Name: L’ablation cellulaire au laser chez des larves de drosophile intactes révèle une compétition synaptique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-26T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Découvrez l'ablation cellulaire au laser chez des larves de Drosophila intactes pour étudier la compétition synaptique lors de l'assemblage des circuits neuronaux. Cette méthode permet d'explorer les mécanismes moléculaires régulant le développement du système nerveux.

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Des expériences sur le microscope à 2 photons ont été réalisées dans le FAU Stiles-Nicholson Brain Institute Advanced Cell Imaging Core. Nous tenons à remercier la Jupiter Life Science Initiative pour son soutien financier.

Tous les animaux utilisés pour le protocole étaient de l’espèce Drosophila melanogaster. Il n’y a aucun problème éthique entourant l’utilisation de cette espèce. Une autorisation éthique n’était pas nécessaire pour effectuer ce travail. Les détails de l’espèce, des réactifs et de l’équipement de la drosophile utilisés dans l’étude sont répertoriés dans la table des matériaux.
1. Élevage de la drosophile et sélection du bon stade larvaire
<ol><li>Choisissez une ligne pilote Gal4 qui pilote l’expression dans les cellules à ablater et recombinez-la avec une ligne rapporteuse UAS-GFP ou croisez-la vers une ligne rapporteuse UAS-GFP. Élevez les mouches avec de la nourriture anti-mouches standard à 25 °C. REMARQUE : Pour l’ablation par fibre géante (GF), R91H05-Gal4 ou A307-Gal4 a été recombiné avec UAS-GFP. ShakB(lethal)-GAL4 recombiné avec UAS-GFP a été utilisé pour les ablations TTMn (voir Tableau des matériaux).</li>
	<li>Sélectionnez les larves qui ont commencé à émerger de la nourriture et rampez sur le côté de la fiole de nourriture. Ces larves sont au stade errant, qui est le stade préféré pour effectuer l’ablation des cellules GF. REMARQUE : L’ablation peut être effectuée à n’importe quel stade larvaire. Le dernier stade larvaire était important pour la manipulation du développement du GFS car les corps des cellules GF peuvent être facilement identifiés dans le cerveau, mais les axones GF n’ont pas établi de connexions avec leurs cibles à ce stade.</li>
</ol>2. Préparation de la larve du 3e stade
REMARQUE : Les larves ont été anesthésiées à l’aide d’une méthode semblable à celle de Burra et al.9. Pour que les temps de procédure soient courts, ne préparez qu’une seule larve à la fois. Une courte exposition à un anesthésique améliorera la survie des animaux de laboratoire10.
<ol><li>Préparez un plat en verre avec un couvercle hermétique. Placez une boule de coton dans le plat et, sous une hotte, ajoutez environ 3 à 5 ml d’éther éthylique (liquide dangereux et inflammable, blouse de laboratoire, gants, lunettes de protection). Couvrez le plat avec le couvercle.</li>
	<li>Prélever les larves individuelles du 3e stade dans les flacons de mouches. Au 3estade larvaire, les larves quittent le milieu alimentaire et rampent le long du côté du flaconalimentaire 11.<ol><li>Assurez-vous que les larves sont toujours en mouvement et n’ont pas commencé à former du puparium. Les larves qui sont stationnaires et qui présentent un raccourcissement du corps commencent la nymphose et ne conviennent pas à l’ablation. Ramassez les larves avec un petit pinceau. REMARQUE : Le 3èmestade larvaire commence après la deuxième mue à 72 h de développement (après la ponte), et dure jusqu’à la formation du puparium à 120 h pour les mouches élevées à 25 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Transférez une larve dans un petit récipient ouvert. Placez le récipient dans le plat en verre avec de l’éther éthylique et fermez bien le plat. Lorsque vous ouvrez le plat en verre, placez-le sous un tuba ou dans une hotte pour éviter que les fumées ne s’échappent.<ol><li>À intervalles de 30 s, retirez le couvercle avec la larve de la boîte et vérifiez la mobilité de la larve à l’aide d’un microscope de dissection. La larve sera généralement immobilisée en 1 min. Une fois que les crochets buccaux cessent de se contracter, la larve est prête à monter. Jetez toutes les larves qui ne sont pas complètement immobilisées après 3 min. REMARQUE : Le haut d’un couvercle renversé d’un tube de microcentrifugation (couvercle retiré du tube) peut être utilisé comme récipient.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Montage des larves sur des lames pour l’ablation
<ol><li>Placez la larve anesthésiée sur une lame de microscope en verre. Immergez la larve dans une goutte de sérum physiologique pour insectes ; Cela emportera une partie des débris alimentaires qui pourraient coller à la larve.</li>
	<li>Sous le microscope de dissection, retirez la majeure partie de la solution saline à l’aide d’un mouchoir en papier. Positionnez la face dorsale de la larve vers le haut pour l’ablation GF ou la face ventrale vers le haut pour l’ablation TTMn. Abaissez lentement une lamelle en verre sur la larve. Ajoutez une solution saline sur le côté de la lamelle pour remplir l’espace entre la lame de verre et la lamelle.</li>
	<li>Pour l’ablation GF, vérifiez le positionnement du cerveau sous un fort grossissement sur le microscope de dissection. Assurez-vous que le cerveau est au niveau et qu’il est visible à travers la cuticule. Souvent, le cerveau est recouvert de tissu adipeux, ce qui rend la visualisation et l’ablation cellulaire impossibles.<ol><li>Pour déplacer tout tissu adipeux recouvrant le cerveau, appliquez une légère pression sur la lamelle à l’aide d’une pince et déplacez la lamelle d’un côté à l’autre. Si le tissu adipeux ne peut pas être éloigné du cerveau de cette façon, utilisez une autre larve à la place.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Localisation des cellules cibles
REMARQUE : Le système multiphotonique utilisé pour cette étude a été monté sur un microscope vertical. Un logiciel spécifique au système a été utilisé pour contrôler les paramètres d’acquisition et de stimulation laser. Le système était équipé d’une source lumineuse à épifluorescence pour localiser les échantillons. L’objectif était un objectif à immersion dans l’eau avec un grossissement de 25x, une longue distance de travail de 2 mm et une NA de 1,10.
<ol><li>Placez l’échantillon sur la platine du microscope multiphotonique et utilisez le filtre GFP pour localiser l’échantillon en mode épifluorescence. Pour l’ablation GF, les corps cellulaires peuvent être identifiés dans le cerveau, comme le montrent les figures 1A, C et D. Pour l’ablation TTMn, un groupe de quatre cellules peut être identifié du côté ventral dans le cordon nerveux ventral (VNC), comme le montre la figure 1A,B. Une fois la mise au point terminée, centrez les cellules dans le champ de vision et passez en mode 2 photons.</li>
</ol>5. Configuration des paramètres d’ablation
<ol><li>Ajustez les paramètres laser et le gain du détecteur pour visualiser les cellules exprimant la GFP avec le scanner Galvano. Une longueur d’onde de 870 nm fonctionne mieux pour visualiser le signal GFP. Centrez la cellule dans le champ de vision.</li>
	<li>Utilisez une zone d’intérêt circulaire pour définir la zone d’ablation. Assurez-vous que le retour d’intérêt couvre la majeure partie de la surface de la cellule (Figure 1E,G).</li>
	<li>Configurez le protocole d’ablation dans le logiciel. Définissez une image d’acquisition, puis une stimulation, suivie d’une autre image d’acquisition.</li>
	<li>Démarrez le réglage de la puissance du laser de stimulation à une valeur inférieure (10 %-20 %) et exécutez le protocole de stimulation. Une ablation réussie peut être reconnue par un cercle clair au centre du soma cellulaire à l’emplacement du ROI et une augmentation de la fluorescence autour du ROI (Figure 1F).<ol><li>Si l’ablation n’a pas réussi et n’a fait que blanchir la cellule (Figure 1H), augmentez la puissance du laser par incréments de 5 % ou le nombre de boucles une à la fois et exécutez à nouveau le protocole. La puissance laser appliquée était comprise entre 10 % et 40 % pour le système utilisé dans le protocole. REMARQUE : Les paramètres de puissance du laser pour l’ablation dépendent grandement de la profondeur à laquelle les cellules sont situées dans le tissu et d’autres facteurs tels que le pliage de la cuticule. Si les cellules sont brillantes et clairement visibles, la puissance laser se situera à l’extrémité inférieure de la plage. La puissance laser sera différente pour chaque système en fonction du modèle de laser et de l’âge du laser.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67053/67053fig01.jpg"> Figure 1 : Identification des neurones pour l’ablation laser chez les larves intactes de Drosophila L3. (A) Schéma de l’emplacement du soma en fibre géante (GF) dans le cerveau et de l’amas de motoneurones contenant le motoneurone tergotrochantéral (TTMn) dans le cordon nerveux ventral (VNC). (B) Projection d’intensité maximale de l’expression motrice de la GFP par shakB(lethal)-Gal4 dans la VNC larvaire. La ligne médiane est indiquée par la ligne pointillée. Le cercle indique le groupe de neurones contenant le TTMn qui sont ciblés pour l’ablation laser. Barre d’échelle : 50 μm. (C) Vue de projection partielle du cerveau larvaire exprimant la GFP sous le contrôle de A307-Gal4. Le cercle indique le soma GF ciblé pour l’ablation au laser. Barre d’échelle : 50 μm. (D) Projection d’intensité maximale du cerveau avec R91H05-Gal4 pilotant UAS-GFP. Les deux GF (cercles) sont identifiables par leur emplacement, leur forme et leur taille. Barre d’échelle : 50 μm. (E) Vue agrandie de GF soma avant ablation laser. Le cercle magenta indique la région cible pour l’ablation laser. Barre d’échelle : 10 μm. (F) Vue agrandie de GF soma après administration de la puissance laser localisée et ablation réussie. Barre d’échelle : 10 μm. (G) Vue agrandie de la taille avant l’ablation laser. Le cercle magenta indique la région cible pour l’ablation laser. Barre d’échelle : 10 μm. (H) Vue agrandie du soma GF après administration de la puissance laser localisée et ablation infructueuse (blanchiment). Barre d’échelle : 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67053/67053fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
6. Récupération des larves
<ol><li>Après avoir réussi à ablater la cellule, retirez la lamelle et ramassez doucement les larves de la lame avec un pinceau. Placez les larves dans un flacon alimentaire. Les larves recommenceront à ramper dans les 30 minutes. REMARQUE : La réduction de la durée de la procédure améliore les taux de survie des animaux. Avec de l’expérience, l’expérience peut être réalisée en un peu moins de 10 minutes.</li>
	<li>Continuez à élever les larves dans des conditions normales jusqu’à ce qu’elles se ferment de l’enveloppe nymphale.</li>
</ol>7. Test de la fonctionnalité du GFS chez les mouches adultes
REMARQUE : Les étapes suivantes sont expliquées en détail dans Allan et Godenschwege12, et Augustin et al.13.
<ol><li>Testez les mouches adultes à l’âge de 2 à 5 jours après l’éclosion. Anesthésisez les mouches avec du CO2 et montez-les sur de la cire dentaire en poussant les pattes dans la cire. Déployez les ailes à un angle de 90° et fixez-les en place avec la cire. Fixez la tête en enfonçant la trompe dans la cire.</li>
	<li>Placez des fils de stimulation dans les deux yeux, un fil de terre dans l’abdomen et des électrodes d’enregistrement en verre dans les muscles de saut (TTM) de chaque côté.</li>
	<li>Stimulez le circuit GF avec des stimuli uniques pour mesurer la latence de réponse des deux muscles. Stimulez le circuit avec des trains de stimuli de 100 Hz et 200 Hz, respectivement, pour mesurer la fréquence suivante pour les deux muscles.</li>
</ol>8. Dissection et marquage du système de fibres géantes pour l’imagerie confocale
REMARQUE : La dissection du SNC des mouches et l’injection de colorant sont détaillées dans Boerner et Godenschwege14.
<ol><li>Retirez délicatement la mouche de la cire dentaire à l’aide d’une pince et transférez-la dans une boîte de Pétri doublée d’élastomère de silicone sous un endoscope de dissection.</li>
	<li>Retirez les pattes, les ailes et la trompe avec des ciseaux et utilisez des épingles à insectes pour fixer la face dorsale de la mouche vers le haut dans le revêtement en élastomère.</li>
	<li>Faites une incision latérale le long de la ligne médiane à partir du milieu de l’abdomen, à travers tout le thorax et le long du cou, en reliant le thorax à la tête. Ouvrez la mouche avec des épingles à insectes. Retirez les organes et les glandes de la mouche sans endommager le système nerveux. REMARQUE : À ce stade, les axones GF peuvent être injectés avec des colorants pour marquer les GF et les neurones couplés électriquement13.</li>
	<li>Retirez la capsule cérébrale de la tête pour exposer le cerveau.</li>
</ol>9. Immunohistochimie du système nerveux
<ol><li>Après dissection du SNC, fixer la mouche dans 4% de PFA dans du PBS pendant 45 min à température ambiante (RT). Laver pendant 20 min dans PBS à RT (3 fois).</li>
	<li>Bloquer l’échantillon pendant 1 h à RT dans 3% BSA dans PBS avec une solution détergente à 0,5%.</li>
	<li>Incuber pendant 2-3 nuits à 4 °C dans 3% BSA dans du PBS avec une solution détergente à 0,3% et anti-GFP pour lapin (1:500). Laver pendant 20 min en PBS à RT (6 fois).</li>
	<li>Incuber une nuit à 4 °C dans du PBS avec l’anti-lapin Alexa 488. Laver pendant 20 min en PBS à RT (6 fois).</li>
	<li>Déshydrater les échantillons avec une série ascendante d’éthanol (50 %, 70 %, 90 %, 100 % d’éthanol) pendant 10 min à chaque étape. Retirez les broches et coupez l’abdomen et les muscles de vol. Transférez le reste du thorax contenant le système nerveux sur une lame et couvrez-le d’un milieu de montage comme le salicylate de méthyle. Placez une lamelle sur l’échantillon et scellez-la avec du vernis à ongles.</li>
	<li>Imager le système nerveux au microscope confocal pour analyser l’anatomie de la terminaison GF.</li>
</ol>

Ablation d’un seul neurone chez la drosophile pour l’étude de l’adaptation du système nerveux

<ol><li>Chung, S. H., Mazur, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+laser+ablation+of+neurons+in+C.+elegans+for+behavioral+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Phys+A+Mater+Sci+Process%22%5BJournal%5D)">Femtosecond laser ablation of neurons in C. elegans for behavioral studies.</a> Appl Phys A Mater Sci Process. 96 (2), 335-341 (2009).</li>
<li>Bower, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+branching+has+conserved+needs+for+local+parasympathetic+innervation+but+not+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Airway branching has conserved needs for local parasympathetic innervation but not neurotransmission.</a> BMC Biol. 12, 92(2014).</li>
<li>Angelo, J. R., Tremblay, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-mediated+cell+ablation+during+post-implantation+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Laser-mediated cell ablation during post-implantation mouse development.</a> Dev Dyn. 242 (10), 1202-1209 (2013).</li>
<li>Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, M. A., Phelan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+an+escape%3A+Development+and+function+of+the+Drosophila+giant+fibre+system%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Making an escape: Development and function of the Drosophila giant fibre system.</a> Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 31-41 (2006).</li>
<li>Hubel, D. H., Wiesel, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binocular+interaction+in+striate+cortex+of+kittens+reared+with+artificial+squint%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Binocular interaction in striate cortex of kittens reared with artificial squint.</a> J Neurophysiol. 28 (6), 1041-1059 (1965).</li>
<li>Wiesel, T. N., Hubel, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+effects+of+unilateral+and+bilateral+eye+closure+on+cortical+unit+responses+in+kittens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of the effects of unilateral and bilateral eye closure on cortical unit responses in kittens.</a> J Neurophysiol. 28 (6), 1029-1040 (1965).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Allen, M. J., Drummond, J. A., Moffat, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+giant+fiber+neuron+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Development of the giant fiber neuron of Drosophila melanogaster.</a> J Comp Neurol. 397 (4), 519-531 (1998).</li>
<li>Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Drosophila+larvae+to+study+epidermal+wound+closure+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Using Drosophila larvae to study epidermal wound closure and inflammation.</a> Methods Mol Biol. 1037, 449-461 (2013).</li>
<li>Kakanj, P., Eming, S. A., Partridge, L., Leptin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+imaging+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo imaging of Drosophila larvae.</a> Nat Protoc. 15 (3), 1158-1187 (2020).</li>
<li>Bainbridge, S. P., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 66, 57-80 (1981).</li>
<li>Allen, M. J., Godenschwege, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+recordings+from+the+Drosophila+giant+fiber+system+%28GFs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological recordings from the Drosophila giant fiber system (GFs).</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (7), 5453(2010).</li>
<li>Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+recordings+from+the+giant+fiber+pathway+of+d.+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological recordings from the giant fiber pathway of d. Melanogaster.</a> J Vis Exp. (47), e2412(2011).</li>
<li>Boerner, J., Godenschwege, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+preparation+of+the+adult+Drosophila+ventral+nerve+cord+for+giant+fiber+dye+injection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole mount preparation of the adult Drosophila ventral nerve cord for giant fiber dye injection.</a> J Vis Exp. (52), e3080(2011).</li>
<li>Blagburn, J. M., Alexopoulos, H., Davies, J. A., Bacon, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Null+mutation+in+shaking-b+eliminates+electrical%2C+but+not+chemical%2C+synapses+in+the+Drosophila+giant+fiber+system%3A+A+structural+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Null mutation in shaking-b eliminates electrical, but not chemical, synapses in the Drosophila giant fiber system: A structural study.</a> J Comp Neurol. 404 (4), 449-458 (1999).</li>
<li>Kennedy, T., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+identified+electrically+coupled+neurons+support+development+of+the+Drosophila+giant+fiber+model+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Newly identified electrically coupled neurons support development of the Drosophila giant fiber model circuit.</a> eNeuro. 5 (6), 0346(2018).</li>
<li>Mcfarland, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+arrival+times+and+physical+occupancy+establish+visual+projection+neuron+integration+on+developing+dendrites+in+the+Drosophila+optic+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Axon arrival times and physical occupancy establish visual projection neuron integration on developing dendrites in the Drosophila optic glomeruli.</a> bioRxiv. , (2024).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’ablation cellulaire à l’aide d’un microscope à 2 photons s’est avérée être une méthode très efficace pour manipuler le développement des circuits neuronaux chez la drosophile. Comme cette méthode est non invasive, elle cause des dommages minimes à l’animal. Les données soutiennent l’utilité de cette manipulation spécifique aux cellules de circuits connus.
Le choix du pilote Gal4 le plus approprié était crucial pour le succès de l’ablation. Comme le GFS est bien étudié, de nombreuses lignes de pilote spécifiques à Gal4 ont été décrites7. La plupart des haut-parleurs Gal4 sont très restreints mais toujours exprimés dans de nombreux autres neurones. L’un des défis consistait à identifier de manière fiable les cellules cibles de l’animal intact. Pour les animaux avec une étiquette GFP clairement visible, l’ablation pouvait être effectuée à faible puissance laser et ne nécessitait souvent qu’un seul essai. Chez les animaux où le tissu adipeux recouvrait le cerveau ou où l’expression de la GFP était faible, la délétion des cellules cibles nécessitait une puissance laser plus élevée et plusieurs boucles d’exposition au laser. Les corps cellulaires GF étaient situés à environ 100 m de profondeur de la face dorsale du cerveau. Pour les expériences où les cellules cibles sont situées à une profondeur plus profonde, il pourrait être utile d’effectuer l’ablation à des stades larvaires plus précoces, lorsque le système nerveux est plus petit.
Dans des expériences précédentes en laboratoire, différentes méthodes d’ablation cellulaire ont été explorées. L’utilisation du système UAS/Gal4 pour piloter l’expression des toxines a également conduit à la suppression de neurones spécifiques. Cependant, il est beaucoup plus difficile de contrôler la délétion de cellules uniques et d’éviter les effets hors cible. L’autre difficulté est de contrôler le moment exact de l’événement de délétion cellulaire. L’ablation cellulaire au laser a permis un contrôle précis de l’emplacement de la cible et du moment de la délétion, mais il restait encore quelques défis à relever avant que la méthode ne soit perfectionnée et que des taux de réussite de plus de 80 % (survie des animaux et ablation cellulaire réussie) soient atteints. Le taux de survie des animaux a été affecté négativement par une longue exposition à l’éther éthylique et de longues durées de procédure. Des études ont montré que des taux de survie élevés à la nymphose (78 %) et à l’éclosion à l’âge adulte (67 %) peuvent être atteints pour une exposition de 3,5 minutes de larves de drosophile L3 à l’éther éthylique10. Une exposition de 3,5 minutes garantira que l’animal reste immobile jusqu’à 8 heures. Pour l’ablation cellulaire au laser, les animaux doivent être immobiles pendant 30 minutes ou moins. Par conséquent, le temps d’exposition à l’éther éthylique peut être maintenu bien en dessous de 3,5 min. Dans la plupart des cas, les larves étaient complètement immobiles en 1 minute.
Les résultats de l’ablation au laser démontrent que le GF peut être ablaté proprement, et l’effet sur le GF voisin controlatéral est facilement évalué. Le résultat de l’ablation était clair et cohérent. Dans 13 des 15 ablations sur cellule unique, les autres partenaires GF présentent une terminaison bilatérale qui n’a jamais été observée chez les animaux témoins. Cette terminaison à symétrie bilatérale est facilement reconnaissable, et la branche controlatérale inhabituelle est de taille similaire à une terminaison normale et est couplée par colorant au motoneurone cible controlatéral. La terminaison bilatérale est couplée à un colorant aux deux motoneurones cibles et fonctionne presque de type sauvage dans la plupart des spécimens, pilotant à la fois la cible normale-ipsilatérale ainsi que le motoneurone cible controlatéral avec des latences et suivant des fréquences proches des valeurs de contrôle.
L’expérience complémentaire, une ablation unilatérale d’un motoneurone cible, fournit une comparaison intéressante. Le motoneurone restant présente souvent une croissance dendritique réactive, étendant un processus à travers la ligne médiane dans l’espace normalement occupé par le voisin supprimé. Bien que cette dendrite ne soit pas aussi grosse que celle supprimée, elle démontre une réaction similaire à celle des GF manquant leur partenaire bilatéral. En revanche, le GF maintenant sans cible ne répond que modestement à la cible absente, étendant les processus mineurs sur la ligne médiane et le long des dendrites restantes des motoneurones. Cette réponse modeste contraste fortement avec la réponse spectaculaire du GF à un GF homologue bilatéral manquant, où un grand terminal controlatéral est formé pour compléter le terminal normal et former un terminal bilatéral.
Une expérience d’ablation parallèle a récemment été réalisée sur les entrées présynaptiques du GF dans le cerveau, où un type similaire de « compétition » pour l’espace synaptique a été révélé17. Entrées visuelles vers la tuile GF le glomérule où les neurones de projection visuelle (VPN) atteignent les dendrites GF. La suppression d’un groupe de VPN (dans ce cas, génétiquement) démontre que les VPN restants prennent le contrôle et innervent une partie de l’espace synaptique du voisin absent et produisent une récupération physiologique compensatoire de la réponse visuelle aux stimuli imminents. Lorsque les premières afférences arrivantes sont supprimées, les arrivées ultérieures occupent de l’espace et ne sont plus occupées. La principale similitude phénoménologique avec le présent travail est le rôle apparent que joue l’occupation physique dans la détermination de l’équilibre entre les divers intrants. Les bornes de sortie des deux GF semblent être en concurrence l’une avec l’autre pour l’espace synaptique physique.

L’ablation au laser est un outil privilégié pour disséquer les circuits neuronaux dans une grande variété d’organismes. Développé dans des systèmes génétiques modèles comme les vers et les mouches, il a été appliqué dans tout le règne animal pour étudier la structure, la fonction et le développement du système nerveux 1,2,3. Ici, l’ablation d’un seul neurone a été utilisée pour étudier comment les neurones interagissent lors de l’assemblage des circuits chez la drosophile. Le système d’échappement de la mouche est un circuit de prédilection pour l’analyse car il contient les plus grands neurones et les plus grandes synapses de la mouche adulte, et le circuit a été bien caractérisé au cours des dernières décennies4. Le rôle que jouent les interactions neurones-neurones dans l’assemblage du circuit de la fibre géante est au cœur de cette recherche.
Un type d’interaction qui a été un point central en neurosciences depuis les travaux de Hubel et Wiesel dans les années 1960 est la « compétition synaptique »5,6. Dans ce protocole, l’ablation laser a été utilisée pour revisiter le rôle de la compétition par ablation unicellulaire dans le système de fibres géantes (GFS) de la drosophile, où les fondements moléculaires du phénomène pourraient être découverts.
L’ablation des neurones chez la mouche en développement a été difficile pour diverses raisons, notamment la visualisation des neurones cibles, la précision de la méthode d’ablation et la survie de l’échantillon. Pour surmonter ces problèmes dans le GFS, le système UAS/Gal47 a été utilisé pour marquer les neurones d’intérêt, et un microscope à deux photons a été utilisé pour retirer la fibre géante présynaptique ou le motoneurone de saut postsynaptique (TTMn).
Dans cette étude, pour déterminer le rôle que jouent les neurones bilatéraux voisins dans l’ajustement de la connectivité synaptique et de la force synaptique dans le GFS, l’une des paires bilatérales de neurones (GF présynaptique ou motoneurone postsynaptique) a été supprimée juste avant le développement de la nymphe. À ce stade de développement, l’axonogenèse de GF n’est pas terminée8. La structure GF et la fonction du circuit synaptique chez l’adulte ont ensuite été examinées, avec une attention particulière accordée à la sortie du GF restant.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Chèvre Anti-Lapin IgG (H+L)</td><td>Jaxkson ImmunoResearch</td><td>111-545-003</td><td></td></tr><tr><td>Protéine fluorescente anti-verte, lapin</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11122</td><td>Concentration 1:500</td></tr><tr><td>Apo LWD 25x/1.10W Objectif</td><td>Nikon</td><td>MRD77220</td><td>immersion dans l’eau longue distance de travail</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma</td><td>B4287-25G</td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Ti :Sapphire Vision II Laser</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cotton Ball</td><td>Genesee Scientific</td><td>51-101</td><td></td></tr><tr><td>Dextra, tétraméthylrhodamine, 10 000 MW, lysine fixable (fluoro-rubis)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D1817</td><td></td></tr><tr><td>Recette saline</td><td></td><td></td><td>de drosophile de Gu et O’Dowd, 2006</td></tr><tr><td>Éther éthylique</td><td>Fisher Scientific</td><td>E134-1</td><td>Danger, Liquide inflammable</td></tr><tr><td>Nourriture pour mouches B (recette de Bloomington)</td><td>LabExpress</td><td>7001-NV</td><td></td></tr><tr><td>Salicylate de méthyle</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3695-500</td><td></td></tr><tr><td>Tube de microcentrifugation 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>Microscope cover-slip 18x18 #1.5</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541A</td><td></td></tr><tr><td>Vecteur traceur de neurobiotine</td><td> Laboratoires</td><td>SP-1120</td><td></td></tr><tr>Microscope <td></td><td></td><td>multiphotonique Nikon A1R</td><td>sur un support de microsope FN1 vertical</td></tr><tr><td>NIS Elements Advanced Research</td><td>Nikon</td><td></td><td>Logiciel d’acquisition et d’analyse</td></tr><tr><td>de données Paraformaldéhyde (PFA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>T353-500</td><td></td></tr><tr><td>PBS (Phosphate Buffered Salin)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP2944-100</td><td>Comprimés</td></tr><tr><td>R91H05-GAL4</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>40594</td><td></td></tr><tr><td>shakB(lethal)-GAl4</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>51633</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost microscope lame de verre</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-143</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>422355000</td><td>solution détergente</td></tr><tr><td>UAS-10xGFP</td><td>Bloomington Centre de stock de drosophile</td><td>32185</td><td></td></tr></tbody></table>

l’ablation cellulaire au laser chez des larves de drosophile intactes révèle une compétition synaptique

Laser Cell Ablation in Intact Drosophila Larvae Reveals Synaptic Competition

Le protocole décrit l’ablation d’un seul neurone avec un système laser à 2 photons dans le système nerveux central (SNC) de larves intactes de Drosophila melanogaster . En utilisant cette méthode non invasive, le système nerveux en développement peut être manipulé d’une manière spécifique à la cellule. Perturber le développement de neurones individuels dans un réseau peut être utilisé pour étudier comment le système nerveux peut compenser la perte d’entrée synaptique. Les neurones individuels ont été spécifiquement ablatés dans le système de fibres géantes de la drosophile, en mettant l’accent sur deux neurones : la fibre géante présynaptique (GF) et le motoneurone tergotrochantéral postsynaptique (TTMn). Le GF fait synapse avec le TTMn ipsilatéral, ce qui est crucial pour la réponse de fuite. L’ablation de l’un des GF dans le cerveau du 3estade, juste après le début de la croissance axonale, élimine définitivement la cellule pendant le développement du SNC. Le GF restant réagit au voisin absent et forme une terminaison synaptique ectopique au TTMn controlatéral. Cette terminaison atypique, à symétrie bilatérale, innerve les deux TTMn, comme le démontre le couplage des colorants, et entraîne les deux motoneurones, comme le démontrent les tests électrophysiologiques. En résumé, l’ablation d’un seul interneurone démontre une compétition synaptique entre une paire bilatérale de neurones qui peut compenser la perte d’un neurone et restaurer des réponses normales au circuit d’échappement.

Cette méthode peut être utilisée pour manipuler le développement de réseaux neuronaux spécifiques dans le système nerveux de la drosophile. La principale question de recherche ici était la formation de connexions synaptiques. L’élimination de la GF présynaptique ou de la TTMn postsynaptique a permis d’étudier la synaptogenèse réactive au niveau de cette synapse centrale et les mécanismes moléculaires cruciaux pour la fonction et le développement synaptiques. Comme décrit dans le protocole, l’ablation cellulaire au laser de l’un des GF ou de l’un des TTMn a été effectuée, et les effets sur la synapse après le développement de la nymphe chez la mouche adulte ont été analysés.
Pour s’assurer que la procédure n’a pas d’effet négatif sur la survie des animaux, des ablations simulées ont été effectuées en parallèle. Pour les ablations simulées, les animaux ont été traités de la même manière que les animaux de laboratoire, mais les impulsions laser ont été délivrées avec une puissance laser de 0 %. Dans 82,4 % des cas, les animaux issus de fausses ablations sont devenus des mouches adultes. Les GF de mouches ablées simulées ont été capables de répondre avec une latence inférieure à 1 ms et de suivre une stimulation de 100 Hz pour 79,3 % des stimuli. L’anatomie de GF était impossible à distinguer de celle des mouches non traitées.
Pour chaque animal de laboratoire, l’ablation a été vérifiée anatomiquement. Chez les animaux ablatés par GF, le GF non ablaté a été injecté par un colorant et imagé (voir ci-dessous). Si un seul axone GF était visible dans le conjonctif cervical (CvC), l’ablation de l’autre GF était supposée. L’ablation a également pu être vérifiée par l’absence d’un soma marqué à la GFP sur le côté ablaté du cerveau (Figure 2A, cercle). Pour évaluer l’ablation de TTMn, le signal GFP dans le VNC adulte a été analysé où le soma et la dendrite de TTMn peuvent être facilement identifiés. L’absence du TTMn d’un côté a été facilement reconnue en raison de l’absence de soma et de dendrites (Figure 2B, cercle).
Pour tester la fonction du GFS chez les mouches traitées, les potentiels synaptiques des muscles de saut 12,13, qui sont innervés par le TTMn, ont été enregistrés (Figure 3A). Les GF forment une synapse mixte électrique-chimique avec la dendrite médiane15 TTMn. La terminaison GF n’est pas ramifiée et présente une courbure latérale typique qui s’oppose à la dendrite TTMn dans la région synaptique (Figure 3D, Figure 4A). Chez les mouches témoins, chaque GF innerve exclusivement son motoneurone ipsilatéral. Dans les enregistrements des fibres TTM, la force de la connexion a été évaluée en analysant la latence de réponse à la stimulation de 1 Hz et la fréquence de suivi à la stimulation de 100 Hz (Figure 3B,C). Les mouches témoins ont montré une latence de réponse moyenne inférieure à 1 ms et ont pu suivre une stimulation de 100 Hz pour 78,1 % des stimuli (figure 3B). Après la réalisation d’enregistrements physiologiques, l’échantillon a été disséqué pour révéler le SNC et les GF, qui ont été injectés avec un mélange de TRITC-Dextran et de Neurobiotine. La grande molécule de dextran marque l’axone GF et la terminale mais ne passe pas par les jonctions lacunaires. La neurobiotine peut traverser les jonctions lacunaires entre GF et TTMn, et le signal de la neurobiotine a été détecté dans la dendrite postsynaptique (Figure 3E, F, pointes de flèches). Ce couplage de colorants de neurobiotine a confirmé le couplage électrique entre les deux neurones. La neurobiotine peut également être détectée dans de nombreux autres neurones du VNC qui sont connectés par des jonctions lacunaires au GF16 (Figure 3E,F).
Les mêmes tests physiologiques et anatomiques ont été effectués après l’ablation d’un GF en L3. L’axone de la plupart (13/15) des GF restants chez les mouches d’ablation présente une scission de la terminaison en deux branches : l’une à l’emplacement ipsilatéral habituel et l’autre traversant la ligne médiane jusqu’à une position homologue controlatérale au GF intact (Figure 3G, flèche). Chaque branche a été couplée à l’une des dendrites TTMn (Figure 3H,I, pointes de flèches). Les enregistrements physiologiques des TTM ont confirmé cette connexion synaptique d’un GF aux deux TTMns, bien que plus faible que la normale. Les latences de réponse TTM étaient supérieures à 1 ms pour les deux côtés, et les fréquences suivantes à 100 Hz étaient de 37,1 % pour le TTMn ipsilatéral au GF intact et de 28 % pour le TTM controlatéral (Figure 3C).
Étant donné que l’ablation d’un GF a provoqué l’innerve des deux neurones cibles restants, l’expérience suivante visait à observer la réponse des GF voisins lorsque l’un d’eux n’avait pas de motoneurone cible ipsilatéral normal. Pour cette expérience, l’un des neurones postsynaptiques a été supprimé, et l’anatomie et la fonction des TTMn restants ainsi que la morphologie des terminaisons GF ont été évaluées. Lorsque l’on visualise à la fois les TTMn et les GF chez les animaux témoins adultes, la région de contact synaptique présumé était clairement visible (figure 4A, pointes de flèches). Chaque dendrite médiale TTMn a été apposée à la terminaison présynaptique GF ipsilatérale. De petites projections de dendrites TTMn des deux côtés étaient en contact avec la ligne médiane (Figure 4C ; en médaillon). Le couplage du colorant avec la neurobiotine était visiblement dans les deux TTMn (figure 4D, pointes de flèches).
Lorsqu’un TTMn a été ablaté, la morphologie de la dendrite médiale restante a été modifiée. La dendrite médiale de ces spécimens s’étendait sur une branche longue et épaisse sur la ligne médiane (figures 4I, K ; flèches jaunes). De plus, des projections plus minces vers les deux extrémités GF s’étendaient vers l’avant (Figure 4E, G ; pointes de flèches jaunes). Le GF, ipsilatéral au TTMn, a montré son anatomie habituelle avec une terminaison faisant saillie le long de la dendrite du TTMn.
La réponse du GF « orphelin » dépourvu d’un motoneurone cible était d’un intérêt primordial. Dans la plupart des cas (61,5 % des animaux), le GF orphelin présentait une terminaison fendue avec une terminale du côté ipsilatéral et l’autre terminale traversant la ligne médiane et se projetant vers la dendrite TTMn controlatérale (Figure 4J, flèches). Ces branches croisées du GF étaient toujours plus petites que celles observées dans l’expérience complémentaire lorsque le GF voisin était ablaté (Figure 3F). L’extrémité ipsilatérale est entrée en contact avec la branche TTMn qui s’étendait sur la ligne médiane (figure 4I, flèche jaune). Chez 23 % des spécimens, le GF orphelin a franchi la ligne médiane (figure 4F, flèche) et s’est projeté le long de l’une des branches antérieures du TTMn (figure 4E, pointes de flèches jaunes) et a été couplé par colorant au TTMn restant (figure 4H, pointe de flèche).
Deux autres phénotypes ont été observés chez les mouches d’ablation TTMn (Figure 4M). Chez une mouche sur 13, les deux GF ont fait la courbure normale et sont restés de leur côté respectif du système nerveux. Dans un autre cas, le GF orphelin présentait le phénotype sans fin, où le GF orphelin ne faisait pas de terminal et s’arrêtait avant la zone où il se plie habituellement. Pour les quatre phénotypes, les enregistrements TTM du côté du TTMn intact étaient comparables à la physiologie de type sauvage (WT) avec une latence de réponse inférieure à 1 ms et une fréquence de suivi à 100 Hz à 100 % ou proche de 100 %. La suppression d’une cible peut permettre aux deux GF de partager le TTMn cible restant. Dans la plupart des cas, les deux GF établiront une connexion avec le TTMn restant. Généralement, le GF orphelin présentera un terminal bilatéral. Dans les mouches de contrôle, les GF ne franchiront jamais la ligne médiane ; cependant, chez environ 85 % des mouches d’ablation TTMn, une GF a traversé la ligne médiane pour entrer en contact avec la TTMn controlatérale. L’innervation d’un TTMn par deux GF n’a pas influencé négativement la fonction synaptique.
Il convient de noter que l’absence du GF voisin a un effet plus important que l’absence du motoneurone cible. La terminale bilatérale formée en l’absence du GF controlatéral est beaucoup plus grande et plus manifestement fonctionnelle que les changements lorsque la cible est retirée.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67053/67053fig02.jpg"> Figure 2 : Exemples d’ablations réussies dans le SNC adulte. (A) Projection de l’intensité maximale d’un cerveau de mouche adulte après l’ablation larvaire GF. GFP (vert) est piloté par l’A307-GAL4. Le cercle indique la zone où le GF ablaté est manquant. La pointe de la flèche pointe vers le GF restant exprimant la GFP de l’autre côté du cerveau. Le GF a été rempli de TRITC-Dextran (rouge). L’axone est projeté vers l’arrière vers le VNC. Barre d’échelle : 20 μm. (B) Projection d’intensité maximale d’un VNC adulte où un TTMn a été ablaté en L3. Le TTMn restant (pointe de flèche) exprime la GFP sous le pilote shakB (mortel). La zone du TTMn manquant est indiquée par le cercle. Barre d’échelle : 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67053/67053fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67053/67053fig03.jpg"> Figure 3 : L’ablation larvaire d’une fibre géante (GF) provoque une ramification bilatérale de la terminaison présynaptique de la GF restante. (A) Schéma du dispositif expérimental pour tester la structure et la fonction du système de fibres géantes adultes (GFS). L’électrode d’enregistrement mesure la latence et la fréquence suivante des sorties du motoneurone tergotrochantéral (TTMn) au niveau des muscles tergotrochantéraux (TTM) lors de la stimulation du cerveau chez l’animal intact. Après la dissection du système nerveux, le colorant a été injecté dans les axones GF au niveau du conjonctif cervical (CvC). (B, C) Exemples de traces pour la latence de réponse TTM et la fréquence de suivi à 100 Hz (n représente le nombre de TTM enregistrés dans chaque situation avec la latence moyenne et la fréquence de suivi indiquées). (B) Les animaux témoins avec deux GF intacts présentent des latences TTM inférieures à 1 ms et des fréquences suivantes proches de 100 % à 100 Hz. (C) Le GF unique restant chez les animaux ablatés innerve les deux TTMn. Les latences pour les deux TTMn sont plus longues que chez les témoins, et après à 100 Hz, la fréquence est considérablement diminuée. (D-I) Projection d’intensité maximale des piles d’images confocales pour les GF remplis de colorant. TRITC-Dextran (D, G, F, I en rouge) et Neurobiotine (E, H, F, I en gris) ont été co-injectés. La neurobiotine peut traverser les jonctions lacunaires entre le GF et le TTMn, marquant les neurones postsynaptiques. Les pointillés indiquent la ligne médiane. (D) Anatomie GF typique des animaux témoins avec la courbure terminale. (E, F) La neurobiotine marque de nombreux neurones postsynaptiques couplés électriquement aux GF. Les dendrites TTMn marquées transsynaptiquement sont indiquées par des pointes de flèches. (G) Après l’ablation, le GF restant développe une terminale supplémentaire (flèche), qui traverse la ligne médiane pour innerver le TTMn controlatéral. (H,I) Les deux TTMn (pointes de flèches) sont couplés par colorant au même GF. Barres d’échelle : 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67053/67053fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67053/67053fig04v2.jpg"> Graphique 4. L’ablation larvaire d’un motoneurone tergotrochantéral (TTMn) provoque l’innervation du TTMn restant par les deux fibres géantes (GF). (A-L) Les projections d’intensité maximale des piles d’images confocales de TTMn marquées avec GFP (vert) sous le contrôle de shakB(lethal)-Gal4 et les GF étaient remplies de TRITC-Dextran (magenta) et de Neurobiotine (rouge). La ligne pointillée indique la ligne médiane du système nerveux. (A-D) Témoins des éprouvettes avec les deux TTMn intacts. Les GF font leur courbure terminale typique en s’éloignant de la ligne médiane pour entrer en contact avec le TTMn (A,B), et chaque GF entre en contact avec un TTMn. Les dendrites TTMn se rencontrent sur la ligne médiane (C). Chaque GF est un colorant couplé à son TTMn (D, pointes de flèches blanches). (E-H) Le TTMn gauche a été enlevé. La dendrite médiane du TTMn restant se projette sur la ligne médiane (G, flèche jaune). Le GF orphelin traverse la ligne médiane (flèche blanche) au niveau de la région synaptique et entre en contact avec la dendrite TTMn controlatérale (E,F). Les GF sont couplés à un colorant au TTMn restant (H, pointe de flèche). (I-L) Exemple d’un autre phénotype GF où le TTMn gauche a été ablaté. La dendrite médiane du TTMn restant se projette sur la ligne médiane (I et K, flèche jaune). Le GF orphelin gauche fait un terminal bilatéral ; une branche se projette controlatéralement, et l’autre reste ipsilatérale (J, flèches) pour se connecter au TTMn. Barres d’échelle : 20 μm. (M) Schéma des quatre phénotypes GF différents observés chez les animaux d’ablation TTMn. n indique le nombre d’animaux dans chaque classe. Les données sont les moyennes avec erreur standard pour la latence de réponse TTM et la fréquence de suivi (FF) à 100 Hz pour le côté du TTMn intact. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67053/67053fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Ce protocole démontre l’ablation cellulaire au laser de neurones individuels chez des larves de drosophile intactes. La méthode permet d’étudier l’effet de la réduction de la compétition entre les neurones du système nerveux en développement.

L’ablation cellulaire au laser chez des larves de drosophile intactes révèle une compétition synaptique

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