CIRCLE-Seq pour l’interrogation de l’édition de gènes hors cible

Notre équipe se consacre au développement de thérapies à base de cellules souches pluripotentes induites, iPSC, pour des maladies cutanées sévères et actuellement incurables, telles que l’épidermolyse bulleuse dystrophique récessive. Notre objectif est de déterminer si l’édition précise de gènes associée à la différenciation des iPSC en cellules cutanées peut fournir une option de traitement viable pour ces conditions. L’édition génomique dans les cellules somatiques et les iPSC à l’aide de la technologie CRISPR-Cas9 transforme la médecine régénérative en permettant des thérapies personnalisées pour diverses maladies, y compris les troubles génétiques de la peau.

Les défis actuels du génie génétique comprennent les effets hors cible des éditeurs de gènes. La thérapeutique nécessite des éditeurs de gènes qui corrigent précisément le gène d’intérêt sans modifier d’autres emplacements dans le génome. Notre défi est de démontrer que les éditeurs de gènes n’introduisent pas de modifications involontaires au-delà du gène cible.

Le protocole CIRCLE-seq permet d’identifier des sites potentiels hors cible de bonne foi que d’autres techniques similaires pourraient manquer. Une analyse complète de ces sites hors cible fournit des informations précieuses sur l’activité des éditeurs de génome, améliorant ainsi la sécurité des thérapies géniques, y compris notre thérapie basée sur l’IPSC pour les maladies de la peau. Après avoir cultivé des cellules souches pluripotentes induites pendant cinq jours, collectez les cellules par centrifugation et mettez-les en suspension dans 10 millilitres de PBS.

Mélangez six microlitres de suspension cellulaire dans six microlitres de bleu trypan pour le comptage cellulaire. Après comptage, aliquote deux fois 10 à la puissance sept cellules par tube. Centrifugez les cellules à 300 G pendant trois minutes à 25 degrés Celsius et jetez le surnageant.

Préparez l’ultrasoniseur focalisé en orientant le bras de suspension. Remplissez le réservoir d’eau purifiée et déminéralisée. Sur l’ordinateur portable du poste de contrôle, accédez au réseau d’aqueduc et cliquez sur remplir pour commencer à remplir le système.

Réglez la température à 4,5 degrés Celsius. Transférez 25 microgrammes d’ADN génomique isolé à partir de cellules souches pluripotentes induites dans un microtube. Remplissez le tube jusqu’à un volume total de 130 microlitres avec le tampon TE.

Réglez les conditions pour cisailler l’ADN à une longueur moyenne de 300 paires de bases, une durée de 10 secondes, une puissance de crête de 70, un pourcentage de facteur de service à 20 et des cycles en rafale à 50. Divisez l’ADN génomique cisaillé en deux portions de 65 microlitres chacune. Purifiez les échantillons en utilisant 1,8 fois le volume des billes XP, suivi d’une séparation magnétique en rack.

Transférez le surnageant sur une nouvelle plaque de PCR et mesurez la quantité d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre. Enfin, exécutez un microlitre de l’ADN génomique de cisaillement auquel il est fait allusion sur une station de bande. Pour commencer, mettez oSQT1288 et l’adaptateur en épingle à cheveux en suspension à une concentration finale de 100 micromolaires dans le tampon TE.

Pour le recuit de l’adaptateur, mélangez 40 microlitres d’oSQT1288, 10 microlitres de 10X STE et 50 microlitres d’eau sans nucléase pour atteindre un volume total de 100 microlitres. Après le recuit de l’adaptateur, mélangez 10 microlitres de tampon de ligature 5X, cinq microlitres d’ADN ligase et cinq microlitres d’adaptateur d’épingle à cheveux recuit, pipetez 20 microlitres du mélange principal de ligature de l’adaptateur dans chaque échantillon d’ADN élué contenant des billes. Placez les échantillons dans un thermocycleur à 20 degrés Celsius pendant une heure, puis maintenez-les à quatre degrés Celsius indéfiniment.

Ensuite, transférez 50 microlitres de solution de pulvérisation PEG/NaCl dans l’ADN ligaturé par l’adaptateur. Purifiez les échantillons à l’aide de billes XP et d’une séparation magnétique en rack. Éluez les échantillons avec 30 microlitres de tampon TE pH huit et décantez les surnageants dans une nouvelle plaque PCR semi-jupe.

Combinez les échantillons et quantifiez l’ADN à l’aide du test dsDNA BR. Pour préparer le mélange maître de circularisation, combinez huit microlitres d’eau sans nucléase, 10 microlitres de tampon d’ADN ligase 10X TD4 et deux microlitres d’ADN ligase T4 pour un volume total de 20 microlitres. Pipette de 20 microlitres du master mix de circularisation à 80 microlitres de 500 nanogrammes d’ADN traité avec PNK utilisateur.

Incuber l’échantillon dans un thermocycleur à 16 degrés Celsius pendant 16 heures. Le lendemain, ajoutez 100 microlitres de billes d’XP à l’ADN circularisé et purifiez les échantillons, comme démontré précédemment. Éluez l’échantillon avec 38 microlitres de tampon TE et décantez le surnageant dans une nouvelle plaque PCR semi-jupe.

Pour cliver l’ADN génomique circularisé purifié, préparez un mélange maître de clivage in vitro en combinant cinq microlitres de tampon 10X Cas9, 4,5 microlitres de Streptococcus pyogenes Cas9 et 1,5 microlitre d’ARN génomique pour un volume total de 11 microlitres. Incuber le mélange maître de clivage à température ambiante pendant 10 minutes. pour former les complexes RNP de l’ARNg Cas9.

Diluez 125 nanogrammes d’ADN génomique traité par DNase sans danger pour les plasmides jusqu’à un volume final de 39 microlitres dans de l’eau sans nucléase. Ensuite, ajoutez 11 microlitres du mélange maître de clivage aux 39 microlitres d’ADN pour un volume total de 50 microlitres. Incuber le mélange dans un thermocycleur pendant une heure à 37 degrés Celsius et le maintenir indéfiniment à quatre degrés Celsius.

Après l’incubation, ajoutez 50 microlitres de billes XP à l’ADN clivé in vitro et purifiez l’ADN sur un support magnétique. Éluer l’ADN purifié dans 42 microlitres de tampon TE. Pour l’analyse des données de séquençage de nouvelle génération, installez Python version 2.7, Burrows-Wheeler Aligner et SAMtools.

Téléchargez le génome de référence à partir du site Web indiqué. Définissez le fichier FASTA du génome de référence, le répertoire de sortie de l’analyse et les chemins d’accès aux commandes BWA et SAMtools. Spécifiez les séquences cibles et les chemins d’accès aux fichiers FASTQ démultiplexés pour les échantillons clivés par nucléase et les échantillons de contrôle.

Exécutez l’analyse de référence standard à l’aide de la commande suivante. Lors de l’exécution du pipeline complet, recherchez les résultats de sortie de chaque étape dans un dossier de sortie distinct désigné pour cette étape spécifique.