Caractérisation des plaquettes procoagulantes par mesure de l’exposition à la phosphatidylsérine et de la libération de microvésicules à partir de plaquettes humaines purifiées
29 novembre 2024
La formation de plaquettes procoagulantes a été corrélée à un risque accru de thrombose. Voici un protocole précis d’isolement des plaquettes lavées du sang humain, destiné à quantifier l’exposition à la phosphatidylsérine et la libération de microvésicules, qui sont des caractéristiques distinctives des plaquettes procoagulantes.
La formation de procoagulant plaquettaire est cruciale pour maintenir l’hémostase. Ce processus implique l’expression des phospholipides et la libération de microvésicules à la surface des plaquettes, ce qui est essentiel pour les étapes de coagulation. Les évaluations de ce processus ont fourni de nouvelles données sur la façon dont les réponses procoagulantes plaquettaires sont dans diverses maladies humaines.
La cytométrie en flux a été une pierre angulaire et a été largement acceptée dans l’évaluation de l’expression de la phosphatidylsérine sur la libération de plaquettes et de microvésicules. L’isolement et l’analyse des plaquettes purifiées à partir du sang prennent du temps et nécessitent de l’équipement de laboratoire spécialisé, et ne sont donc pas actuellement disponibles pour le diagnostic clinique de routine. L’analyse de l’exposition à la phosphatidylsérine et de la libération de microvésicules est également difficile en raison de leur petite taille et du faible nombre d’événements positifs pour les marqueurs d’intérêt.
Pour commencer, prélevez du sang veineux périphérique dans des tubes de prélèvement contenant l’anticoagulant actif citrate trisodique avec de l’acide citrique et du dextrose. Retournez doucement le tube pour mélanger le sang avec l’anticoagulant et laissez reposer le mélange à température ambiante pendant 15 minutes. Comptez les plaquettes à l’aide d’un compteur de cellules automatisé pour déterminer la vitesse correcte de centrifugation.
Pour préparer le plasma riche en plaquettes, centrifugez le sang à 250 g pendant 10 minutes à température ambiante sans appliquer la pause. Ajoutez ensuite 1 millilitre d’ACDA et 6,25 microlitres d’apyrase à 9 millilitres de plasma riche en plaquettes. Centrifuger le mélange à 1,100 g pendant 10 minutes à température ambiante.
À l’aide d’une pipette de pâturage, prélever le surnageant contenant du plasma pauvre en plaquettes et remettre doucement la pastille plaquettaire en suspension dans 1 millilitre de tampon de lavage. Ajoutez ensuite 3 à 4 millilitres de tampon de lavage dans le tube et centrifugez-le à nouveau. Après avoir retiré le surnageant, remettez la pastille en suspension dans 1 millilitre de tampon de lavage.
Transférez 150 microlitres de suspension plaquettaire dans un tube de 1,5 millilitre pour compter les cellules dans un compteur de cellules automatisé. Ajoutez 3 à 4 millilitres de tampon de lavage à la suspension restante pour effectuer un lavage supplémentaire comme démontré précédemment. Ensuite, mettez à nouveau en suspension la pastille de plaquettes dans le tampon de réaction pour obtenir une concentration finale de 5 x 10 à la puissance 11 plaquettes par litre.
Pour commencer, obtenez des plaquettes lavées dans le tampon souhaité pour la cytométrie en flux. Préparez tous les agonistes et fluorochromes dans le tampon de réaction. Pour les dosages internes, ajoutez 100 microlitres de plaquettes lavées à une concentration de 50 x 10 à la puissance 9 plaquettes par litre dans différents tubes de traitement.
Agitez doucement chaque aliquote et incubez à 37 degrés Celsius pendant 5 minutes. Ajoutez ensuite 5 microlitres d’Annexin V-FITC non dilué dans chaque microtube et incuberez. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de tampon de réaction dans chaque tube pour arrêter le processus.
Identifiez la population plaquettaire à l’aide de la diffusion vers l’avant ou FSC et utilisez des graphiques de densité pour identifier chaque population indépendamment. Réglez le seuil négatif à l’extrême droite de la population de plaquettes à l’état de repos. Après activation, classez les événements à droite de cette coupure comme des plaquettes exposant la phosphatidylsérine.
Pour différencier les microvésicules, réglez le seuil à la valeur FSC la plus basse observée dans la population de plaquettes au repos. Après activation, classer les événements positifs à la phosphatidylsérine en dessous de ce seuil comme des microvésicules. Les mesures de base ont indiqué que moins de 2,9 % des plaquettes non activées présentaient une exposition à la phosphatidylsérine.
Lors de l’activation, 26,7 % des plaquettes sont devenues positives à la phosphatidylsérine avec le collagène, 9,1 % avec la thrombine et 36,2 % avec le collagène et la thrombine. Le traitement ionophore a donné 49,6 % de plaquettes positives à la phosphatidylsérine. La proportion de base de microvésicules était de 0,3 %Des augmentations significatives ont été observées uniquement avec le collagène et la thrombine ensemble à environ 11,4 % et plus encore avec les ionophores à 44 %
Aperçu
Cette étude examine la formation des plaquettes procoagulantes, qui jouent un rôle essentiel dans le maintien de l'hémostase. Le protocole mis au point permet l'isolement de plaquettes lavées à partir de sang humain afin de quantifier l'exposition de la phosphatidylsérine et la libération de microvésicules, des indicateurs clés des plaquettes procoagulantes.
Composantes clés de l'étude
Domaine de recherche
- Biologie des plaquettes
- Mécanismes de l’hémostase
- Réponses procoagulantes dans les maladies
Contexte
- Les plaquettes jouent un rôle important dans l’hémostase.
- Une activité procoagulante anormale est associée à diverses maladies humaines.
- La cytométrie en flux est essentielle pour évaluer l’activation des plaquettes et la libération de microvésicules.
Méthodes utilisées
- Isolation de plaquettes lavées à partir de sang humain par centrifugation.
- Cytométrie en flux pour quantifier l'exposition de la phosphatidylsérine et la libération de microvésicules.
- Utilisation de réactifs et de tampons spécialisés pour des mesures précises.
Résultats principaux
- Les niveaux de base d'exposition de la phosphatidylsérine se sont révélés inférieurs à 2,9 % dans les plaquettes non activées.
- L'activation a entraîné une augmentation significative des plaquettes positives pour la phosphatidylsérine, atteignant un maximum de 49,6 % après traitement avec l'ionophore.
- La formation de microvésicules a augmenté jusqu'à 44 % dans certaines conditions d'activation.
Conclusions
- L'étude établit un protocole fiable pour l'isolement et l'analyse des plaquettes.
- Les résultats contribuent à la compréhension de la fonction des plaquettes dans la santé et la maladie.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La caractérisation quantitative des plaquettes procoagulantes par l'exposition de la phosphatidylsérine et la libération de microvésicules est essentielle pour réduire le risque de toxicité thrombotique et comprendre les mécanismes hémostatiques en phase précoce de la découverte de médicaments. Ce protocole permet une mesure précise des états d'activation plaquettaire, renforçant la fiabilité prédictive dans la validation des cibles et la recherche translationnelle. Une évaluation fiable de ces biomarqueurs éclaire les décisions stratégiques au croisement de la biologie de la découverte et du développement préclinique.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet l'analyse des voies de coagulation induites par les plaquettes pour une détection mécanistique des risques.
- Permet la validation fonctionnelle de cibles influençant l'activation plaquettaire et les réponses procoagulantes.
- Fournit des paramètres quantitatifs pour la vérification d'hypothèses en recherche sur la thrombose et l'hémostase.
Développement de tests et de criblages
- Facilite la préparation de systèmes de plaquettes validés pour le criblage de composés en aval.
- Permet d'obtenir des lectures normalisées et reproductibles par cytométrie en flux pour le développement de tests.
- Permet une quantification fiable de l'exposition de la phosphatidylsérine et de la libération de microvésicules en tant que paramètres de criblage.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les profils d'activation plaquettaire in vitro avec des modèles de risque thrombotique pertinents pour la maladie.
- Permet une continuité allant de la découverte à la validation préclinique d'agents antithrombotiques ou procoagulants.
- Fournit des biomarqueurs translationnels pour des décisions d'avancement ajustées au risque.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Ce protocole s'intègre à l'interface entre la phase de découverte précoce et la recherche préclinique, permettant des études mécanistiques, la validation de cibles thérapeutiques et le développement de tests pour les programmes de thrombose et d'hémostase.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses et la clarification des voies impliquées dans la coagulation médiée par les plaquettes.
- Écrantage : Fournit des résultats quantitatifs reproductibles par cytométrie en flux pour l'évaluation de composés.
- Analytique : Permet une mesure précise du nombre de plaquettes positives pour la phosphatidylsérine et des microvésicules, destinée à des analyses comparatives.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre les données d'activation plaquettaire in vitro et l'évaluation préclinique du risque thrombotique.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme réutilisable d'analyse de la fonction plaquettaire applicable à plusieurs programmes.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la recherche sur la coagulation.
- Valeur opérationnelle : Standardise l'activation des plaquettes et la quantification des microvésicules pour des résultats reproductibles.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions d'aller/arrêt et améliore l'efficacité du capital en clarifiant précocement les risques biologiques.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des actifs ciblant les voies médiées par les plaquettes.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en biologie des plaquettes et en analyse par cytométrie en flux.
- Exige un équipement de laboratoire spécialisé et une infrastructure analytique adaptée.
- Implique une standardisation rigoureuse entre équipes des protocoles de sélection des populations cellulaires et de quantification.
- Une adaptation peut être nécessaire selon les sources de plaquettes ou les modèles de maladie.
- Les difficultés comprennent un faible nombre d'événements détectés et une complexité technique dans la détection des microvésicules.
