Name: Caractérisation des plaquettes procoagulantes par mesure de l’exposition à la phosphatidylsérine et de la libération de microvésicules à partir de plaquettes humaines purifiées (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T13:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: Découvrez la caractérisation des plaquettes procoagulantes par cytométrie en flux pour quantifier l'exposition à la phosphatidylsérine et la libération de microvésicules à partir de plaquettes humaines purifiées.

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<meta charset="utf8"></head><body>Analyse de la phosphatidylsérine plaquettaire et de la libération de microvésicules

<table><tbody><tr><td>(CD42b, GPIX) APC</td><td>Beckman Coulter</td><td>B13980</td><td></td></tr><tr><td>ACD-A Tubes de prélèvement sanguin</td><td>BD Vacutainer</td><td>366645</td><td></td></tr><tr><td>Annexin-V FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>560931</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase Grade VII</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6410</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine 30 %</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A9576</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2, 0.25M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>Acide citrique monohydraté</td><td>Merck</td><td>5949-29-1</td><td></td></tr><tr><td>Collagène&nbsp ;</td><td>Stago</td><td>86924</td><td></td></tr><tr><td>Glucose&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Hepes&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Ionophore&nbsp ;</td><td>Calbiochem/VWR</td><td>100105</td><td></td></tr><tr><td>KCl&nbsp ;</td><td>Merck</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0250</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>27810.295</td><td></td></tr><tr><td>NaOH&nbsp ;</td><td>Merck</td><td>1.06498</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogénocarbonate de sodium</td><td>Merck</td><td>6329</td><td>NaHCO3</td></tr><tr><td>Thrombin&nbsp ;</td><td>Hyphen Biomed</td><td>EZ 006 A</td><td></td></tr><tr><td>Citrate trisodique dihydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>Na3C6H5O7*2H2O</td></tr><tr><td>&alpha ; Intégrine IIb (CD41, GPIIb) PC7</td><td>Beckman Coulter</td><td>6607115</td><td></td></tr></tbody></table>

caractérisation des plaquettes procoagulantes par mesure de l’exposition à la phosphatidylsérine et de la libération de microvésicules à partir de plaquettes humaines purifiées

Procoagulant Platelet Characterization by Measuring Phosphatidylserine Exposure and Microvesicle Release from Human Purified Platelets

La quantification des plaquettes et des microvésicules procoagulantes est réalisée à l’aide de la coloration à l’Annexine-V, avec au moins 50 000 événements enregistrés par échantillon. Comme indiqué à l’étape 2.2, les mesures plaquettaires de base ont été prises à partir d’échantillons incubés avec un tampon de réaction, comme illustré à la figure 1A. La taille des plaquettes a été mesurée à l’aide de la valeur médiane de diffusion vers l’avant (FSC). Bien que la FSC soit influencée par divers facteurs, elle reste un indicateur courant de l’estimation de la taille des cellules, y compris celle des plaquettes. Des graphiques de densité de surface (figure 1A) ont été utilisés pour identifier et détecter les plaquettes au repos et les microvésicules libérées.
Dans le cas des plaquettes non activées, moins de 2,9 % présentaient de la phosphatidylsérine (PS), déterminée par coloration à l’annexine-V. Lors de l’activation des plaquettes lavées avec du collagène seul ou en conjonction avec de la thrombine ou de l’ionophore de calcium, il y a eu une augmentation observable de l’exposition au PS. Le collagène à lui seul a entraîné une augmentation de 26,7 % des plaquettes PS positives. La thrombine a eu des effets minimes sur l’exposition au PS (9,1%), mais lorsqu’elle est associée au collagène, elle a augmenté le pourcentage de plaquettes exposant le PS à 36,2%. À titre de référence, le traitement avec un ionophore de 2 μM a entraîné une procoagulation de 49,6 % des plaquettes.
La figure 1 montre que la proportion de base de microvésicules provenant de plaquettes lavées chez un individu en bonne santé était minime (0,3 %). Bien que la thrombine et le collagène aient légèrement augmenté la formation de microvésicules, ce n’est qu’avec la combinaison de collagène et de thrombine que la formation de microvésicules a augmenté de manière significative (figure 1D ; 11,4 %). L’ajout de 2 μM d’ionophore a permis d’exposer 44,0 % des microvésicules formées par les plaquettes de contrôle au PS.
La figure 2 fournit des informations sur la variation, la répétabilité et la reproductibilité attendues de ce processus.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67042/67042fig01.jpg"> 
Figure 1 : Exposition au PS et formation de microvésicules dans les plaquettes de contrôle au repos et activées. Les plaquettes étaient activées ou non activées (au repos) (A), avec 30 μg/mL de collagène (B), avec 0,5 U/mL de thrombine (C), avec des combinaisons de collagène et de thrombine (D) avec 2 μM d’ionophore. Les diagrammes à points représentatifs montrent la taille des plaquettes (diffusion vers l’avant (FSC log)) par rapport à la liaison Annexin-V. Des lignes horizontales et verticales (E) délimitent la population plaquettaire négative. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67042/67042fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67042/67042fig02.jpg"> 
Figure 2 : Répétabilité et reproductibilité de l’exposition au PS et de la formation de microvésicules après incubation avec un ionophore. Analyse de l’exposition au PS et de la formation de microvésicules après incubation avec un ionophore 2 μM ou 5 μM dans des plaquettes lavées, traitées ou non traitées avec du citrate (un chélateur calcique) : (A) de 4 témoins sains différents ; (B) à partir d’un témoin sain, répété 5 fois ; et (C) à partir de deux témoins sains préparés par deux techniciens différents. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67042/67042fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Numération plaquettaire dans le sang total (10,9 par ml)</td>
			<td>Forces centrifuges relatives (g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 &lt;</td>
			<td>70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30-50</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>51-100</td>
			<td>130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>101-150</td>
			<td>200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>151-300</td>
			<td>250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>301-600</td>
			<td>290</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&gt;600</td>
			<td>340</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 1 : Forces centrifuges relatives pour la préparation du plasma riche en plaquettes en relation avec la numération plaquettaire dans le sang total.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Réactif</td>
			<td>Quantité</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acide citrique monohydraté (C6H8O7. H2O, 38 mM)</td>
			<td>8 grammes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate trisodique dihydraté (Na3C6H5O7,2 H2O, 61 mM)</td>
			<td>180 grammes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose (C6H12O6, 136 mM)</td>
			<td>24,6 grammes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Le pH de la solution ne doit pas être ajusté. Maintenir la solution à 4 °C.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 2 : Préparation d’une solution aqueuse de 1 L d’acide-citrate-dextrose (ACD).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Réactif</td>
			<td>Quantité</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acide citrique monohydraté (C6H8O7. H2O, 36 mM)</td>
			<td>7,56 grammes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (103 mM)</td>
			<td>6 grammes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>4 grammes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2,6 H2O (1 mM)</td>
			<td>0,203 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Ajustez le pH à 6,5. Maintenir la solution à 4 °C.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 3 : Préparation de la solution mère du tampon de lavage.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Réactif</td>
			<td>Quantité</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% d’albumine sérique bovine (BSA)</td>
			<td>583 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2, 0,25 m</td>
			<td>400 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>40 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apyrase</td>
			<td>31,5 μL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 4 : Préparation d’une solution extemporanée de 50 mL de tampon de lavage à partir de la solution mère.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Réactif</td>
			<td>Quantité</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (137 mM)</td>
			<td>8 grammes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl (2,7 mM)</td>
			<td>0,2 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2,6 H2O (1 mM)</td>
			<td>0,203 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (5 mM)</td>
			<td>1,19 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3 (12 mM)</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4.2H 2O ; 0,3 million de kilomètres</td>
			<td>0,05 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Ajustez le pH à 7,4. Maintenir la solution à 4 °C.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 5 : Préparation d’une solution mère de tampon de réaction.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Réactif</td>
			<td>Quantité</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% d’albumine sérique bovine (BSA)</td>
			<td>167 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2, 0,25 m</td>
			<td>400 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 6 : Préparation d’une solution extemporanée de 50 mL de tampon de réaction à partir de la solution mère.

Caractérisation des plaquettes procoagulantes par mesure de l’exposition à la phosphatidylsérine et de la libération de microvésicules à partir de plaquettes humaines purifiées

Activated platelets promote coagulation primarily by exposing the procoagulant phospholipid phosphatidylserine (PS) on their outer membrane surfaces and ...

procoagulant-platelet-characterization-measuring-phosphatidylserine

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Biology

Biologie

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