Name: Modèle in vitro intégrant la rigidité et l’écoulement du substrat pour étudier les réponses des cellules endothéliales (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Découvrez un modèle in vitro intégrant rigidité du substrat et écoulement pour étudier les réponses des cellules endothéliales. Cette méthode permet d'analyser la mécanotransduction vasculaire et les mécanismes de l'athérosclérose.

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Les auteurs expriment leur gratitude à Robert Egan pour son aide dans la fabrication de la chambre d’écoulement. Les auteurs remercient Lucas McCauley pour son aide pendant les expériences. De plus, ils tiennent à remercier les installations centrales de l’Institute for Chemical Imaging of Living Systems (CILS) de l’Université Northeastern pour avoir accordé l’accès aux microscopes confocaux. Les auteurs remercient les National Institutes of Health pour leur soutien financier (NIH 1R01EB027705 attribué à SB) et la National Science Foundation (NSF CAREER Awards : DMR 1847843 à SB et CMMI 1846962 à EE).

Étude de la rigidité tissulaire et des effets du stress de cisaillement sur les cellules endothéliales

<ol><li>Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Endothelial function and dysfunction.</a> Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).</li>
<li>Suowen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+dysfunction+in+atherosclerotic+cardiovascular+diseases+and+beyond%3A+From+mechanism+to+oharmacotherapies%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">Endothelial dysfunction in atherosclerotic cardiovascular diseases and beyond: From mechanism to oharmacotherapies.</a> Pharmacol Rev. 73 (3), 924(2021).</li>
<li>Jansen, K. A., Atherton, P., Ballestrem, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+at+the+cell-matrix+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Sem+Cel+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction at the cell-matrix interface.</a> Sem Cel Dev Biol. 71, 75-83 (2017).</li>
<li>Tarbell, J. M., Pahakis, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+and+the+glycocalyx%5BTitle%5D)+AND+%22J+Int+Med%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction and the glycocalyx.</a> J Int Med. 259 (4), 339-350 (2006).</li>
<li>Topper, J. N., Cai, J., Falb, D., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+vascular+endothelial+genes+differentially+responsive+to+fluid+mechanical+stimuli%3A+cyclooxygenase-2%2C+manganese+superoxide+dismutase%2C+and+endothelial+cell+nitric+oxide+synthase+are+selectively+up-regulated+by+steady+laminar+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Identification of vascular endothelial genes differentially responsive to fluid mechanical stimuli: cyclooxygenase-2, manganese superoxide dismutase, and endothelial cell nitric oxide synthase are selectively up-regulated by steady laminar shear stress.</a> Proc Natl Acad Sci. 93 (19), 10417-10422 (1996).</li>
<li>Mitchell, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+stiffness+and+cardiovascular+events%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Arterial stiffness and cardiovascular events.</a> Circulation. 121 (4), 505-511 (2010).</li>
<li>Bonetti, P. O., Lerman, L. O., Lerman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Endothelial dysfunction.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (2), 168-175 (2003).</li>
<li>Hamrangsekachaee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+glycocalyx+sensitivity+to+chemical+and+mechanical+sub-endothelial+substrate+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Endothelial glycocalyx sensitivity to chemical and mechanical sub-endothelial substrate properties.</a> Front Bioeng Biotechnol. 11, 1250348(2023).</li>
<li>Mensah, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-regulated+endothelial+glycocalyx+determines+metastatic+cancer+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Flow-regulated endothelial glycocalyx determines metastatic cancer cell activity.</a> FASEB J. 34 (5), 6166-6184 (2020).</li>
<li>Russell-Puleri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+shear+stress+induces+upregulation+of+COX-2+and+PGI2+release+in+endothelial+cells+via+a+pathway+involving+PECAM-1%2C+PI3K%2C+FAK%2C+and+p38%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol-Heart+Cir+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fluid shear stress induces upregulation of COX-2 and PGI2 release in endothelial cells via a pathway involving PECAM-1, PI3K, FAK, and p38.</a> Am J Physiol-Heart Cir Physiol. 312 (3), H485-H500 (2016).</li>
<li>Hamrangsekachaee, M., Wen, K., Bencherif, S. A., Ebong, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis+and+endothelial+mechanotransduction%3A+current+knowledge+and+models+for+future+research%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol-Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis and endothelial mechanotransduction: current knowledge and models for future research.</a> Am J Physiol-Cell Physiol. 324 (2), C488-C504 (2022).</li>
<li>Zhu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gelatin+methacryloyl+and+its+hydrogels+with+an+exceptional+degree+of+controllability+and+batch-to-batch+consistency%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Gelatin methacryloyl and its hydrogels with an exceptional degree of controllability and batch-to-batch consistency.</a> Sci Rep. 9 (1), 6863(2019).</li>
<li>Kim, J., Bencherif, S. A., Li, W. A., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-friendly+inverse+opal-like+hydrogels+for+a+spatially+separated+co-culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol+Rapid+Comm%22%5BJournal%5D)">Cell-friendly inverse opal-like hydrogels for a spatially separated co-culture system.</a> Macromol Rapid Comm. 35 (18), 1578-1586 (2014).</li>
<li>Orr, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subendothelial+extracellular+matrix+modulates+NF-kappaB+activation+by+flow%3A+a+potential+role+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The subendothelial extracellular matrix modulates NF-kappaB activation by flow: a potential role in atherosclerosis.</a> J Cell Biol. 169 (1), 191-202 (2005).</li>
<li>Hamrangsekachaee, M., Baumann, H. J., Pukale, D. D., Shriver, L. P., Leipzig, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+mechanisms+of+subcutaneous+preconditioning+incubation+for+neural+stem+cell+embedded+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Bio+Mater%22%5BJournal%5D)">Investigating mechanisms of subcutaneous preconditioning incubation for neural stem cell embedded hydrogels.</a> ACS Appl Bio Mater. 5 (5), 2176-2184 (2022).</li>
<li>Rezaeeyazdi, M., Colombani, T., Memic, A., Bencherif, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+hyaluronic+acid-co-gelatin+cryogels+for+tissue-engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Injectable hyaluronic acid-co-gelatin cryogels for tissue-engineering applications.</a> Materials. 11 (8), 1374(2018).</li>
<li>Belvitch, P., Htwe, Y. M., Brown, M. E., Dudek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+actin+dynamics+in+endothelial+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Membr%22%5BJournal%5D)">Cortical actin dynamics in endothelial permeability.</a> Curr Top Membr. 82, 141-195 (2018).</li>
<li>Krishnamoorthy, S., Noorani, B., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+encapsulated+cells+on+the+physical-mechanical+properties+and+microstructure+of+gelatin+methacrylate+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Effects of encapsulated cells on the physical-mechanical properties and microstructure of gelatin methacrylate hydrogels.</a> Int J Mol Sci. 20 (20), 5061(2019).</li>
<li>Jin, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinting+small-diameter+vascular+vessel+with+endothelium+and+smooth+muscle+by+the+approach+of+two-step+crosslinking+process%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Bioprinting small-diameter vascular vessel with endothelium and smooth muscle by the approach of two-step crosslinking process.</a> Biotechnol Bioeng. 119 (6), 1673-1684 (2022).</li>
<li>Villard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoclavable+and+injectable+cryogels+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthcare+Mater%22%5BJournal%5D)">Autoclavable and injectable cryogels for biomedical applications.</a> Adv Healthcare Mater. 8 (17), 1900679(2019).</li>
<li>Bencherif, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+cross-linker+chemistry+on+release+kinetics+of+PEG-co-PGA+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Influence of cross-linker chemistry on release kinetics of PEG-co-PGA hydrogels.</a> J Biomed Mater Res A. 90 (1), 142-153 (2009).</li>
<li>Rogers, Z. J., Zeevi, M. P., Koppes, R., Bencherif, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroconductive+hydrogels+for+tissue+engineering%3A+Current+status+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectricity%22%5BJournal%5D)">Electroconductive hydrogels for tissue engineering: Current status and future perspectives.</a> Bioelectricity. 2 (3), 279-292 (2020).</li>
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<li>Fioretta, E. S., Fledderus, J. O., Baaijens, F. P. T., Bouten, C. V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+substrate+stiffness+on+circulating+progenitor+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Influence of substrate stiffness on circulating progenitor cell fate.</a> J Biomech. 45 (5), 736-744 (2012).</li>
<li>Geemen, D. v, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F-Actin-anchored+focal+adhesions+distinguish+endothelial+phenotypes+of+human+arteries+and+veins%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">F-Actin-anchored focal adhesions distinguish endothelial phenotypes of human arteries and veins.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (9), 2059-2067 (2014).</li>
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<li>Estrada, R., Giridharan, G. A., Nguyen, M. D., Prabhu, S. D., Sethu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+endothelial+cell+culture+model+to+replicate+disturbed+flow+conditions+seen+in+atherosclerosis+susceptible+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Microfluidic endothelial cell culture model to replicate disturbed flow conditions seen in atherosclerosis susceptible regions.</a> Biomicrofluidics. 5 (3), 32006(2011).</li>
<li>Inglebert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+shear+stress+reduction+on+endothelial+cells%3A+A+microfluidic+study+of+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">The effect of shear stress reduction on endothelial cells: A microfluidic study of the actin cytoskeleton.</a> Biomicrofluidics. 14 (2), 024115(2020).</li>
<li>Noria, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+reorientation+of+stress+fibers+drives+morphological+changes+to+endothelial+cells+exposed+to+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Assembly and reorientation of stress fibers drives morphological changes to endothelial cells exposed to shear stress.</a> Am J Pathol. 164 (4), 1211-1223 (2004).</li>
<li>Amer, M., Shi, L., Wolfenson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27Yin+and+Yang%27+of+cancer+cell+growth+and+mechanosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">The 'Yin and Yang' of cancer cell growth and mechanosensing.</a> Cancers (Basel). 13 (19), 4754(2021).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’une demande de brevet provisoire (n° 63/634,853) a été déposée sous le titre Chambre d’écoulement avec un substrat mécaniquement accordable, et qu’il n’existe pas d’autres intérêts concurrents.

Le système vasculaire est un environnement dynamique où diverses forces influencent considérablement le comportement cellulaire. Il serait inexact d’étudier les événements biologiques dans les maladies cardiovasculaires sans tenir compte de ces forces. Ainsi, les modèles cellulaires capables d’émuler l’environnement mécanique vasculaire sont cruciaux. Les chercheurs ont déjà fait des progrès significatifs dans la mise en évidence de l’effet de ces forces sur le comportement cellulaire11. Cependant...

L’endothélium, qui tapisse la surface interne des vaisseaux sanguins, joue un rôle central dans le maintien de la santé vasculaire. Les cellules endothéliales (CE) sont essentielles à la régulation de diverses fonctions cardiovasculaires, notamment le contrôle du tonus des vaisseaux, la perméabilité sélective, l’hémostase et la mécanotransduction 1,2. La recherche a fermement lié le dysfonctionnement de la CE à un rôle primordial dans le développement de l’athérosclérose. Notamment, les CE rencontrent diverses forces mécaniques aux interfaces où elles interagissent avec le flux sanguin et les tissus vasculaires sous-jacents 3,4. Plusieurs études ont associé le dysfonctionnement de la CE à des changements anormaux dans les facteurs mécaniques de l’environnement vasculaire, tels que le stress de cisaillement des fluides dû au flux sanguin et la rigidité des tissus 5,6,7.
Cependant, les recherches antérieures ont reçu peu d’attention pour comprendre les effets combinés de la rigidité des tissus et du stress de cisaillement sur la fonction EC. Pour améliorer la capacité de traduire les résultats de la recherche en traitements efficaces pour l’athérosclérose et d’autres maladies cardiovasculaires, il est essentiel d’améliorer les modèles cellulaires utilisés dans le domaine. Des progrès significatifs ont été réalisés dans l’humanisation des modèles cellulaires en utilisant des CE humains et en les soumettant soit à des contraintes de cisaillement, soit à des substrats avec des niveaux de rigidité variables 8,9,10. Cependant, l’adoption et le perfectionnement de modèles cellulaires qui intègrent des environnements d’écoulement dynamiques avec des substrats EC possédant des propriétés de rigidité réglables ont progressé lentement. Le défi consiste à concevoir des substrats EC non gonflants pour empêcher les altérations des paramètres d’écoulement dans le canal d’écoulement tout en facilitant la culture de monocouches EC intactes et bien adhérentes. Un modèle in vitro capable de surmonter ces obstacles pourrait faciliter des investigations plus efficaces sur la façon dont l’hypertension, le vieillissement et les conditions de flux influencent en collaboration la mécanotransduction de la CE, la santé vasculaire et, en fin de compte, le développement de l’athérosclérose. Diverses méthodes ont été développées pour appliquer une contrainte de cisaillement sur les cellules tout en contrôlant la rigidité du substrat, y compris des plaques rotatives et des dispositifs microfluidiques. Dans la méthode des plaques rotatives, les cellules sont placées entre deux plaques et une contrainte de cisaillement est appliquée par le mouvement de rotation des plaques. Cette méthode est moins compliquée et fournit un modèle rapide ; Cependant, il souffre d’une variation spatiale des contraintes de cisaillement, avec une contrainte de cisaillement nulle au centre et une contrainte de cisaillement maximale à la périphérie11.
D’autre part, les dispositifs microfluidiques représentent la nouvelle génération d’outils capables de contrôler la rigidité du substrat et les conditions d’écoulement. Ces systèmes sont adaptés pour imiter les microvascularisations dans des conditions d’écoulement laminaire. Cependant, il n’est pas pratique d’étudier l’athérosclérose avec de tels appareils, car l’athérosclérose se produit dans de gros vaisseaux dont le flux est perturbé11. Cet article vise à contribuer au domaine de recherche critique des études EC en présentant un système rentable capable d’examiner les effets de différents niveaux de rigidité dans des substrats EC dans différentes conditions d’écoulement. Le système intègre des substrats de différentes rigidités pour émuler les vaisseaux sanguins pathologiques et physiologiques. Ce protocole décrit la méthode de création d’hydrogels à base de gélatine sans gonflement et avec des niveaux de rigidité de 5 kPa et 10 kPa, représentant respectivement une rigidité physiologique et pathologique. De plus, la construction d’une chambre d’écoulement à plaques parallèles capable d’intégrer ces substrats est détaillée. La dynamique des fluides numérique (CFD) a été utilisée pour évaluer les contraintes de cisaillement et les conditions d’écoulement. La préparation d’hydrogels pour la culture EC et l’exécution d’une expérience d’écoulement de 6 h sont décrites, suivies d’une discussion sur l’immunocoloration post-expérience.

<table><tbody><tr><td>(triméthoxysilyl)méthacrylate de propyle, tétraméthyléthylènediamine (TEMED)</td><td>Invitrogen</td><td>15524-010</td><td>Fabrication d’hydrogel</td></tr><tr><td>3-(triméthoxysilyl)Méthacrylate de propyle</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440159</td><td>Salinisation du verre</td></tr><tr><td>Milieu de montage contenant du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>Immunocoloration</td></tr><tr><td>Acétone</td><td>Thermo Fisher Scientifics</td><td>A18-4</td><td>GelMA Synthèse</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Phalloïdine&nbsp ;</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>8953S</td><td>Immunocoloration Persulfate d’ammonium</td></tr><tr><td>(APS)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610700</td><td>Fabrication d’hydrogel</td></tr><tr><td>Feuille acrylique coulée transparente résistante aux rayures et aux UV (45/64'')</td><td>McMaster-CARR</td><td>8560K165</td><td>Fabrication de chambre d’écoulement</td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Carl Zeiss Meditex AG</td><td>Zeiss LSM 800</td><td>Immunocoloration</td></tr><tr><td>Covidien Monoject Rigid Pack Seringues de 60 mL sans aiguilles</td><td>Fisher&nbsp ; &nbsp ;</td><td>22-031-375</td><td>Flow Experiment</td></tr><tr><td>Kit de croissance EC&nbsp ;</td><td>American Type Culture Collection (ATCC)</td><td>PCS-100-041</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Éthanol 200 Proof</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td>Salinisation du verre</td></tr><tr><td>Gélatine de type A (300 bloom) à partir de peau porcine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td>GelMA Synthesis</td></tr><tr><td>Acide acétique glacial</td><td>Thermo Fisher Scientifics</td><td>9526-33</td><td>Salinisation</td></tr><tr><td>du verre Silicone haute pureté haute température Feuille de caoutchouc</td><td>McMaster-Carr</td><td>87315K74</td> Fabrication de la <td>chambre d’écoulement</td></tr><tr><td>Cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC)</td><td>Collection de culture de type américain (ATCC)</td><td>PSC-100-010</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>M3x30mm Vis mécaniques à six pans hexagonaux Vis à tête ronde 304 Boulons de fixation en acier inoxydable 20pcs</td><td>Uxcell</td><td>B07Q5RM2TP</td><td>Fabrication</td></tr> <tr><td>de la chambre d’écoulementVariateur numérique Masterflex L/S avec Easy-Load&reg ; 3 tête de pompe pour tube de précision ; Expérience</td> d’écoulement <td>VWR</td><td>#MFLX77921-65</td> 115/230 <td>VAC²</td></tr><tr><td>Tube de pompe de précision Masterflex L/S, Puri-Flex, L/S 25 ; 25 ft</td><td>VWR</td><td>#MFLX96419-25</td><td>Flow Experiment&nbsp ;</td></tr><tr><td>Anhydride méthacrylique (MAH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276685</td><td>GelMA Synthesis</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Thermo Fisher Scientifics</td><td>043368.9M</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14080-055</td><td>Bicarbonate de</td></tr><tr><td>sodium</td> général <td>Fisher Chemical</td><td>S233-3</td><td>GelMA Synthesis</td></tr><tr><td>Carbonate de sodium</td><td>Fisher Chemical</td><td>S263-500</td><td>GelMA Synthesis</td></tr><tr><td>SOLIDWORKS version</td><td></td><td></td><td></td>éducative</tr><tr><td>SOLIDWORKS Student Edition Desktop, 2023</td><td>SolidWorks</td><td>N/A</td><td>Flow Chamber Design</td></tr><tr><td>Vasculaire Basal Medium</td><td>American Type Culture Collection (ATCC)</td><td>PCS-100-030</td><td>Culture cellulaire</td></tr></tbody></table>

modèle in vitro intégrant la rigidité et l’écoulement du substrat pour étudier les réponses des cellules endothéliales

In Vitro Model Integrating Substrate Stiffness and Flow to Study Endothelial Cell Responses

Nous présentons un modèle in vitro innovant visant à étudier les effets combinés de la rigidité tissulaire et du stress de cisaillement sur la fonction des cellules endothéliales (CE), qui sont cruciales pour comprendre la santé vasculaire et l’apparition de maladies telles que l’athérosclérose. Traditionnellement, les études ont exploré les impacts de la contrainte de cisaillement et de la rigidité du substrat sur les CE, indépendamment. Cependant, ce système intégré combine ces facteurs pour fournir une simulation plus précise de l’environnement mécanique du système vasculaire. L’objectif est d’examiner la mécanotransduction des EC à travers divers niveaux de rigidité tissulaire et conditions d’écoulement à l’aide de CE humaines. Nous détaillons le protocole de synthèse d’hydrogels de méthacrylate de gélatine (GelMA) à rigidité réglable et leur ensemencement avec des EC pour obtenir une confluence. De plus, nous décrivons la conception et l’assemblage d’une chambre d’écoulement rentable, complétée par des simulations numériques de dynamique des fluides, pour générer des conditions d’écoulement physiologiques caractérisées par un écoulement laminaire et des niveaux de contrainte de cisaillement appropriés. Le protocole intègre également le marquage par fluorescence pour la microscopie confocale, ce qui permet d’évaluer les réponses EC à la fois à la compliance tissulaire et aux conditions d’écoulement. En soumettant des CE cultivées à de multiples stimuli mécaniques intégrés, ce modèle permet des études complètes sur la façon dont des facteurs tels que l’hypertension et le vieillissement peuvent affecter la fonction des CE et les maladies vasculaires médiées par les CE. Les connaissances acquises grâce à ces recherches seront déterminantes pour élucider les mécanismes sous-jacents aux maladies vasculaires et pour développer des stratégies de traitement efficaces.

La figure 1 représente le dispositif expérimental, décrivant le processus de synthèse de GelMA par une réaction de méthacrylation. Le produit résultant a ensuite été utilisé pour fabriquer le substrat d’hydrogel, sur lequel les CE ont été ensemencés. Par la suite, les cellules ont été introduites dans la chambre d’écoulement pour une expérience d’écoulement de 6 h à 12 dyne/cm2.
1La spectroscopie RMN H a été utilisée pour évaluer le succès de...

Nous avons synthétisé et caractérisé un substrat à base de gélatine accordable pour la culture de cellules endothéliales vasculaires (CE) dans des conditions de flux vasculaire pertinentes. Cette surface biomimétique reproduit à la fois des conditions physiologiques et pathologiques, permettant d’étudier les forces mécaniques sur le comportement des CE et de faire progresser notre compréhension de la santé vasculaire et des mécanismes de la maladie.

Modèle in vitro intégrant la rigidité et l’écoulement du substrat pour étudier les réponses des cellules endothéliales

We present an innovative in vitro model aimed at investigating the combined effects of tissue rigidity and shear stress on endothelial cell (EC) function, ...

Cette étude porte sur la mécanobiologie en lien avec l'athérosclérose et l'hypertension. Les principales questions que nous cherchons à aborder sont les suivantes : premièrement, comment pouvons-nous reproduire plus précisément l'environnement vasculaire dans des conditions physiologiques et pathologiques ? Deuxièmement, quelles sont les réponses cellulaires des cellules endothéliales lorsqu'elles sont exposées simultanément à ces stimuli mécaniques ?L'étude vise à fournir une simulation plus précise de l'environnement vasculaire en intégrant la rigidité du substrat et les conditions d'écoulement dans un seul et même système. Les modèles in vitro antérieurs étudiaient soit la rigidité du substrat en condition statique, soit l'effet du flux sur les cellules endothéliales cultivées sur un substrat rigide, ce qui est physiologiquement irréaliste dans les deux cas. Pour commencer, ajoutez 10 grammes de gélatine de type A, 300 bloom, provenant de peau de porc, à 100 millilitres de tampon carbonates/bicarbonates.Dissoudre la gélatine dans un bain-marie à 55 degrés Celsius tout en agitant la solution à 700 tr/min à l’aide d’un agitateur magnétique. Une fois complètement dissoute, ajuster

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Nous décrivons une méthode pour objet des cellules adhérentes à la contrainte de cisaillement à flux laminaire dans un circuit à débit continu stérile. L'adhérence des cellules, la morphologie peut être étudiée à travers la chambre transparente, des échantillons obtenus à partir du circuit pour l'analyse de métabolites et cellules récoltées après une exposition de cisaillement pour les expériences futures ou la culture.

Chambre de circulation à plaques parallèles et de circuit d&#39;écoulement continu pour évaluer les cellules progénitrices endothéliales en cisaillement du flux laminaire

Nous décrivons ici une méthode simple et rapide pour mesurer la rigidité cellulaire. Le principe général de cette approche consiste à mesurer déformation de la membrane en réponse à bien défini pression négative appliquée par le biais d'une micropipette à la surface cellulaire. Cette méthode fournit un outil puissant pour étudier les propriétés biomécaniques du substrat-jointes cellules.

Aspiration par micropipette des cellules au substrat joints pour estimer la rigidité cellulaire

Larves de drosophile sont un système de modèle intéressant pour l'imagerie en direct en raison de leur cuticule translucide et la génétique puissants. Ce protocole décrit la façon d'utiliser un dispositif de PDMS à une seule couche, appelée la «puce de larve» pour l'imagerie en temps réel de processus cellulaires dans les neurones du 3ème stade larvaire chez la drosophile.

L&#39;utilisation de puces microfluidiques pour l&#39;imagerie en direct et l&#39;étude des réponses blessures en<em&gt; Drosophila</em&gt; Larves

Ce protocole d'évaluations Cell-substrat électrique impédance de détection, un procédé pour enregistrer et analyser le spectre de cellules adhérentes d'impédance pour la quantification de la fixation cellulaire, la prolifération, la motilité et la réponse cellulaire aux stimuli pharmacologiques et toxiques. La détection de la perméabilité endothéliale et l'évaluation des contacts cellule-cellule et cellule-substrat sont mis en évidence.

Électrique Cell-substrat Impedance Sensing pour la quantification de la prolifération endothéliale, de la fonction barrière, et la motilité

Ici, une méthode qui permet une préparation rapide, efficace et peu coûteuse de gels de polyacrylamide dans un format de plaque multipuits est décrite. La méthode ne nécessite aucun équipement spécialisé et pourrait être facilement adoptée par n’importe quel laboratoire de recherche. Il serait particulièrement utile dans les recherches axées sur la compréhension des réponses cellulaires dépendantes de la rigidité.

Multiwell Rigidité Essai pour l&#39;étude des réponses cellulaires Rigidité-dépendantes simple à base de polyacrylamide

Nous avons développé un test d'irritation des yeux qui utilise un modèle de tissu tridimensionnel épithéliale reconstruit cornée comme humaine (RHCE). Le test est capable de discriminer entre irritation oculaire et des matériaux corrosifs (SGH Catégories 1 et 2 combinés) et ceux qui ne nécessitent pas d'étiquetage (SGH sans catégorie).

Irritation des yeux Test (IET) pour l&#39;identification des dangers des produits chimiques irritants oculaires utilisant épithélial (RHCE) Tissue modèle reconstruit humain Cornea-like

Ce protocole se réplique du flux sanguin physiologique ou pathologique in vitro pour aider à déterminer la réponse des cellules dans des pathologies de la maladie. En introduisant une pression en aval de la chambre une pompe à sang amortissement, le flux sanguin à travers le système vasculaire peut être récapitulé et prélevée sur une monocouche de l'endothélium vasculaire ou une co-culture mimétique.

Modèle in vitro de physiologiques et pathologiques Blood Flow avec application aux enquêtes de cellules vasculaires Rénovation

La transfusion de plaquettes et l’hémostase ont été modélisées à l’aide de la reconstitution sanguine et des chambres de flux microfluidique pour étudier la fonction des plaquettes de banque de sang. Les données démontrent les conséquences de la lésion de stockage plaquettaire sur l’hémostase, in vitro.

Microfluidique flux Chambers Utilisation de sang Reconstitué au modèle Hémostase et Platelet Transfusion<em&gt; In vitro</em

culture d'organe total du disque intervertébral (DIV) conserve la matrice extracellulaire native, les phénotypes cellulaires, et les interactions entre la matrice cellulaire. Nous décrivons ici un système de culture à l'aide IVD IVD lombaire de la souris et caudale dans leurs unités fonctionnelles de la colonne vertébrale et plusieurs applications utilisant ce système.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Orgue Culture Modèle de la murine disque intervertébral

Ici, un "workflow" pour la culture et la gène analyse de l’expression des cellules endothéliales sous la contrainte de cisaillement fluide est présenté. Inclus est un arrangement physique pour simultanément du logement et la surveillance des chambres de flux multiples dans un environnement contrôlé et l’utilisation d’un ARN exogène référence pour PCR quantitative.

Analyse de l’Expression génique des cellules endothéliales exposées au Stress à l’aide de plusieurs chambres à plaques parallèles flux de cisaillement

Découvrez un modèle in vitro intégrant rigidité du substrat et écoulement pour étudier les réponses des cellules endothéliales. Cette méthode permet d'analyser la mécanotransduction vasculaire et les mécanismes de l'athérosclérose.

Modèle in vitro intégrant la rigidité et l’écoulement du substrat pour étudier les réponses des cellules endothéliales

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