Name: Comprendre le développement de voies compensatoires chez un parasite mutant du paludisme hébergeant un allèle hypomorphe de kinases ressemblant à des plantes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-22T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Découvrez l'édition génique CRISPR-Cas9 pour étudier les voies compensatoires chez les parasites du paludisme. Cette méthode révèle comment l'inhibition double des kinases pourrait prévenir la résistance aux médicaments.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Identification du recâblage des kinases chez le parasite du paludisme : une approche de génétique chimique

<table><tbody><tr><td>1x cocktail inhibiteur de phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>04906 845001</td><td></td></tr><tr><td>AflII</td><td>NEB</td><td>R0520S</td><td></td></tr><tr><td>Albumax II&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>11021-037</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-GST</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>G7781</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Souris HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4416</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rabbit HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6154</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R3136S</td><td></td></tr><tr><td>BtgZ1</td><td>NEB</td><td>R0703S</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Centrifugeuse ThermoFisher Centrifugeuse Scientific</td><td>Sorvall legend micro 17R</td><td></td></tr><tr><td>(pour la granulation de cellules bactériennes)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Sorvall ST 8R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse (pour la granulation/le traitement des parasites)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Sorvall ST 8R (rotor TX-400)</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>NEB</td><td>RO1765</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>E. coli BLR(DE3) pLysS cellules compétentes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69956</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DH5a Cellules compétentes</td><td>Takara Bio</td><td>9057</td><td></td></tr><tr><td>Cuvettes d’électroporation, espace de 0,2 cm</td><td>BioRad</td><td>1652086</td><td></td></tr><tr><td>Électroporateur</td><td>BioRad</td><td>GenePulser Xcell</td><td></td></tr><tr><td>femtoLUCENTTM PLUS HRP réactif chimiluminescent</td><td>G-Bioscience</td><td>7860-003</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15750078</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa Stain</td><td>Himedia</td><td>S011-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Glutathion Sepharose 4B</td><td>GE Healthcare</td><td>17075601</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, Acide libre</td><td>Merck</td><td>391338</td><td></td></tr><tr><td>Hypoxanthine</td><td>Merck</td><td>4010CBC</td><td></td></tr><tr><td>Kit de clonage HD en perfusion</td><td>Takara Bio</td><td>1711641A</td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Supermix</td><td>BioRad</td><td>1708880EDU</td><td></td></tr><tr><td>MBP, déphosphorylé</td><td>&nbsp ; Merck</td><td>13-110</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>NEB</td><td>R3189S</td><td></td></tr><tr><td>Nucleobond Xtra Maxi EF&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Takara Bio</td><td>740424</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel et nettoyage PCR Mini kit</td><td>Takara Bio</td><td>740609</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>p-nitrobenzyl mesylate (PNBM)</td><td>Abcam</td><td>Ab138910</td><td></td></tr><tr><td>Primestar Max DNA polymérase</td><td>Takara Bio</td><td>R045A</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail d’inhibiteurs de protéase</td><td>Roche</td><td></td><td></td>11836170001</tr><tr><td>Qiaprep Spin Miniprep Kit&nbsp ;</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QuikChange II XL Kit de mutagénèse dirigée Agilent</td><td></td><td>200521</td><td></td></tr><tr><td>Kit RNeasy Mini</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31800-105</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich S5761</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SpeI-HF</td><td>NEB</td><td>R3133S</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Kit de synthèse premier brin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080-051</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15224017</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps ester thiophosphate</td><td>Abcam</td><td>Ab92570</td><td></td></tr></tbody></table>

comprendre le développement de voies compensatoires chez un parasite mutant du paludisme hébergeant un allèle hypomorphe de kinases ressemblant à des plantes

Understanding the Development of Compensatory Pathways in a Mutant Malaria Parasite Harbouring Hypomorphic Allele of Plant-Like Kinases

La WT CDPK1 recombinante est exprimée sous la forme d’une protéine de fusion avec un marqueur N-terminal de glutathion S-transférase (GST) et purifiée par chromatographie d’affinité GST. La protéine CDPK1 purifiée a été détectée par transfert Western à l’aide d’anticorps anti-CDPK1 et anti-GST (figure 1). Le résidu gardien de la thréonine (T145) dans WT CDPK1 a été remplacé par Met et Ser en utilisant la mutagenèse dirigée pour générer des protéines recombinantes CDPK1T145M et CDPK1T145S mutantes, respectivement (Figure 2). Un test de kinase in vitro a été effectué pour évaluer l’activité kinase de toutes les protéines CDPK1 recombinantes. L’activité de la kinase a été testée à l’aide d’une approche de marquage d’épitopes semi-synthétiques34 en détectant le groupe ester thio-phosphate à l’aide d’un anticorps spécifique sous forme de Western blot (figure 3). L’impact de la substitution de gardien sur l’activité d’autophosphorylation de CDPK1 et la transphosphorylation de MBP utilisé comme substrat exogène de CDPK1 a été évalué en quantifiant l’intensité des bandes d’autophosphorylation et de transphosphorylation respectives. Le mutant CDPK1 avec le gardien de la méthionine a conservé une activité de transphosphorylation de ~ 53 %, tandis que la présence d’une sérine à la position du gardien a conduit à l’abrogation complète de la transphosphorylation du substrat (Figure 3). Les SNP conduisant à la substitution de gardien de Thr à Met (T145M) ont été modifiés dans le locus endogène cdpk1 par CRISPR-Cas9 à l’aide d’un système à deux plasmides (Figure 4 et Figure 5). Il n’a pas été possible de générer des parasites mutants avec substitution T145S, peut-être en raison de l’effet létal du gardien Ser sur l’activité de CDPK1. Les parasites mutants CDPK1T145M ont été sous-clonés à l’aide de la méthode de dilution limitante, et la substitution du gardien a été confirmée par séquençage de Sanger pour vérifier la génération du parasite mutant CDPK1T145M. Les niveaux de transcription de 11 kinases différentes, dont 7 membres de la famille CDPK et 4 autres kinases impliquées dans le développement schizogonique tardif du parasite, ont été testés par PCR en temps réel (Figure 6). Les niveaux d’expression de 11 kinases différentes ont été comparés entre les parasites mutants CDPK1T145M et les parasites de type sauvage (WT), normalisés en fonction des gènes de nettoyage. L’expression transcrite des membres de la famille CDPK a été modifiée chez le mutant CDPK1T145M par rapport au parasite WT (Figure 6). Les transcrits montrant une expression plus élevée chez le mutant CDPK1T145M peuvent compenser la fonction de CDPK1 chez le parasite mutant CDPK1T145M.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig01.jpg"> Figure 1 : Caractérisation du PfCDPK1 de type sauvage recombinant pleine longueur. La protéine WT CDPK1 pleine longueur fusionnée avec l’étiquette N-terminale de la glutathion S transférase (GST) a été purifiée par chromatographie d’affinité et séparée sur 10% de SDS-PAGE. CDPK1 a migré vers la masse moléculaire prédite de ~ 87 kDa, comme le montre le gel de polyacrylamide coloré Coomassie Brilliant Blue R-250. La protéine recombinante séparée sur le SDS-PAGE a été transférée sur une membrane PVDF et traitée pour l’analyse par transfert Western avec des anticorps anti-CDPK1 et anti-GST. Une bande correspondant à la CDPK1 recombinante pleine longueur sur SDS-PAGE a été détectée avec les deux anticorps, confirmant l’identité de la protéine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig02.jpg"> Figure 2 : Caractérisation des protéines mutantes recombinantes purifiées de CDPK1. (A) Alignement de la séquence d’acides aminés primaires de TgCDPK1 et PfCDPK1 (Plasmodb accession no. PF3D7_0217500). La thréonine en position 145 de PfCDPK1 correspond à la glycine 128, la position de gardien dans TgCDPK1 (surlignée en rouge). (B) Représentation caricaturiste du résidu de gardien Thr (surligné en rouge) codé par le codon triplet ACC (cercle noir) dans WT CDPK1. Substitution du résidu gardien par mutagenèse dirigée pour générer des protéines CDPK1 mutantes recombinantes avec Met (en jaune) en CDPKT145M et Ser (en bleu) en CDPKT145S. (C) Profil SDS-page des protéines recombinantes WT et mutantes de CDPK1. Les protéines mutantes recombinantes WT et gatekeeper ont été purifiées par chromatographie d’affinité GST et séparées sur SDS-PAGE. Toutes les protéines recombinantes sont conformes au poids moléculaire attendu de ~87 kDa. Échelle de poids moléculaire M. (D) Caractérisation de CDPK1 WT recombinant et de protéines mutantes par Western blot. Les protéines recombinantes WT et gatekeeper mutant de CDPK1 ont été séparées sur SDS-PAGE et transférées sur la membrane PVDF pour le Western blot. Des bandes correspondant aux protéines recombinantes WT et CDPK1 mutantes sur SDS-PAGE ont été détectées avec des anticorps anti-CDPK1 et anti-GST, confirmant l’identité de toutes les protéines recombinantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig03.jpg"> Figure 3 : La substitution de gardien dans CDPK1 entraîne une diminution de l’activité kinase des enzymes mutantes. (A) Représentation caricaturiste de l’approche de marquage d’épitopes semi-synthétiques pour la détection de l’activité kinase de la protéine CDPK1. Seule l’activité de transphosphorylation est représentée ici. La protéine CDPK1 thiophosphoryle un substrat exogène (S, carré vert solide) en présence d’ATPγS (triangle jaune solide), source de groupe thiophosphate terminal transférable). Le résidu thiophosphorylé est alkylé par traitement au mésylate de p-nitrobenzyle (PNBM), formant un ester de thiophosphate qui est ensuite détecté avec un anticorps qui reconnaît spécifiquement l’adduit de thiophosphate alkylé. (B) Un test d’activité kinase in vitro utilisant une approche de marquage d’épitopes semi-synthétiques a été utilisé pour tester l’effet de la substitution de gardien sur le potentiel d’autophosphorylation et de transphosphorylation des protéines mutantes CDPK1 recombinantes. Toutes les protéines recombinantes présentent une activité kinase dépendante du calcium. L’auto-phosphorylation de CDPK1 et la trans-phosphorylation de la protéine basique de la myéline (MBP), un substrat exogène, n’ont été observées qu’en présence de chlorure de calcium (Ca2+), tandis qu’aucune phosphorylation n’a été détectée en présence d’EGTA, un chélateur spécifique des ions Ca2+. Les mutants gardiens montrent une activité d’autophosphorylation réduite, tandis que la transphosphorylation de MBP a été complètement abrogée en CDPK1T145S. CDPK1T145M conserve un potentiel de transphosphorylation (~ 53 %) comme indiqué précédemment32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig04.jpg"> Figure 4 : Construction de plasmides pour l’introduction de SNP en position de gardien dans le locus cdpk1 à l’aide de CRISPR-Cas9. Une séquence guide de 20 nucléotides correspondant à 432 à 451 pb a été clonée dans le site de restriction BtgZI dans le plasmide pL6eGFP pour générer pL6CK1G. Un bras d’homologie (421 pb) incorporant les SNP souhaités (T145M ou T145S, codon correspondant en vert) ainsi que des mutations de bouclier (en rouge) a été cloné dans pL6CK1G au sein des sites d’enzymes de restriction AflII et SpeI pour générer respectivement pL6CK1GT145M et pL6CK1GT145M. Les mutations du bouclier empêchent la re-coupe du locus modifié après l’édition souhaitée. L’endonucléase Cas9 codée dans un second plasmide, pUF1 est dirigée vers le site cible dans le locus cdpk1 à l’aide de l’ARN guide exprimé à partir du plasmidepL6CK1G T145M/S. Cas9 introduit une rupture double brin dans le site cible vers le côté 5' de la séquence PAM. Le DSB est réparé à l’aide d’un bras d’homologie dans le plasmide pL6CK1GT145M/S. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig05.jpg"> Figure 5 : Représentation schématique de P. Transfection de falciparum avec des plasmides CRISPR pour l’introduction de la mutation gatekeeper (T145M) dans le locus cdpk1. i) Asynchrone P. La culture de Falciparum est traitée au sorbitol pour obtenir des parasites synchronisés au stade de l’anneau. ii) Les parasites synchronisés de l’étage annulaire sont prélevés dans une cuvette d’électroporation avec les plasmides pL6CK1GT145M/S et pUF1 remis en suspension dans une solution tampon. iii) Les parasites sont électroporés à 310 volts, 950 μF et une résistance infinie. iv) Après la transfection, les parasites sont transférés dans une fiole T25 contenant un milieu RPMI complet frais (cRPMI) et mis en culture pendant 48 h. Après 48 h, les parasites transfectés sont remplacés par le cRPMI complété par les médicaments WR99210 et DSM267 et expansé dans la fiole T75. v) Le 14e jour, les lames sont préparées et colorées à l’aide de la coloration Giemsa. vi) Par la suite, le frottis sanguin est visualisé au microscope optique pour évaluer la présence de globules rouges parasités. vii) Lors de la visualisation, les parasites sont autorisés à se développer en présence de médicaments. Par la suite, les parasites sont traités pour obtenir le modèle pour la PCR et le séquençage de l’ADN pour la vérification de la modification souhaitée du locus cible cdpk1. viii) Suite à la vérification, des parasites transgéniques clonaux sont obtenus par mise en place d’une dilution limite dans une plaque à 96 puits. ix) Les parasites transgéniques clonaux provenant de puits positifs sont transférés dans des flacons T25 et laissés se développer. x) Les parasites transgéniques clonaux sont validés par PCR et la présence des SNP souhaités à la position de gardien par séquençage de l’ADN et analyse du chromatogramme. Ce chiffre est modifié par rapport à32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig06.jpg"> Figure 6 : Représentation schématique des étapes utilisées pour l’analyse des transcrits de gènes cibles par PCR en temps réel (RT-PCR). La culture de P. falciparum avec des parasites à prédominance mature au stade de Schizont est obtenue par traitement au sorbitol dans le même cycle. ii) Les parasites sont délicatement superposés sur un gradient de 70/40 Percoll/sorbitol dans un tube conique de 15 mL pour l’enrichissement des parasites matures au stade de schizonte. iii) L’anneau de couleur noire à l’interphase de 40 % et 70 % de personnel/sorbitol est transféré dans un tube frais de 50 mL, traité et remis en suspension dans du cRPMI. Les parasites enrichis au stade de schizonte sont incubés avec des globules rouges frais préincubés à 37 °C pour l’invasion. iv) Les parasites sont cultivés pendant 4 h, puis traités avec 5 % de sorbitol pour obtenir des parasites hautement synchronisés au stade annulaire 0-4 h. v) Les parasites sont ensuite cultivés pour un traitement post-sorbitol supplémentaire de 44 heures afin d’obtenir des parasites hautement synchronisés au stade de schizonte de 44 à 48 heures. vi) Les parasites synchronisés sont traités avec de la saponine pour les libérer des globules rouges et stockés dans un réactif d’extraction d’ARN. L’ARN total est isolé de l’extraction de l’ARN des parasites remis en suspension. vii) L’ADNc est préparé à partir de l’ARN isolé. viii) Une expérience de PCR en temps réel est mise en place avec le modèle d’ADNc pour amplifier les gènes cibles à l’aide d’amorces spécifiques aux gènes. La plaque est exécutée sur un système de PCR en temps réel. ix) Les données d’expression du transcrit sont analysées à l’aide d’un logiciel d’analyse. Le graphique représente les niveaux d’expression différentiels de 11 kinases chez les parasites CDPK1 T145M par rapport au type sauvage (WT). Ce chiffre est modifié au lieu de32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Nom du gène</td>
			<td colspan="4">Séquence d’amorçage</td>
		</tr><tr><td>Pk1fpgex</td>
			<td colspan="4">ATGCGCGGATCCATGGGGTGTTCACAAAGTTCAAACG</td>
		</tr><tr><td>Pk1rpgex</td>
			<td colspan="4">ATGCGCGCGCGCGCGCTTATGAAGATTTATTATCAAATTTTGTGCATC</td>
		</tr><tr><td>Référence : CK1T145S</td>
			<td colspan="4">GTTTGATGTTTTTGAAGAAATATTTTTATTTAGTAAGCGAATTTTATGAAGGTGGGGAA</td>
		</tr><tr><td>Ck1T145S_antisense</td>
			<td colspan="4">TTCCCCACCTTCATAAAATTCGCTTACTAAAAAAATATTTCTTATCTTCAAACATCAAAC</td>
		</tr><tr><td>CK1T145M</td>
			<td colspan="4">GTTTGATGTTTTTGAAGAAATATTTTTATTTAGTAATGGAATTTTATGAAGGTGGGGAA</td>
		</tr><tr><td>Ck1T145M_antisense</td>
			<td colspan="4">TTCCCCACCTTCATAAAATTCCATTACTAAATAATTTCTTATCTTCAAACATCAAAC</td>
		</tr><tr><td>Ck1GUIDEFWD</td>
			<td colspan="4">TAAGTATATAATATTAACCGAATTTTATGAAGGTGGTTTTAGAGCTAGAA</td>
		</tr><tr><td>Ck1GUIDEREV</td>
			<td colspan="4">TTCTAGCTCTCTAAAACCACCTTCATAAAATTCGGTTAATATTATATACTTA</td>
		</tr><tr><td>CK1F1 </td>
			<td colspan="4">ATTTTCTTTTCTGAACGTGTAACATG</td>
		</tr><tr><td>ck1r3wt</td>
			<td colspan="4">TGCATCTCTTAATCTCTCCTCACTG</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Liste des amorces utilisées dans l’étude.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Nom du gène</td>
			<td colspan="2">Introduction à l’avant</td>
			<td colspan="2">Apprêt inversé</td>
		</tr><tr><td>CDPK1 (PF3D7_0217500)</td>
			<td colspan="2">GGAAGAATTAGCAAATTTATTTGGTTTGACATC</td>
			<td colspan="2">ATGTTAACGAATTCATCAAAGTCAATCATGT</td>
		</tr><tr><td>CDPK2 (PF3D7_0610600)</td>
			<td colspan="2">GGAACAGGAGAATTTACAACGAC</td>
			<td colspan="2">TGTATACATAATAACACCACTAGACCAG</td>
		</tr><tr><td>CDPK3 (PF3D7_0310100)</td>
			<td colspan="2">CACGAAATATTGAGCATGGTAAAGAAGG</td>
			<td colspan="2">CAGCGTCCATTGTAAG ACATCTTTTTATTAAATC</td>
		</tr><tr><td>CDPK4 (PF3D7_0717500)</td>
			<td colspan="2">ATACTTCTCTCAGGGTGCCC</td>
			<td colspan="2">CTTATCACTAATTTTTTT GAATTGTGGTAAATCG</td>
		</tr><tr><td>CDPK5 (PF3D7_1337800)</td>
			<td colspan="2">GGAGGTCGAAGATATGGATACGAATAG</td>
			<td colspan="2">TATCGGCTAACGTACTCTTTGTCG</td>
		</tr><tr><td>CDPK6 (PF3D7_1122800)</td>
			<td colspan="2">CCTCCCGTAGATAAGAATATATTATCTATCG</td>
			<td colspan="2">ATCTGCTTCAATAAATCCCAATACATTTGC</td>
		</tr><tr><td>CDPK7 (PF3D7_1123100)</td>
			<td colspan="2">AGTCCTAAAAAAGATATA TAAAGAACTAGGTAGTAG</td>
			<td colspan="2">TTTAAAAATAATCTTTCTCCCCACAACCC</td>
		</tr><tr><td>PKA (PF3D7_0934800)</td>
			<td colspan="2">AATCATCCATTTTGTGTAAATTTACATGG</td>
			<td colspan="2">CTTTTGTTTCTTCTTAAA AATGTAAAAAATTCTCC</td>
		</tr><tr><td>PKG (PF3D7_1436600)</td>
			<td colspan="2">AAAGGGAATGAAAGAAATAAAAAAGAAGGC</td>
			<td colspan="2">CATATCAATATCTTTTGAAAGCTTTTCCC</td>
		</tr><tr><td>PKB (PF3D7_1246900)</td>
			<td colspan="2">CACAATAGAAGAAATGATGTTCTTTTTTACG</td>
			<td colspan="2">GAGAGCGCAATTAGCCATATTG</td>
		</tr><tr><td>PI3K (PF3D7_0515300)</td>
			<td colspan="2">CCCCTTCAATTTGTTTGTGAAACAG</td>
			<td colspan="2">ATCACATTTGTTATACTT ATTATCATCACATTTGTT</td>
		</tr><tr><td>GAPDH (PF3D7_1462800)</td>
			<td colspan="2">GGAAGGAAAGATATCGAAGTAG</td>
			<td colspan="2">GGGTTACCTCACATGG</td>
		</tr><tr><td>ThrRS (PF3D7_1126000)</td>
			<td colspan="2">CTTGGGAACTGCAGAGTAGAATTT</td>
			<td colspan="2">TAAAAATCCTCCGAACAATTTTTCTAAACTAC</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 2 : Liste des gènes cibles (numéro d’identification PlasmoDB) ainsi que la séquence des amorces utilisées pour l’analyse PCR en temps réel.

Comprendre le développement de voies compensatoires chez un parasite mutant du paludisme hébergeant un allèle hypomorphe de kinases ressemblant à des plantes

One of the mechanisms for subverting the effect of drugs by&#160;the malaria parasite is through rewiring of its transcriptome. The effect is more ...

understanding-development-compensatory-pathways-mutant-malaria

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dans cette interview, Georges Dimopoulos se concentre sur les mécanismes physiologiques utilisés par les moustiques pour combattre les infections à Plasmodium falciparum et de virus de la dengue. Explication n'est donnée pour combien de gènes clés réfractaires, ces gènes conférant une résistance aux agents pathogènes vecteurs, sont identifiés dans le moustique et comment cette connaissance peut être utilisé pour générer des moustiques transgéniques qui sont incapables de porter le parasite du...

Bâtir un meilleur moustique: l&#39;identification des gènes de résistance Activation fièvre malaria et la dengue chez A. gambiae et A. aegypti

Croisements génétiques des parasites du paludisme chez les rongeurs sont effectuées en alimentant deux des parasites génétiquement distinctes pour les moustiques. Recombinant progéniture clonée à partir de sang de souris après avoir laissé les moustiques de mordre des souris infectées. Cette vidéo montre comment produire des croisements...

Protocole pour la production d&#39;un croisement génétique des parasites du paludisme des rongeurs

Ici, nous présentons une approche systématique de développement physiologiquement pertinente, sensible et...

In Vivo modélisation du génome humain morbide utilisant Danio rerio

Les microARN humains se déplacent des érythrocytes hôtes vers les parasites de Plasmodium falciparum. Ici, les techniques utilisées pour transfecter des microARN synthétiques dans les érythrocytes de l’hôte et isoler tous les ARN de P. falciparum sont décrites.  De plus, cet article détaille une méthode d’isolement des polysomes chez P. falciparum pour déterminer l’occupation ribosomique et le potentiel de traduction des transcrits du parasite.

Méthodes pour étudier le rôle de réglementation de petits ARN ribosomal et l&#39;occupation des<em&gt; Plasmodium falciparum</em

Au niveau subcellulaire, les événements de signalisation sont modulés dynamiquement par des signaux développementaux et environnementaux. Nous décrivons ici un protocole qui utilise le système d’expression transitoire du tabac pour surveiller l’interaction dynamique protéine-protéine et pour révéler l’organisation spatiale de la transduction du signal dans les cellules végétales.

Imagerie réorganisation spatiale d&#39;une voie de signalisation MAPK Utilisation du système d&#39;expression transitoire du tabac

En raison des similitudes frappantes entre le cycle de vie et la biologie des parasites du paludisme des rongeurs et les parasites du paludisme chez l'homme, les modèles de paludisme des rongeurs sont devenus indispensables à la recherche sur le paludisme. Ici, nous avons normalisé certaines des techniques les plus importantes utilisées dans l'analyse phénotypique des espèces de paludisme de rongeurs de type sauvage et transgénique.

Analyse phénotypique des stades du sang asexué et sexuel du parasite du paludisme des rongeurs et des stades des moustiques

Ce protocole décrit une stratégie opto-génétique pour moduler l'activité de la protéine kinase activée par mitogène (MAPK) pendant la différenciation cellulaire et le développement embryonnaire de Xenopus . Cette méthode permet l'activation réversible de la voie de signalisation MAPK dans la culture de cellules de mammifères et dans les organismes vivants multicellulaires, comme les embryons de Xenopus , avec une résolution spatiale et temporelle élevée.

Modulation réversible médiée par la lumière du pathogène protéinique Kinase activé par Mitogen pendant la différenciation cellulaire et<em&gt; Xenopus</em&gt; Développement embryonnaire

Les auteurs décrivent une méthode pour générer des MLG-base conditionnelles mutants knockdown de Plasmodium falciparum à l’aide de CRISPR/Cas9 génome édition.

CRISPR/Cas9 gène édition à faire conditionnel Mutants de Human Parasite du paludisme à P. falciparum

Dans cet article, nous avons présenté un ensemble de méthodes pratiques et réalisables pour caractériser les mutants liés à la maladie des kinases de la famille raf, qui comprennent l'analyse in vitro de kinase, l'analyse de co-activation de RAF, et l'analyse de luciferase fractionnée complémentaire.

Caractériser les mutants liés à la maladie des kinases familiales de la RAF en utilisant un ensemble de méthodes pratiques et réalisables

Un protocole utilisant des promastigotes majeurs de Leishmania est présenté ici pour déterminer la liaison, la cytotoxicité et la signalisation induites par les toxines formant des pores. Une preuve de concept avec la streptolysine O est fournie. D’autres toxines peuvent également être utilisées pour tirer parti des mutants génétiques disponibles chez L. major afin de définir de nouveaux mécanismes de résistance aux toxines.

Déchiffrer le mécanisme moléculaire et la fonction des toxines formant des pores à l’aide de Leishmania major

Découvrez l'édition génique CRISPR-Cas9 pour étudier les voies compensatoires chez les parasites du paludisme. Cette méthode révèle comment l'inhibition double des kinases pourrait prévenir la résistance aux médicaments.

Comprendre le développement de voies compensatoires chez un parasite mutant du paludisme hébergeant un allèle hypomorphe de kinases ressemblant à des plantes (Vidéo) | JoVE Journal

Comprendre le développement de voies compensatoires chez un parasite mutant du paludisme hébergeant un allèle hypomorphe de kinases ressemblant à des plantes

Explorer plus de vidéos