flacon, 150 &micro ; L, verre avec pieds en polymère</td><td>Agilent</td><td>5183-2088</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse quantitative des métabolites alimentaires de la vitamine a dans les tissus oculaires et non oculaires murins à l’aide de la chromatographie liquide à haute performance

Quantitative Analysis of Dietary Vitamin A Metabolites in Murine Ocular and Non-Ocular Tissues Using High-Performance Liquid Chromatography

Ici, nous avons utilisé la méthode décrite ci-dessus pour détecter et quantifier les rétinoïdes dans les tissus oculaires et systémiques murins et avons généré des chromatogrammes représentatifs. Nous donnerons en outre un résumé des rétinoïdes typiques qui peuvent être détectés dans ces tissus.
À l’âge de 6 mois, des souris ont été euthanasiées par asphyxie au CO2 . Pour maintenir le contenu en rétinoïdes oculaires, les souris ont été adaptées à l’obscurité pendant 2 jours avant l’euthanasie et l’extraction. Deux yeux, 0,2 g de foie et 75 μL de sang ont été prélevés pour l’extraction des rétinoïdes et l’analyse HPLC ultérieure. Pour le tissu oculaire, un œil a été extrait sans ajout d’hydroxylamine, tandis que l’autre a été soumis à un traitement à l’hydroxylamine. Pour le foie et le sang, le traitement à l’hydroxylamine n’était pas nécessaire car les rétinaldéhydes ne sont généralement pas détectés dans ces tissus.
Dans le chromatogramme de l’œil de souris non traité avec de l’hydroxylamine, le 13-cis-rétinal, l’un des deux isomères non canoniques du rétinaldéhyde, a été identifié. De plus, le 11-cis-rétinien et le tout-trans-rétinien, les deux isomères canoniques du rétinaldéhyde, ont été identifiés. Dans les deux chromatogrammes, l’intermédiaire du cycle visuel 11-cis-rétinol, ainsi que la principale forme de transport de la vitamine A, le tout-trans-rétinol, ont tous deux été identifiés (Figure 4A).
Dans le chromatogramme de l’œil de souris traité à l’hydroxylamine, tous les isomères de rétinaldéhyde mentionnés précédemment étaient encore présents. Cependant, les temps de rétention de ces isomères ont été considérablement augmentés. De plus, ces isomères du rétinaldéhyde se présentent maintenant à la fois sous forme d’isomères syn et d’anti-isomères. Lors de la quantification par intégration de pics, les pics syn et anti doivent être additionnés pour obtenir une valeur d’intégration précise. Le 11-cis-rétinol et le tout-trans-rétinol étaient toujours présents (figure 4B).
Dans le chromatogramme du tissu hépatique de souris, le palmitate de rétinyle et le tout-trans-rétinol ont été identifiés dans ces tissus. Le palmitate de rétinyle, un ester de rétinyle, sert de principale forme de stockage de la vitamine A chez les mammifères et peut être trouvé en quantités importantes dans le tissu hépatique des mammifères. Le foie libère de la vitamine A dans les tissus systémiques sous forme d’holo-RBP4, contenant du tout-trans-rétinol dans le complexe RBP4-transthryétine. Par la suite, un grand pic de rétinol tout trans peut être identifié dans ce chromatogramme (Figure 4C).
Dans le chromatogramme du sang de souris, un grand pic de tout trans-rétinol a été identifié. Étant donné que l’holo-RBP4 du foie est libéré dans les tissus systémiques par le système circulatoire, cela est conforme aux attentes (Figure 4D). L’absorbance caractéristique du spectre UV (~250-400 nm) des isoformes rétinoïdes sur les pics HPLC résolus en fonction du temps peut être utile pour confirmer initialement la qualité de la présence de l’isoforme dans un pic respectif particulier (Figure 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67034/67034fig01.jpg"> Figure 1 : Structures chimiques des rétinoïdes. (A) Ces rétinoïdes se trouvent généralement dans les tissus murins extraits. Notez les différents groupes d’extrémités polaires, ainsi que les différents emplacements des doubles liaisons cis dans les isomères rétinoïdes. (B) La conversion des rétinaldéhydes en oximes rétiniens augmente l’efficacité de l’extraction, empêche la coélution des pics avec le palmitate de rétinyle, ainsi que la coélution à l’intérieur des isomères du rétinaldéhyde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67034/67034fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67034/67034fig02.jpg"> Figure 2 : Flux de travail pour le prélèvement, l’homogénéisation, l’extraction et l’analyse des rétinoïdes. Des échantillons de rétines et de tissus de souris adaptées à l’obscurité ont été homogénéisés et extraits. Étape 1 : Après l’euthanasie des souris selon les directives, du sang et divers tissus sont prélevés. Etapes 2-4 : L’homogénéisation des tissus se fait ensuite avec une solution saline et du méthanol, avec du chlorhydrate d’hydroxylamine pour les analyses quantitatives. Étapes 5 à 7 : Les rétinoïdes sont traités à l’aide d’hexane, suivis d’une évaporation. Étapes 8 et 9 : Remise en suspension avec 100 μL d’hexane pour s’assurer que tous les rétinoïdes sont dissous. Étape 10 : Enfin, les échantillons sont analysés à l’aide de la HPLC. Abréviation : HPLC = High-performance Liquid Chromatography. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67034/67034fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67034/67034fig03.jpg"> Figure 3 : Chromatogramme des étalons rétinoïdes et des étalons rétinoïdes traités à l’hydroxylamine. (A) Ce chromatogramme contient des étalons de palmitate de rétinyle, 13-cis-rétinal, 11-cis-rétinal, tout-trans-rétinal, 11-cis-rétinol, 13-cis-rétinol et tout-trans-rétinol. (B) Ce chromatogramme contient des étalons de palmitate de rétinyle, de 13-cis-rétinal, de 11-cis-rétinal, de 11-cis-rétinol, de 13-cis-rétinol et de tout trans-rétinol. Ce chromatogramme contient les isomères syn et anti-oxime rétinaldéhyde, en plus des isomères du rétinol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67034/67034fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67034/67034fig04.jpg"> Figure 4 : Chromatogrammes représentatifs. (A) Chromatogramme représentatif du tissu oculaire de la souris. Ce chromatogramme contient des rétinoïdes généralement présents dans le tissu oculaire murin, y compris des isomères de rétinaldéhyde, en plus des isomères du rétinol. (B) Chromatogramme représentatif du tissu oculaire de souris traité à l’hydroxylamine. Notez qu’au lieu des rétinaldéhydes non chimiquement modifiés trouvés dans les chromatogrammes précédents (Figure 4A), ce chromatogramme contient les isomères syn et anti-oxime retinaldeyde, en plus des isomères du rétinol. (C) Chromatogramme représentatif du tissu hépatique de souris. Ce chromatogramme contient des rétinoïdes généralement trouvés dans le tissu hépatique murin, y compris le palmitate de rétinyle et le tout-trans-rétinol. (D) Chromatogramme représentatif du sang de souris. Ce chromatogramme contient des rétinoïdes que l’on trouve généralement dans le sang murin, y compris le tout-trans-rétinol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67034/67034fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67034/67034fig05.jpg"> Figure 5 : Spectre d’absorbance UV des isomères du rétinaldéhyde du tissu oculaire murin. Spectres d’absorbance de (A) 13-cis-rétinal, (B) 11-cis-rétinal, (C) 9-cis-rétinal, (D) tout-trans-rétinien, (E) syn 11-cis-rétinal, (F) oxime anti-11-cis-rétinien. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67034/67034fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67034/67034fig06.jpg"> Figure 6 : Vue d’ensemble des modules HPLC, de l’écoulement de phase mobile et d’autres instruments. L’écoulement en phase mobile commence à partir des flacons de solvant préparés et est pompé à haute pression par la pompe binaire dans l’échantillonneur automatique, où l’analyte est incorporé dans le flux de solvant. La phase mobile et l’analyte atteignent le compartiment de la colonne à température régulée, et enfin, dans le détecteur à barrettes de diodes pour la mesure. (A) Écran de moniteur teinté rouge minimisant la photoisomérisation des rétinoïdes. (B) Pompe binaire. (C) Échantillonneur de flacons. (D) Thermostat multicolonne. (E) Détecteur à barrettes de diodes. (F) Collecteur de fractions analytiques. (G) Conteneur à déchets en polyéthylène à haute densité. (H) De gauche à droite, bouchon à sertir en aluminium, insert de 250 μL avec pieds en polymère, flacon à sertir teinté ambré, assemblage final du flacon d’injection. (I) Centrifugeuse réfrigérée gauche. À droite, concentrateur de centrifugeuse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67034/67034fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Composé</td>
			<td>Absorptivité molaire (ε)</td>
			<td>Solvant</td>
			<td>Référence</td>
		</tr><tr><td>Palmitate de rétinyle</td>
			<td>49260</td>
			<td>Éthanol</td>
			<td>Hubbard et coll.49</td>
		</tr><tr><td>13-cis-rétinal</td>
			<td>35500</td>
			<td>Éthanol</td>
			<td>Hubbard et coll.49</td>
		</tr><tr><td>11-cis-rétinal</td>
			<td>24935</td>
			<td>Éthanol</td>
			<td>Hubbard et coll.49</td>
		</tr><tr><td>9-cis-rétinal</td>
			<td>36100</td>
			<td>Éthanol</td>
			<td>Robeson et coll.51</td>
		</tr><tr><td>All-trans-rétinien</td>
			<td>42880</td>
			<td>Éthanol</td>
			<td>Hubbard et coll.49</td>
		</tr><tr><td>11-cis-rétinol</td>
			<td>34890</td>
			<td>Éthanol</td>
			<td>Hubbard et coll.49</td>
		</tr><tr><td>13-cis-rétinol</td>
			<td>48305</td>
			<td>Éthanol</td>
			<td>Robeson et al.50 et Robeson et al.51</td>
		</tr><tr><td>All-trans-Rétinol</td>
			<td>52770</td>
			<td>Éthanol</td>
			<td>Hubbard et coll.49</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Absorptivité molaire des rétinoïdes dans l’éthanol. Les valeurs d’absorptivité molaire des rétinoïdes ont été recueillies à partir de Kane et Napoli44, Hubbard et al.46, Robeson et al.47 et Robeson et al.48. L’absorption molaire dépend du solvant. Les valeurs énumérées ici sont spécifiques aux rétinoïdes dissous dans l’éthanol.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Tissu</td>
			<td>Quantité de tissu prélevé</td>
			<td>Volume pour l’homogénéisation</td>
		</tr><tr><td>Sang</td>
			<td>75 μL</td>
			<td>N/A</td>
		</tr><tr><td>Foie</td>
			<td>0,2 g</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr><tr><td>Rein</td>
			<td>2 reins entiers</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr><tr><td>Peau</td>
			<td>0,2 g</td>
			<td>1 mL – 1,5 mL</td>
		</tr><tr><td>Rate</td>
			<td>1 rate entière</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>Oeil</td>
			<td>Les deux rétine, pool 4 rétine</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>Cerveau</td>
			<td>1 cerveau entier</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr><tr><td>Cœur</td>
			<td>1 cœur entier</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>Poumon</td>
			<td>0,2 g</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 2 : Quantité de tissu recommandée par analyse. Quantité de tissu par analyse et volume de 50 % de solution saline glacée (0,9 %) et de 50 % de méthanol pour l’homogénéisation des tissus, comme recommandé par Kane et Napoli44.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Composé</td>
			<td>Temps de rétention (min)</td>
			<td>Absorbance UV Maxima (nm)</td>
		</tr><tr><td>Palmitate de rétinyle</td>
			<td>5.177</td>
			<td>326</td>
		</tr><tr><td>13-cis-rétinal</td>
			<td>7.268</td>
			<td>366</td>
		</tr><tr><td>11-cis-rétinal</td>
			<td>7.691</td>
			<td>366</td>
		</tr><tr><td>9-cis-rétinal</td>
			<td>7.931</td>
			<td>364</td>
		</tr><tr><td>All-trans-rétinien</td>
			<td>8.993</td>
			<td>370</td>
		</tr><tr><td>11-cis-rétinol</td>
			<td>17.003</td>
			<td>318</td>
		</tr><tr><td>13-cis-rétinol</td>
			<td>17.83</td>
			<td>328</td>
		</tr><tr><td>All-trans-Rétinol</td>
			<td>23.933</td>
			<td>326</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 3 : Temps de rétention et longueurs d’onde d’absorbance maximale des rétinoïdes. Ces valeurs ont été observées lorsqu’elles étaient utilisées avec la méthode décrite et la phase mobile, comme détectée avec le détecteur à barrettes de diodes référencé.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Composé</td>
			<td>Temps de rétention (min)</td>
			<td>Absorbance UV Maxima (nm)</td>
		</tr><tr><td>Syn 11-cis-Oxime rétinien</td>
			<td>9.59</td>
			<td>346</td>
		</tr><tr><td>Syn Oxime tout-trans-rétinien</td>
			<td>10.6</td>
			<td>356</td>
		</tr><tr><td>Syn 13-cis-Oxime rétinien</td>
			<td>11.3</td>
			<td>352</td>
		</tr><tr><td>Oxime anti-13-cis-rétinien</td>
			<td>13</td>
			<td>356</td>
		</tr><tr><td>Oxime anti-cis-rétinien 11</td>
			<td>15.1</td>
			<td>350</td>
		</tr><tr><td>Anti Oxime tout-trans-rétinien</td>
			<td>19.7</td>
			<td>360</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 4 : Temps de rétention et longueurs d’onde d’absorbance maximale des rétinaldéhydes traités à l’hydroxylamine, résultant en isomères syn et anti-oxime de chaque rétinaldéhyde. Ces valeurs ont été observées lorsqu’elles étaient utilisées avec la méthode décrite et la phase mobile, comme détectée avec le détecteur à barrettes de diodes référencé.

Analyse quantitative des métabolites alimentaires de la vitamine A dans les tissus oculaires et non oculaires murins à l’aide de la chromatographie liquide à haute performance

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