Name: Améliorer les résultats des étudiants grâce à une expérience de recherche de premier cycle basée sur un cours adaptable de clonage moléculaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Découvrez comment le format CURE améliore l'apprentissage du clonage moléculaire par Gibson Assembly chez les étudiants. Cette méthode pratique renforce leur compréhension et leur confiance en biotechnologie.

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<meta charset="utf8"></head><body>Mise en œuvre de Gibson Assembly pour améliorer l’enseignement et les compétences en biologie moléculaire

<ol><li>Black, M. W., Tuan, A., Jonasson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+yeast+actin+cDNA+leads+to+an+investigative+approach+for+the+molecular+biology+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Cloning yeast actin cDNA leads to an investigative approach for the molecular biology laboratory.</a> Biochem Mol Biol Educ. 36 (3), 217-224 (2008).</li>
<li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Bell, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUREs+in+biochemistry%E2%80%94where+we+are+and+where+we+should+go%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">CUREs in biochemistry—where we are and where we should go.</a> Biochem Mol Biol Educ. 45 (1), 7-12 (2017).</li>
<li>Auchincloss, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+course-based+undergraduate+research+experiences%3A+A+meeting+report%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">Assessment of course-based undergraduate research experiences: A meeting report.</a> CBE Life Sci Educ. 13 (1), 29-40 (2014).</li>
<li>Buchanan, A. J., Fisher, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+and+implementation+of+science+practices+in+Course-based+Undergraduate+Research+Experiences+%28CUREs%29%3A+A+systematic+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">Current status and implementation of science practices in Course-based Undergraduate Research Experiences (CUREs): A systematic literature review.</a> CBE Life Sci Educ. 21 (4), ar83 (2022).</li>
<li>Verity, N., Ulm, B., Pham, K., Evangelista, B., Borgon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstrating+core+molecular+biology+principles+using+GST-GFP+in+a+semester-long+laboratory+course%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Demonstrating core molecular biology principles using GST-GFP in a semester-long laboratory course.</a> Biochem Mol Biol Educ. 50 (1), 55-64 (2022).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUR%28E%29ating+a+new+approach+to+study+fungal+effectors+and+enhance+undergraduate+education+through+authentic+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">CUR(E)ating a new approach to study fungal effectors and enhance undergraduate education through authentic research.</a> Biochem Mol Biol Educ. 52 (1), 6-14 (2024).</li>
<li>Roecklein-Canfield, J. A., Lopilato, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tagging+and+purifying+proteins+to+teach+molecular+biology+and+advanced+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Tagging and purifying proteins to teach molecular biology and advanced biochemistry.</a> Biochem Mol Biol Educ. 32 (6), 373-377 (2004).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+glyphosate+oxidase+and+a+chemiluminescence+system+for+glyphosate+detection%3A+A+comprehensive+practical+laboratory+experiment+on+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of glyphosate oxidase and a chemiluminescence system for glyphosate detection: A comprehensive practical laboratory experiment on biotechnology.</a> Biochem Mol Biol Educ. 51 (3), 302-311 (2023).</li>
<li>Wang, J. T. H., Schembri, M. A., Ramakrishna, M., Sagulenko, E., Fuerst, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immersing+undergraduate+students+in+the+research+experience%3A+A+practical+laboratory+module+on+molecular+cloning+of+microbial+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Immersing undergraduate students in the research experience: A practical laboratory module on molecular cloning of microbial genes.</a> Biochem Mol Biol Educ. 40 (1), 37-45 (2012).</li>
<li>Dean, D. M., Wilder, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%E2%80%9CFrankenplasmid%E2%80%9D+lab%3A+An+investigative+exercise+for+teaching+recombinant+DNA+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">The “Frankenplasmid” lab: An investigative exercise for teaching recombinant DNA methods.</a> Biochem Mol Biol Educ. 39 (5), 376-383 (2011).</li>
<li>Bornhorst, J. A., Deibel, M. A., Mulnix, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+amplification+by+PCR+and+subcloning+into+a+GFP-fusion+plasmid+expression+vector+as+a+molecular+biology+laboratory+course%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Gene amplification by PCR and subcloning into a GFP-fusion plasmid expression vector as a molecular biology laboratory course.</a> Biochem Mol Biol Educ. 32 (3), 173-182 (2004).</li>
<li>Roberts, L. A., Shell, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+research+program-linked%2C+course-based+undergraduate+research+experience+that+allows+undergraduates+to+participate+in+current+research+on+mycobacterial+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A research program-linked, course-based undergraduate research experience that allows undergraduates to participate in current research on mycobacterial gene regulation.</a> Front Microbiol. 13, 1025250(2023).</li>
<li>Jose, P. A., Maharshi, A., Jha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actinobacteria+in+natural+products+research%3A+Progress+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Res%22%5BJournal%5D)">Actinobacteria in natural products research: Progress and prospects.</a> Microbiol Res. 246, 126708(2021).</li>
<li>Banskota, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLN-05220%2C+TLN-05223%2C+new+Echinosporamicin-type+antibiotics%2C+and+proposed+revision+of+the+structure+of+bravomicins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antibiot%22%5BJournal%5D)">TLN-05220, TLN-05223, new Echinosporamicin-type antibiotics, and proposed revision of the structure of bravomicins.</a> J Antibiot. 62 (10), 565-570 (2009).</li>
<li>Schorn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+basis+for+the+biosynthesis+of+the+pharmaceutically+important+class+of+epoxyketone+proteasome+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic basis for the biosynthesis of the pharmaceutically important class of epoxyketone proteasome inhibitors.</a> ACS Chem Biol. 9 (1), 301-309 (2014).</li>
<li>Smith, H. G., Beech, M. J., Lewandowski, J. R., Challis, G. L., Jenner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Docking+domain-mediated+subunit+interactions+in+natural+product+megasynth%28et%29ases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ind+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Docking domain-mediated subunit interactions in natural product megasynth(et)ases.</a> J Ind Microbiol Biotechnol. 48 (3-4), kuab018(2021).</li>
<li>Williams, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+code+kit%3A+An+open-source+cell-free+platform+for+biochemical+and+biotechnology+education%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The genetic code kit: An open-source cell-free platform for biochemical and biotechnology education.</a> Front Bioeng Biotechnol. 8, 941(2020).</li>
<li>Bloodhart, B., Balgopal, M. M., Casper, A. M. A., Sample McMeeking, L. B., Fischer, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outperforming+yet+undervalued%3A+Undergraduate+women+in+STEM%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Outperforming yet undervalued: Undergraduate women in STEM.</a> PLoS One. 15 (6), e0234685(2020).</li>
<li>Farrar, V. S., Aguayo, B. -Y. C., Caporale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gendered+performance+gaps+in+an+upper-division+biology+course%3A+Academic%2C+demographic%2C+environmental%2C+and+affective+factors%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">Gendered performance gaps in an upper-division biology course: Academic, demographic, environmental, and affective factors.</a> CBE Life Sci Educ. 22 (4), ar55(2023).</li>
<li>Camacho, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLAST%2B%3A+Architecture+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinf%22%5BJournal%5D)">BLAST+: Architecture and applications.</a> BMC Bioinf. 10 (1), 421(2009).</li>
<li>Optimization Tips for NEBuilder® HiFi DNA Assembly and NEB® Gibson Assembly. , New England BioLabs Inc. 
 <a target="_blank" href="https://www.neb.com/en-us/tools-and-resources/usage-guidelines/optimization-tips-for-nebuilder-hifi-dna-assembly-and-neb-gibson-assembly">https://www.neb.com/en-us/tools-and-resources/usage-guidelines/optimization-tips-for-nebuilder-hifi-dna-assembly-and-neb-gibson-assembly</a> (2024).</li>
<li>Instruction Manual: Gibson Assembly® Master Mix / Gibson Assembly® Cloning Kit. , New England BioLabs Inc. 
 <a target="_blank" href="https://www.neb.com/-/media/nebus/files/manuals/manuale2611.pdf?rev=9db62577a41b4cfda071e21864a6763e">https://www.neb.com/-/media/nebus/files/manuals/manuale2611.pdf?rev=9db62577a41b4cfda071e21864a6763e</a> (2021).</li>
</ol>

La formation des étudiants de premier cycle aux concepts fondamentaux de la biologie moléculaire et aux techniques de laboratoire est cruciale pour leur développement scientifique et professionnel, car ces méthodologies sont courantes dans divers contextes de recherche, y compris le milieu universitaire et l’industrie. En tant que tels, les étudiants en biologie (concentration en biologie moléculaire et cellulaire) et en biochimie à l’Université d’État polytechnique de Californie, San Luis Obispo (Cal Poly) sont tenus de suivre un cours de laboratoire de biologie moléculaire de division supérieure pour apprendre et appliquer ces sujets (CHEM/BIO 475). Un programme de base pour ce cours a déjà été élaboré dans lequel les étudiants effectuent un clonage à base de topoisomérase (TOPO) pour assembler un plasmide contenant de l’actine préparé à partir d’un modèle d’ADN complémentaire de levure (ADNc)1. Les étudiants conçoivent des expériences basées sur des questions qui imitent des hypothèses de recherche authentiques, augmentant ainsi leur familiarité avec les pratiques de laboratoire et l’apprentissage basé sur l’enquête. L’avancement continu dans le domaine de la biologie moléculaire exige que les programmes d’études correspondants s’adaptent pour préparer les étudiants dotés de compétences modernes à la main-d’œuvre. En particulier, l’utilisation de l’assemblage Gibson est devenue plus prédominante dans la communauté scientifique ; Bien que la méthode ait été établie à l’origine pour synthétiser des chromosomes artificiels2, plus de 5 000 publications au moment de la rédaction de ce rapport ont fait référence aux travaux originaux de Gibson et al. Gibson Assembly est unique par rapport aux méthodologies de clonage traditionnelles : il est hautement personnalisable et peut facilement ligaturer plusieurs fragments d’ADN linéaires sans avoir besoin de sites de restriction pour produire les jonctions. Ainsi, nous avons vu l’opportunité de réorganiser le programme CHEM/BIO 475 pour intégrer des techniques modernes de clonage moléculaire et améliorer le modèle de cours basé sur l’enquête.
Il a été établi que les expériences de recherche des étudiants contribuent à une meilleure compréhension conceptuelle, au développement des compétences et à la persévérance en sciences3, mais tous les étudiants de premier cycle n’ont pas la possibilité de participer directement à un laboratoire de recherche. Pour relever le défi de la capacité limitée des étudiants dans les laboratoires de recherche, des expériences de recherche de premier cycle basées sur des cours (CURE) ont été développées et utilisées pour accroître l’accessibilité des sciences grâce à des recherches authentiques en classe. Bien que la mise en œuvre des CURE varie, des pratiques communes qui abordent les cinq principes de la recherche scientifique ont été établies. Dans le cadre d’un CURE bien conçu, les élèves devront 1) utiliser des pratiques scientifiques, 2) collaborer à un projet de recherche, 3) tenter de faire de nouvelles découvertes, 4) contribuer à des travaux pertinents en dehors de la salle de classe et 5) réévaluer et réviser des hypothèses et des méthodes en cas d’échec expérimental4. À l’instar des expériences de recherche traditionnelles des étudiants en laboratoire, il a été démontré que les CURE renforcent la confiance des étudiants dans les sciences, les compétences scientifiques, l’appropriation du projet et la persévérance dans les sciences, la technologie, l’ingénierie et les mathématiques (STIM)5. Bien que des CURE impliquant le clonage moléculaire aient été signalés précédemment 6,7,8,9,10,11,12,13, nous n’en connaissons aucun qui souligne l’adaptabilité de Gibson Assembly pour créer une bibliothèque de plasmides de recherche authentiques.
Ici, nous rapportons une expansion du programme actuel basé sur l’enquête CHEM/BIO 475 à l’Université d’État polytechnique de Californie, San Luis Obispo, avec deux améliorations majeures : l’expérience pratique de l’utilisation de Gibson Assembly et la participation d’étudiants à un CURE, qui a fourni des constructions plasmidiques originales pour des projets de recherche financés par la National Science Foundation (NSF-1708919 et NSF-2300890). Au cours des trois mises en œuvre de ce programme, les étudiants ont contribué à deux projets de recherche distincts axés sur la biosynthèse de produits naturels de molécules bioactives produites par Actinomycetota. Les produits naturels contiennent souvent des pharmacophores ayant des activités antibiotiques, antifongiques et/ou anticancéreuses, ce qui confère à ces petites molécules une importance dans les efforts de découverte de médicaments et un potentiel de pertinence clinique14. Cette recherche nécessite la création de banques de plasmides pour permettre d’étudier à la fois la fonction et le potentiel d’ingénierie des enzymes biosynthétiques bactériennes. Dans le cadre de ce CURE, les étudiants ont conçu et réalisé des expériences d’assemblage de Gibson pour cloner les bibliothèques de plasmides uniques pertinentes à ces projets de recherche (Figure 1). De plus, le format et la conception du module se distinguent par le fait qu’il est facilement adaptable pour générer des plasmides d’intérêt pour d’autres projets de recherche.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67067/67067fig01v2.jpg"> 
Figure 1 : Vue d’ensemble du rôle de Gibson Assembly dans notre laboratoire de recherche. Actinomycetota produit des produits naturels à petites molécules avec des bioactivités cliniquement pertinentes en utilisant des groupes de gènes qui codent pour des enzymes biosynthétiques. Dans nos recherches, des plasmides contenant un gène biosynthétique sont assemblés via l’assemblage de Gibson pour des études en aval de la fonction de l’enzyme codée. Icônes scientifiques de Biorender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67067/67067fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Vue d’ensemble du laboratoire
Le laboratoire de biologie moléculaire est un cours de division supérieure requis pour les majors en biochimie et les majors en biologie avec une concentration en biologie moléculaire et cellulaire. Les autres étudiants qui remplissent les conditions préalables sont invités à suivre le cours en tant que cours facultatif de division supérieure. Le cours est co-répertorié entre le département de chimie et de biochimie et le département de biologie de Cal Poly. Les professeurs des deux départements se relaient pour dispenser le cours chaque trimestre (deux trimestres en biologie, un trimestre en chimie et en biochimie).
La classe se réunit dans le laboratoire deux fois par semaine pendant des périodes de 170 minutes et une fois par semaine pour un cours de 50 minutes. Les sections de laboratoire contiennent un maximum de 16 étudiants et 2 à 3 sections de laboratoire sont proposées chaque trimestre. Le cours dure 10 semaines et l’examen final est administré lors de la dernière réunion de la semaine 10. Le temps de cours est consacré à la discussion de la théorie derrière de nombreuses techniques expérimentales menées en laboratoire, ainsi que des sujets d’actualité en biologie moléculaire qui ne sont pas couverts en laboratoire. Le programme de base du laboratoire englobe le processus de clonage du gène de l’actine à partir de la levure1, qui prend environ 7 semaines (13 à 14 réunions de laboratoire). Les techniques comprennent le micropipetage, l’isolement de l’ARN de levure, l’amplification d’un gène de levure à l’aide de la transcription inverse et de la réaction en chaîne par polymérase (RT-PCR), le clonage TOPO, le criblage bleu-blanc, l’isolement des plasmides et la vérification de l’insert par digestion de restriction et PCR, l’analyse in silico des clones et l’analyse de séquences d’ADN. Le programme pour les 3 dernières semaines du cours est à la discrétion de l’instructeur, mais implique que les étudiants réalisent un « projet indépendant » avec des résultats indéfinis.
Présentation de l’expérience
L’un des objectifs de notre groupe de recherche est les voies de biosynthèse chez Actinomycetota. Lors de la conception du projet indépendant, nous avons envisagé de demander aux étudiants de créer des plasmides à l’aide de Gibson Assembly pour les utiliser dans nos projets de recherche sur la biosynthèse des produits naturels. Alors que les itérations du module de cours qui sont évaluées ici étaient spécifiques aux plasmides qui permettent la manipulation des voies de biosynthèse, le flux de travail de l’assemblage Gibson est énormément adaptable à d’autres projets de clonage moléculaire (Figure 2). Le flux de travail a été divisé en trois expériences différentes (A, B et C) qui ont été réalisées sur deux périodes de cours et six périodes de laboratoire (3 semaines au total) (voir le fichier supplémentaire 1 et le fichier supplémentaire 2). Les expériences ont été précédées de feuilles de travail pour aider les élèves à se préparer et à évaluer leur compréhension (Fichier supplémentaire 3, Fichier supplémentaire 4 et Fichier supplémentaire 5). Le flux de travail est présenté dans un format qui s’adapte aux besoins et aux intérêts de l’instructeur.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67067/67067fig02v2.jpg"> 
Figure 2 : flux de travail du module d’assemblage Gibson. Le jour 1 et le jour 4 sont des périodes de cours où les étudiants effectuent une analyse séquentielle in silico et une conception expérimentale. Les jours 2 et 3 et 5 à 8 sont des réunions de laboratoire au cours desquelles les étapes de clonage de nouveaux plasmides via Gibson Assembly sont effectuées, suivies d’un isolement et d’un dépistage. L’organigramme illustré est regroupé en fonction des trois expériences réalisées par les élèves (A, B et C). Des directives et des protocoles plus détaillés se trouvent dans les manuels de l’instructeur et de l’étudiant fournis dans le dossier supplémentaire 1 et le fichier supplémentaire 2, respectivement. Icônes scientifiques de Biorender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67067/67067fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Le module de projet indépendant Gibson Assembly a été testé pour la première fois au printemps 2019 dans CHEM/BIO 475. En 2020 et 2021, le cours a été dispensé en ligne en raison de la pandémie de SARS-CoV-2. Lorsque l’enseignement en personne a repris au printemps 2022 et 2023, les étudiants du cours ont été invités à participer à une étude évaluant les résultats d’apprentissage d’un projet indépendant de Gibson Assembly où des plasmides originaux et pertinents pour la recherche seraient clonés. En 2019, les étudiants ont créé une bibliothèque de plasmides composée de cassettes de gènes du génome de Micromonospora echinospora ATCC 15837 qui ont été clonées dans pKC1132 (Figure 3). Cette bibliothèque de plasmides est utilisée dans notre laboratoire de recherche pour inactiver les gènes d’intérêt dans un groupe de gènes biosynthétiques présumés pour le produit naturel TLN-0522015. Pour compléter nos études d’inactivation génique, les étudiants ont cloné en 2022 une petite bibliothèque de gènes du groupe de gènes présumé TLN-05220 dans pUC19 (Figure3) ; Notre groupe de recherche a utilisé ces plasmides pour subcloner des gènes dans des vecteurs d’expression, y compris pET28b, pour la surexpression et la purification des protéines. Les étudiants de la cohorte 2023 ont contribué aux travaux en cours sur un projet d’ingénierie biosynthétique sur l’époxomicine synthétase16. En équipes de 3 à 4, les étudiants ont cloné des domaines modifiés de modules de peptide synthétase17 non ribosomique dans divers vecteurs d’expression protéique afin d’optimiser la surexpression et la purification de ces enzymes dans notre laboratoire de recherche (Figure 3). La redondance a été intégrée dans le plan de clonage pour chaque cohorte. Par exemple, la cohorte de 2019 contenait 44 étudiants, et 15 plasmides ont été attribués à la classe, pour le clonage. Ainsi, le clonage de chaque plasmide a été tenté deux ou trois fois.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67067/67067fig03v2.jpg"> 
Figure 3 : Résumé des plasmides clonés et des participants étudiants au cours des itérations indépendantes du projet en 2019, 2022 et 2023. Le projet Gibson Assembly a été déployé trois fois. Dans chaque offrande, les étudiants participants ont cloné une bibliothèque différente de plasmides à utiliser dans des projets de recherche explorant les voies de biosynthèse. Les projets de 2019 et 2022 ont soutenu nos travaux en cours sur le produit naturel TLN-0522015 avec deux réactions d’assemblage Gibson fragment (une cassette de gènes ou un gène et un vecteur). Le projet de 2023 a impliqué l’échange de domaines au sein des modules 1 et 2 d’une enzyme peptide synthétase non ribosomique (NRPS) impliquée dans la biosynthèse de l’époxomicine16. Les fragments hachurés représentent deux mutants différents du domaine échangé, et les couleurs unies représentent des domaines qui n’ont pas été échangés. Au total, huit fragments de gènes différents (quatre pour le module 1 et quatre pour le module 2) ont été générés avec des porte-à-faux compatibles avec l’assemblage Gibson. Pour chaque module, deux combinaisons différentes de trois fragments de gènes ont été assemblées avec l’un des deux vecteurs différents (pBAD33 et pET28, quatre fragments au total par assemblage), afin de générer huit plasmides NRPS modifiés. Icônes scientifiques de Biorender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67067/67067fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Aperçu de l’évaluation
Au moins 1 semaine avant le début du projet indépendant Gibson Assembly, les étudiants des cohortes 2022 et 2023 ont été invités à participer à une enquête sur les résultats d’apprentissage, conçue de la même manière qu’une étude réalisée dans le cadre d’un cours d’enquête sur le laboratoire de biochimie à Cal Poly18. Les étudiants participants ont rempli un pré-questionnaire à choix multiples lors de la réunion de laboratoire avant le début du projet indépendant et un post-questionnaire à choix multiples lors de la réunion finale du laboratoire (c’est-à-dire après avoir terminé le module d’assemblage Gibson). Le pré-questionnaire et le post-questionnaire comprenaient 28 questions identiques, avec deux questions supplémentaires dans le post-questionnaire (30 au total). Dix questions de contenu ont été rédigées pour évaluer les connaissances des élèves sur les enzymes et les mécanismes impliqués dans le clonage moléculaire (p. ex., réaction en chaîne par polymérase [PCR], assemblage de Gibson, transformation, criblage bleu-blanc). Les sept questions suivantes demandaient aux élèves d’auto-évaluer leur familiarité avec les termes du clonage moléculaire (p. ex., ADN polymérase, exonucléase, ligase). Les 10 questions suivantes ont permis aux étudiants d’auto-évaluer leur capacité à effectuer des techniques de clonage moléculaire (par exemple, analyse de séquences d’ADN, réactions de digestion par restriction, électrophorèse sur gel d’agarose). Les étudiants ont également indiqué s’ils seraient à l’aise de poursuivre une carrière en biologie moléculaire en fonction de leurs connaissances des techniques de clonage moléculaire. Deux questions supplémentaires ont été incluses dans le post-questionnaire pour permettre aux étudiants d’auto-évaluer leur engagement à apprendre dans le cours et de déterminer si le cours a été une expérience d’apprentissage précieuse (Fichier supplémentaire 6 et Fichier supplémentaire 7). Toutes les données des réponses des élèves avant et après le questionnaire de 2022 et de 2023 ont été combinées aux fins d’analyse et sont disponibles dans le tableau supplémentaire S1.

<table><tbody><tr><td>Déoxyribonucléotide triphosphate (dNTPs, 10&nbsp ; mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FERR0191</td><td>Composant MasterMix fait maison</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FERR0861</td><td>Composant MasterMix</td></tr><tr><td>fait maison DpnI&nbsp ;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td>1000 unités</td></tr><tr><td>Fisherbrand Isotemp Incubateur microbiologique</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-103-0513</td><td></td></tr><tr><td>FisherBrand Isotemp Bain d’eau</td><td>Fisher Scientific</td><td>S28124</td><td></td></tr><tr><td>GelRed Nucleic Acid Gel Stain</td><td>Biotium</td><td>NC9594719</td><td>10,000X</td></tr><tr><td>GeneJET Gel Extraction et nettoyage de l’ADN Micro Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>FERK0831</td><td>100</td></tr><tr><td>préparations GeneRuler 1 kb Échelle d’ADN</td><td>Fisher Scientific</td><td>FERSM0314</td><td>100 applications</td></tr><tr><td>LB Broth, Miller</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP9723-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium hexahydraté</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td>Composant MasterMix fait maison Mastercycler</td></tr><tr><td>nexus X2 Thermocycler Gradient</td><td>Eppendorf</td><td>6337000027</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 16 Centrifugeuse</td><td>Beckman Coulter</td><td>A46474</td><td></td></tr><tr><td>Micromonospora echinospora bactérie</td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC 15837</td><td></td></tr><tr><td>Four à micro-ondes</td><td>General Electric&nbsp ;</td><td></td><td></td>2440640</tr><tr><td>Biologie moléculaire Qualité Agarose</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP160-100</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Nanodrop Spectrophotomètre à un microvolume</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-400-518</td><td></td></tr><tr><td>NEB 5-alpha Competent E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2987H</td><td>20 x 0,05 mL</td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>E2621S</td><td>10 réactions</td></tr><tr><td>New Brunswick Innova 40 Agitateur orbital de paillasse</td><td>Nouveau-Brunswick</td><td>M1299-0090</td><td></td></tr><tr><td>Réactifs biologiques de pêche</td><td>à l’eau sans nucléases</td><td>BP248450</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>PEG-8000² ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP233-100</td><td>Composant MasterMix fait maison</td></tr><tr><td>Phusion ADN polymérase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530</td><td>Composant MasterMix fait maison</td></tr><tr><td>Portable Balance</td><td>Ohaus</td><td>SKX123</td><td></td></tr><tr><td>pUC19 vecteur</td><td>New England Biolabs</td><td>N3041S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 High-Fidelity 2x Master Mix&nbsp ;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0492S</td><td>100 réactions</td></tr><tr><td>T5 Exonucléase</td><td>Epicentre</td><td>T5E4111K</td><td>Fait maison' Composant MasterMix Taq</td></tr><tr><td>DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0208</td><td>Fait maison' Composant MasterMix</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1137918</td><td>Fait maison' Composant MasterMix</td></tr><tr><td>TriTrack DNA Gel Colorant de chargement (6x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>FERR1161</td><td>5 x 1 mL</td></tr><tr><td>Zyppy Plasmid Miniprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4019</td><td>100 Preps</td></tr><tr><td>&beta ;-Nicotinamide adénine dinucléotide (NAD+)</td><td>New England Biolabs</td><td>B9007S</td><td>Homemade' MasterMix component</td></tr></tbody></table>

améliorer les résultats des étudiants grâce à une expérience de recherche de premier cycle basée sur un cours adaptable de clonage moléculaire

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