Name: Dosage des ligands de proximité pour localiser les protéines dans les sites de dommages à l’ADN (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-02T14:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Découvrez le dosage de ligands de proximité pour localiser les interactions protéiques aux sites de dommages à l'ADN dans les cellules U2OS. Cette méthode combine immunofluorescence et microscopie confocale.

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<meta charset="utf8"></head><body>Évaluation de l’interaction et de la localisation des protéines dans les dommages à l’ADN

<ol><li>Xiao, W., Samson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+evidence+for+endogenous+DNA+alkylation+damage+as+a+source+of+spontaneous+mutation+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo evidence for endogenous DNA alkylation damage as a source of spontaneous mutation in eukaryotic cells.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 90 (6), 2117-2121 (1993).</li>
<li>Lindahl, T., Barnes, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+endogenous+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Repair of endogenous DNA damage.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 65, 127-134 (2000).</li>
<li>DNA damage, aging, and cancer. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22N+Engl+J+Med%22">N Engl J Med</a>. Hoeijmakers Jan, H. J. 361 (15), 1475-1485 (2009).</li>
<li>Giglia-Mari, G., Zotter, A., Vermeulen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA damage response.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a000745(2011).</li>
<li>Ciccia, A., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+damage+response%3A+Making+it+safe+to+play+with+knives%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The DNA damage response: Making it safe to play with knives.</a> Mol Cell. 40 (2), 179-204 (2010).</li>
<li>Chatterjee, N., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+DNA+damage%2C+repair+and+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22EnvironMol+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis.</a> EnvironMol Mutagen. 58 (5), 235-263 (2017).</li>
<li>Mah, L. J., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GammaH2AX%3A+a+sensitive+molecular+marker+of+DNA+damage+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">GammaH2AX: a sensitive molecular marker of DNA damage and repair.</a> Leukemia. 24 (4), 679-686 (2010).</li>
<li>Paull, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+histone+H2AX+in+recruitment+of+repair+factors+to+nuclear+foci+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage.</a> Curr Biol. 10 (15), 886-895 (2000).</li>
<li>Nakamura, A. J., Rao, V. A., Pommier, Y., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complexity+of+phosphorylated+H2AX+foci+formation+and+DNA+repair+assembly+at+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle+%28Georgetown%2C+Tex%29%22%5BJournal%5D)">The complexity of phosphorylated H2AX foci formation and DNA repair assembly at DNA double-strand breaks.</a> Cell cycle (Georgetown, Tex). 9 (2), 389-397 (2010).</li>
<li>Karchugina, S., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+heterodimerization+of+protein+isoforms+using+an+in+situ+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of heterodimerization of protein isoforms using an in situ proximity ligation assay.</a> J Vis Exp. (140), (2018).</li>
<li>Tubbs, E., Rieusset, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+endoplasmic+reticulum+and+mitochondria+interactions+by+in+situ+proximity+ligation+assay+in+fixed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Study of endoplasmic reticulum and mitochondria interactions by in situ proximity ligation assay in fixed cells.</a> J Vis Exp. (118), (2016).</li>
<li>Nguyen, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nek4+regulates+entry+into+replicative+senescence+and+the+response+to+DNA+damage+in+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+CellBiol%22%5BJournal%5D)">Nek4 regulates entry into replicative senescence and the response to DNA damage in human fibroblasts.</a> Mol CellBiol. 32 (19), 3963-3977 (2012).</li>
<li>Basei, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+interaction+partners+for+Nek4.1+and+Nek4.2+isoforms%3A+from+the+DNA+damage+response+to+RNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Sci%22%5BJournal%5D)">New interaction partners for Nek4.1 and Nek4.2 isoforms: from the DNA damage response to RNA splicing.</a> Proteome Sci. 13 (1), 11(2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Animal+Cell+Culture+Guide%22">Animal Cell Culture Guide</a>. , https://www.atcc.org/resources/culture-guides/animal-cell-culture-guide (2024).</li>
<li>Soubeyrand, S., Pope, L., Haché, R. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+II%CE%B1-dependent+induction+of+a+persistent+DNA+damage+response+in+response+to+transient+etoposide+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22MolOncol%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase IIα-dependent induction of a persistent DNA damage response in response to transient etoposide exposure.</a> MolOncol. 4 (1), 38-51 (2010).</li>
<li>Wei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Etoposide-induced+DNA+damage+affects+multiple+cellular+pathways+in+addition+to+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Etoposide-induced DNA damage affects multiple cellular pathways in addition to DNA damage response.</a> Oncotarget. 9 (35), 24122-24139 (2018).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Melo-Hanchuk, T. D., Slepicka, P. F., Pelegrini, A. L., Menck, C. F. M., Kobarg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NEK5+interacts+with+topoisomerase+II%CE%B2+and+is+involved+in+the+DNA+damage+response+induced+by+etoposide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">NEK5 interacts with topoisomerase IIβ and is involved in the DNA damage response induced by etoposide.</a> J Cell Biochem. 120 (10), 16853-16866 (2019).</li>
<li>George, J., Mittal, S., Kadamberi, I. P., Pradeep, S., Chaluvally-Raghavan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+proximity+ligation+assay+%28PLA%29+for+detection+of+RNA-protein+complex+interactions+in+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optimized proximity ligation assay (PLA) for detection of RNA-protein complex interactions in cell lines.</a> STAR Protoc. 3 (2), 101340(2022).</li>
<li>Zhang, W., Xie, M., Shu, M. D., Steitz, J. A., DiMaio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proximity-dependent+assay+for+specific+RNA-protein+interactions+in+intact+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A proximity-dependent assay for specific RNA-protein interactions in intact cells.</a> RNA. 22 (11), 1785-1792 (2016).</li>
<li>Hegazy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+ligation+assay+for+detecting+protein-protein+interactions+and+protein+modifications+in+cells+and+tissues+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Proximity ligation assay for detecting protein-protein interactions and protein modifications in cells and tissues in situ.</a> Curr Protoc Cell Biol. 89 (1), e115(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Noir 384 puits Plaques</td><td></td><td></td><td>porteuses de cellules Perkin Elmer Donkey</td></tr><tr><td>Anti-Rabbit Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Duo link Donkey anti Mouse Minus</td><td>Sigma</td><td>DUO92004</td><td></td></tr><tr><td>Duolink diluant d’anticorps</td><td>Sigma</td><td>DUO82008</td><td></td></tr><tr><td>Duolink solution bloquante 1X</td><td>Sigma</td><td>DUO82007</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de détection Duolink Far red</td><td>Sigma</td><td>DUO92013</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Donkey anti chèvre plus</td><td>Sigma</td><td>DUO92003</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Donkey anti lapin plus</td><td>Sigma</td><td>DUO92002</td><td></td></tr><tr><td>Etoposide</td><td>Sigma</td><td>E1383</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre anti Nek4</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-5517</td><td>chèvre anti Nek4 a été utilisé à une dilution de 1:50</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo</td><td>H1399</td><td>0,6 & micro ; g/mL</td></tr><tr><td>Microscope Leica DMI Leica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Souris anti Ku70</td><td>Thermo</td><td>MA5-13110</td><td>souris anti Ku70 a été utilisé à une dilution de 1:100</td></tr><tr><td>Souris anti TOPII&beta ;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-365071</td><td>1:25</td></tr><tr><td>Lapin anti Nek5</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-84527</td><td>1:25</td></tr><tr><td>Lapin anti Y H2AX</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>9718S</td><td>dilution 1:100</td></tr><tr><td>U2OS lignée cellulaire</td><td>ATCC</td><td>HTB-96&nbsp ;</td><td></td></tr></tbody></table>

dosage des ligands de proximité pour localiser les protéines dans les sites de dommages à l’adn

Proximity Ligand Assay to Localize Proteins in DNA Damage Sites

Nous avons observé l’interaction Nek4-Ku70 en l’absence de traitement à l’étoposide. Cependant, cette interaction peut se produire à l’extérieur du noyau (Figure 1A). L’interaction Nek4-Ku70 augmente après une lésion de l’ADN et est concentrée dans le noyau (Figure 1A). Dans le cas de l’interaction Nek5-Topoisomerase II β (TOPIIβ), utilisée dans ce test comme contrôle positif basé sur les résultats de la littérature18, l’interaction est considérablement augmentée par le traitement à l’étoposide (Figure 1B).
Le traitement à l’étoposide favorise une augmentation de près de 40 % (une moyenne de 9 points/noyau dans les cellules traitées par véhicule contre 12 à 14 points/noyau dans les cellules traitées par l’étoposide). L’interaction de Nek4 et Ku70 n’est pas exclusive des conditions de dommages à l’ADN. En effet, Nguyen et al.12 ont montré que ces protéines peuvent interagir en l’absence de l’agression cellulaire et ne dépendent pas de l’ADN, ce qui signifie que l’interaction n’a pas toujours lieu sur les sites de dommages à l’ADN.
La coloration γ-H2AX est absente dans les conditions de contrôle mais augmente après 20 min de traitement à l’étoposide et se maintient jusqu’à 3 h de traitement (Figure 1C). Certains des points d’interaction sont proches de la coloration γ-H2AX (Figure 1C). Après 1 h de traitement, la plupart des points d’interaction Nek4-Ku70 sont concentrés dans les foyers de dommages à l’ADN (Figure 1C).
Le knockdown pour Nek4 est d’environ 70% (données non présentées), ce qui signifie que le signal ne sera pas complètement éliminé. Nous pensons que la différence dans le nombre de points/noyaux n’est pas équivalente à l’épuisement des protéines, car la protéine réminiscente sera dédiée à la réponse aux dommages de l’ADN et interagira ensuite avec Ku70. La moyenne de points/noyau trouvée dans les cellules knockdown de Nek4 traitées pendant 3 h avec de l’étoposide est de 10, ce qui signifie une réduction d’environ 30% par rapport aux cellules PLKO témoins dans le même état. Si l’on considère que l’étoposide augmente l’interaction Nek4-Ku dans 40% des cellules traitées par véhicule, et que nous avons 70% de knockdown de Nek4, les cellules knockdown présenteront environ 10 points/noyau. L’interaction de Nek4 et Ku70 n’est pas exclusive de la réponse aux dommages de l’ADN, et bien qu’elle soit augmentée après des dommages à l’ADN, le changement majeur réside dans la localisation de l’interaction.
Les résultats présentés ici présentent un outil important pour localiser l’interaction des protéines dans le contexte de la réponse aux dommages de l’ADN. Nek4 et Ku70 ont déjà été impliqués dans la DDR, et Nek4 semble être important pour le recrutement de Ku70/Ku80 sur les foyers de dommages à l’ADN12. Cependant, les caractéristiques spatiales et temporelles de cette interaction peuvent être explorées à l’aide du PLA en même temps que la coloration γ-H2AX.
D’autres techniques, telles que la co-immunoprécipitation et l’immunofluorescence, peuvent fournir des informations similaires, mais séparément. L’utilisation du marqueur γ-H2AX comme référence permet un suivi temporel et spatial de l’interaction.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67072/67072fig01v4.jpg"> Figure 1 : Interaction Nek4 - Ku70 dans des conditions de dommages à l’ADN. (A) Les cellules U2OS ont été incubées avec de l’étoposide (25 μM) pendant 20 min, 1 h et 3 h. Le DMSO (0,05 % pendant 3 h) a été utilisé comme véhicule. Après le traitement, les cellules ont été fixées avec du méthanol glacé, et le PLA a été réalisé en utilisant l’anti-Nek4 de chèvre et l’anti-Ku70 de souris comme anticorps primaires. Le noyau a été coloré avec Hoechst 33342 et est présenté en bleu ; Les points PLA sont présentés en rouge. Les cellules témoins étaient des cellules traitées à l’étoposide pendant 1 h et incubées uniquement avec un anticorps primaire (anti-Nek4 de chèvre) et les deux anticorps secondaires. La lutte biologique a consisté en des cellules knockdown Nek4 (shRNA Nek4) traitées pendant 3 h avec de l’étoposide. (B) Contrôle positif du test basé sur les résultats de la littérature : les cellules U2OS ont été incubées avec 25 μM d’étoposide pendant 1 h, et le PLA a été réalisé avec un anti-Nek5 de souris et un anti-TOPIIβ de lapin. Le graphique est représentatif d’une expérience et représente la moyenne plus la moyenne de l’erreur-type (MEB) de toutes les cellules comprises dans au moins 4 champs différents (au moins 35 cellules pour le contrôle et 50 cellules pour toutes les autres conditions). La signification a été obtenue à l’aide du test t et de * : p&lt;0,05, **p&lt;0,01 et *** p&lt;0,001 par rapport au véhicule DMSO. (C) Après le PLA, les cellules présentées en (A) ont été lavées avec du PBS et incubées avec de l’anticorps anti-γ-H2AX de lapin. Après 1 h d’incubation, l’anticorps secondaire contre le lapin a été utilisé pour la détection des foyers de dommages à l’ADN et est présenté en vert. Les régions contenant la co-coloration du PLA et du γ-H2AX sont zoomées. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67072/67072fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Figure supplémentaire 1 : Structure des dossiers. Les images de Nucleus et de PLA doivent être placées dans des dossiers différents, comme indiqué ici. Les noms de fichiers doivent commencer par un préfixe spécifique (par exemple, DAPI, PLA) et doivent avoir une image correspondante dans chaque dossier (par exemple, DAPI_control1.tif et PLA_control1.tif). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67072/Supplementary%20figure%201_RE.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire 2 : Fenêtre des paramètres de macro. Après avoir ouvert/exécuté la macro dans ImageJ/FIJI, l’utilisateur sera invité à choisir des dossiers de données et à entrer les paramètres. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67072/Supplementary%20figure%202_RE.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier de codage supplémentaire 1 : Fichier macro créé pour ImageJ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67072/pla_dots_per_nucleus_basei_et_al_2024.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Dosage des ligands de proximité pour localiser les protéines dans les sites de dommages à l’ADN

The DNA damage response is a genetic information safeguard that protects cells from perpetuating damaged DNA. The characterization of the proteins that ...

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Cette vidéo décrit le test de ligature de proximité pour étudier in situ les interactions protéine-protéine dans les cellules de nématodes. La proximité des protéines d’intérêt génère la matrice d’ADN circulaire à l’aide d’une sonde PLA attachée à un anticorps secondaire. La sonde est encore amplifiée à l’aide de la solution d’amplification, qui produit un long ADN simple brin suivi de l’hybridation de la sonde détecteur, permettant la localisation des interactions protéine-protéine dans les...

Essai de ligature de proximité pour étudier les interactions protéine-protéine in situ

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