Name: Enregistrement simultané de neuromodulation par ultrasons focalisés et de photométrie par fibre chez une souris en mouvement libre (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Découvrez la neuromodulation par ultrasons focalisés combinée à la photométrie par fibre chez la souris en mouvement libre. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes neuronaux et le développement de traitements pour les troubles cérébraux.

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Ce travail est soutenu en partie par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (32371151), l’Institut de recherche sur l’innovation de haut niveau du Guangdong (2021B0909050004), le Fonds de recherche collaborative du Conseil des subventions de recherche de Hong Kong (C5053-22GF), le Fonds général de recherche (15224323 et 15104520), le Fonds de technologie de l’innovation de Hong Kong (MHP/014/19), le financement interne de l’Université polytechnique de Hong Kong (G-SACD et 1-CDJM), et la Fondation des sciences naturelles de la province du Liaoning - Fonds ouvert conjoint du Laboratoire clé d’État de robotique (2022-KF-22-03). Les auteurs tiennent à remercier l’installation et le soutien technique de l’Unité universitaire de recherche en sciences de la vie (ULS) et de l’Installation de recherche universitaire en neurosciences comportementales et systémiques (UBSN) de l’Université polytechnique de Hong Kong.

Toutes les procédures et la manipulation des animaux étaient conformes aux directives éthiques de la NSFC et aux exigences du protocole approuvé par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Institut du renseignement, de la science et de la technologie du Guangdong.
1. Préparation de la sonde
<ol><li>Préparez une plaque piézoélectrique d’un diamètre intérieur de 3 mm, d’un diamètre extérieur de 7 mm et d’une fréquence centrale de 500 kHz. REMARQUE : Le diamètre extérieur peut être ajusté en fonction de la région cérébrale spécifique ciblée et doit être maximisé tout en maintenant la précision de la stimulation et sans dépasser la limite du crâne de la souris.</li>
	<li>Fixez le fil aux deux côtés de la plaque piézoélectrique à l’aide de pâte époxy-argent (Figure 1). Une fois que la pâte d’argent époxy s’est solidifiée, utilisez un multimètre pour mesurer la résistance aux deux extrémités du fil afin de vous assurer qu’elle est d’environ 0.</li>
	<li>Appliquez une couche de ruban adhésif double face sur une surface de feuille de verre propre. Collez fermement à la plaque piézoélectrique et à l’anneau de cuivre, d’une hauteur de 8 mm, d’un diamètre extérieur de 8 mm et d’un diamètre intérieur de 7,6 mm, à la feuille de verre. REMARQUE : Le diamètre intérieur de l’anneau de cuivre est déterminé par la taille de la plaque piézoélectrique pour s’assurer que la plaque est recouverte par l’anneau de cuivre.</li>
	<li>Insérez solidement le tuyau en polypropylène d’un diamètre extérieur de 3 mm au centre de la plaque piézoélectrique et collez-le fermement à la feuille de verre (Figure 1).</li>
	<li>Préparez une quantité appropriée de colle à base de résine époxy et aspirez-la. Extrayez l’époxy à l’aide d’une seringue jetable et injectez-le lentement dans l’anneau de cuivre. Attendez environ 10 h jusqu’à ce que l’époxy se soit solidifié (Figure 1).</li>
	<li>Soudez les extrémités libres de deux fils sur le connecteur de l’écrou à baïonnette à l’aide d’un fer à souder électronique. Retirez la feuille de verre. Nettoyez la surface de la sonde avec de l’alcool (Figure 1).</li>
</ol>2. Paramètres de signalement pour FUN
<ol><li>Placez l’hydrophone et le transducteur dans un réservoir d’eau rempli d’eau déminéralisée (Figure 2A). Assurez-vous que le faisceau central (axe Z) du système de positionnement est aligné avec l’axe de la sonde. Cet alignement peut être réalisé en découvrant d’abord un maximum de champ dans le plan focal grâce au balayage 2D ; deuxièmement, l’identification d’un maximum de champ dans un autre plan avec un maximum clair ; troisièmement, comparer les coordonnées X et Y des deux maxima, puis ajuster itérativement la position et/ou l’orientation du transducteur si nécessaire28.</li>
	<li>Ajustez l’extrémité de l’hydrophone avec la surface du transducteur à une distance de 1 mm, en maintenant cette distance constante tout en positionnant l’hydrophone au milieu du bord droit du transducteur. Lancez le programme de balayage pour capturer le champ acoustique libre dans le plan XZ (Figure 2B). REMARQUE : La méthode de construction de l’hydrophone peut être trouvée à https://github.com/HQArrayLab/Hydrophone_system_control.</li>
	<li>Déplacez l’hydrophone le long de l’axe Z pour déterminer les profondeurs associées à la pression de pointe spatiale. Dans cette expérience, la pression de crête spatiale apparaît à une distance de 3,4 mm de la surface du transducteur ; maintenez cette distance lorsque vous déplacez l’hydrophone dans le coin inférieur droit du transducteur dans le plan XY. Mettez sous tension et lancez le programme de balayage pour capturer le champ acoustique libre dans le plan XY (Figure 2B).</li>
	<li>Placez le transducteur sur le crâne d’une souris qui a subi une intervention chirurgicale comme décrit à l’étape 4. Acquérir le champ acoustique transcrânien sur le plan XZ et le plan XY (Figure 2D) par balayage hydrophonique comme décrit en 2.1-2.3.</li>
	<li>Lire les amplitudes de pression au point focal, qui est la région de pic spatial dans le champ acoustique libre et le champ acoustique transcrânien. L’amplitude de pression au point focal dans le champ acoustique libre est de 730k Pa, et dans le champ acoustique transcrânien est de 580k Pa. Lire les dimensions focales à -3 dB (Figure 2C, E) et la position sur les plans XY et XZ dans le champ acoustique transcrânien pour évaluer si le champ acoustique de ce transducteur peut couvrir les zones cérébrales cibles.</li>
	<li>Calculez l’indice mécanique (MI), qui est limité par le document d’orientation de la FDA à être inférieur à 1,9 afin d’atténuer la cavitation. Le calcul de l’IM est donné par l’équation : <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67090/67090eq01.jpg" style="margin: auto;">(1) où pr,.3 représente la pression de raréfaction de crête en MPa ajustée par un coefficient d’affaiblissement de 0,3 dB cm-1 MHz-1, et f0 est la fréquence de fonctionnement en MHz. La pression de raréfaction de crête du champ transcrânien mesurée est de 580 kPa, , à 3,4 mm du transducteur, le f0 est de 500 kHz, de sorte que le pr,.3 déclassé est de 576,6 kPa. L’IM est de 0,82.</li>
	<li>Calculez l’intensité moyenne d’impulsion de crête spatiale (Isppa), qui doit être inférieure à 190 W/cm2 dans la direction du plan conformément au document d’orientation de la FDA. Le calcul de l’intensité est donné par l’équation : <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67090/67090eq02.jpg" style="margin: auto;">(2) où psp (t) est la pression acoustique variant dans le temps à l’emplacement du pic spatial, Z est l’impédance acoustique caractéristique du milieu (environ 1.5 x 106 Rayls pour les tissus mous), et est la durée d’impulsion. Dans le cas de l’enveloppe carrée, cela se réduit à l’équation suivante : <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/67090/67090eq03.jpg" style="margin: auto;">(3) où A est l’amplitude de la pression de crête spatiale. Le A mesuré à l’emplacement focalisé par ultrasons est de 580 kPa, et le Z du cerveau est d’environ 1,58 x 106 Rayls, donc le Isppa de l’enveloppe carrée est de 10,65 W/cm2 et le Isppa de l’enveloppe sinusoïdale est de 10,65 W/cm2.</li>
	<li>Calculez l’intensité moyenne temporelle de crête spatiale (Ispta), qui est contrainte par le document d’orientation de la FDA comme étant inférieure à 430 mW/cm2 dans la direction du plan. Le calcul de l’intensité est donné par l’équation : <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/67090/67090eq04.jpg" style="margin: auto;">(4) où T est la période sur laquelle la moyenne est calculée. Dans le cas de l’enveloppe carrée, cela se réduit à l’équation suivante : <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/67090/67090eq05.jpg" style="margin: auto;">(5) oùle train d’impulsions CC est le rapport cyclique de l’impulsion. Ici, le train d’impulsions DC est de 1% car des ondes continues ont été utilisées, de sorte que le I spta est égal à l’intensité moyenne de l’impulsion de crête spatiale, soit 106,5 mW/cm2 pour une enveloppe carrée. Les valeurs MI, Isppa et Ispta peuvent être calculées à l’aide du logiciel (Figure 3A). Un code basé sur MATLAB pour une utilisation facile est disponible à l’adresse https://github.com/HQArrayLab/Ultrasound_Parameter_Caculation.</li>
	<li>Indiquez les paramètres de synchronisation des impulsions, y compris Amax, la durée des impulsions, l’intervalle de répétition des impulsions, la durée du train d’impulsions et l’enveloppe (Figure 3B).</li>
</ol>3. Préparation de l’animal à la chirurgie
<ol><li>Peser des souris transgéniques mâles GCaMP6s âgées de 8 semaines, d’un poids approximatif d’environ 20 g. Préparez une solution contenant de la kétamine à 10 mg/mL et de la xylazine à 2 mg/mL dans une solution saline stérile. Administrer la solution de kétamine/xylazine par injection intrapéritonéale à une dose de 100 mg/kg de kétamine et de 20 mg/kg de xylazine à l’aide d’une aiguille de 26 g et d’une seringue jetable de 1 ml. Commencer la préparation chirurgicale une fois que l’animal ne répond plus aux stimuli douloureux, comme le pincement des orteils.</li>
	<li>Utilisez un fader pour couper les poils de la tête de l’animal et désinfectez la zone avec de l’éthanol à 70 % et de la povidone iodée avant l’intervention chirurgicale.</li>
	<li>Placez la souris en position couchée sur le cadre stéréotaxique et assurez-vous que le crâne est de niveau. Placez une pommade ophtalmique protectrice sur les yeux de l’animal pour maintenir l’hydratation.</li>
</ol>4. Intervention chirurgicale
<ol><li>Faites une incision le long de la suture sagittale, en partant de l’os occipital jusqu’au début de l’os nasal. Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour enlever la peau recouvrant les deux hémisphères.</li>
	<li>Utilisez une solution saline stérile pour nettoyer le crâne et éliminer tout périoste restant.</li>
	<li>Appliquez du peroxyde d’hydrogène à 3 % sur le crâne exposé à l’aide d’un coton-tige pendant environ 2 à 3 s pour créer des micropores. Rincez abondamment avec une solution saline stérile et assurez-vous que la zone est complètement sèche.</li>
	<li>Créez une craniotomie à trou de fraise de 0,6 mm de diamètre à l’aide d’un foret stérile autoclavé au-dessus de l’emplacement de la zone du cerveau, tel que déterminé par l’atlas stéréotaxique aligné sur bregma et lambda. Lavez tous les débris avec une solution saline stérile et assurez-vous qu’ils sèchent soigneusement. Veillez à ne pas endommager les tissus.</li>
	<li>Insérez la virole à fibre optique (implant) dans le support de sonde et connectez-la au bras stéréotaxique.</li>
	<li>Alignez l’implant directement au-dessus de la région d’intérêt à l’aide du bras stéréotaxique. Lors de l’insertion de la fibre optique dans le tissu cérébral, avancez lentement la fibre à une vitesse d’environ 2 mm/min.</li>
	<li>Mélangez le ciment dentaire pour obtenir une viscosité qui permet une application facile sur le crâne. À l’aide d’un cure-dent stérile, étalez une fine couche de ciment dentaire sur le crâne et sur la partie inférieure de l’implant. Laissez-le sécher complètement.</li>
	<li>Détachez soigneusement le support de la sonde. Préparez un tuyau en polypropylène d’une hauteur de 3 mm, d’un diamètre extérieur de 3 mm et d’un diamètre intérieur de 2,6 mm, puis coupez le tuyau sur toute sa longueur.</li>
	<li>Fixez le tuyau au bas de l’implant à l’aide d’une pince à épiler. Versez la poudre de ciment dentaire dans le tuyau en assurant une longueur suffisante au-dessus de l’implant pour l’enregistrement du signal de la fibre optique. Ajoutez le liquide requis et laissez le ciment dentaire se solidifier quelques minutes.</li>
	<li>Localisez l’ouverture du tuyau et fixez-le soigneusement pour retirer le tuyau à l’aide d’une pince à épiler. Préparez le mélange de ciment dentaire pour l’application, en veillant à ce qu’une couche uniforme et mince soit répartie sur le crâne. Couvrez autant de surface que possible sur le crâne avec du ciment dentaire. Attendez quelques minutes que le cémenton dentaire se solidifie. REMARQUE : Ne laissez pas le ciment dentaire entrer en contact avec la peau de la souris.</li>
	<li>Percez trois trous (1 mm de diamètre) dans l’anneau imprimé en 3D, uniformément répartis à l’horizon, d’une hauteur de 7 mm, d’un diamètre extérieur de 10 mm et d’un diamètre intérieur de 8,4 mm. Fixez les vis (longueur 1 mm) dans leurs trous respectifs.</li>
	<li>Insérez le haut de l’implant dans le trou du transducteur préfabriqué. Assurez-vous que la paroi intérieure de l’anneau imprimé en 3D est lisse, puis placez-la autour de la sonde positionnée sur le crâne de la souris. Assurez-vous que la sonde est centrée dans l’anneau.</li>
	<li>Appliquez du ciment dentaire à la jonction entre l’anneau et le crâne, puis attendez quelques minutes que le ciment dentaire se solidifie. Évitez de placer le ciment dentaire sur la connexion entre le transducteur et le crâne.</li>
	<li>Retirez délicatement le transducteur et serrez fermement les vis. Transférez la souris dans une cage chaude et assurez-vous qu’elle est surveillée jusqu’à ce qu’elle soit complètement rétablie avant de la remettre dans sa cage d’origine.</li>
	<li>Après la chirurgie, administrer du carprofène sous-cutané (2 mg/kg) pour l’analgésie et continuer toutes les 24 heures pendant 3 jours pour gérer l’inflammation et la douleur. Surveillez quotidiennement les animaux pour détecter tout signe de détresse, de perte de poids anormale, de douleur ou d’infection. Normalement, au 3ejour après l’opération, toutes les souris devraient présenter un comportement normal. Si des signes de détresse ou de maladie sont observés chez une souris après le3e jour, suivez les directives de l’établissement pour l’euthanasie.</li>
</ol>5. Stimulation et enregistrement du signal
<ol><li>À 7 jours après la chirurgie, ouvrez l’alimentation en oxygène de l’appareil d’anesthésie gazeuse et ajustez le régulateur de débit d’oxygène pour régler le débit de gaz à 300-500 ml/min.</li>
	<li>Placez la souris dans la chambre d’induction et fermez l’administration de gaz anesthésique dans le masque. Tournez le cadran du vaporisateur pour régler la concentration d’anesthésique appropriée (2 % à 2,5 %).</li>
	<li>Une fois la souris anesthésiée, placez-la sur le cadre stéréotaxique à l’aide d’un masque anesthésique. Fermez la ligne d’induction pour laisser le gaz anesthésique s’écouler dans le masque anesthésique. Ajustez la concentration appropriée de l’anesthésique d’entretien (1 % à 1,5 %).</li>
	<li>Nettoyez la surface supérieure de l’implant avec de l’alcool, puis insérez le cordon de raccordement à fibre optique au centre du transducteur préparé.</li>
	<li>Injectez de l’eau dans l’espace entre l’implant et l’anneau imprimé en 3D à l’aide d’une aiguille 26G et d’une seringue jetable de 1 ml pour humidifier le crâne. Utilisez des serviettes en papier pour absorber l’excès d’eau.</li>
	<li>Injectez un agent de couplage dans l’espace entre l’implant et l’anneau imprimé en 3D à l’aide d’une aiguille 26G et d’une seringue jetable de 1 ml pour faciliter la propagation des ultrasons du transducteur vers le cerveau.</li>
	<li>Connectez l’implant au cordon de raccordement à fibre optique. Insérez soigneusement le transducteur dans la zone remplie d’un agent de couplage et serrez fermement les vis.</li>
	<li>Placez la souris dans un champ ouvert et laissez-la se réveiller. Fixez le transducteur au système d’excitation par ultrasons et connectez le cordon de raccordement à fibre optique au système d’enregistrement à fibre optique, permettant ainsi à la souris de se déplacer sans aucun mouvement. REMARQUE : Le cordon de raccordement à fibre optique a une longueur de 2 m et un diamètre de 1,25 mm. L’intensité lumineuse du canal 405 est de 20 μW et celle du canal 470 est de 40 μW.</li>
	<li>Activez à la fois le dispositif d’excitation par ultrasons et le système d’enregistrement par fibre optique afin de synchroniser la modulation neuronale par ultrasons avec l’enregistrement du signal par fibre optique.</li>
</ol>

Protocole intégré pour la photométrie FUN et fibre chez les souris en mouvement libre

<ol><li>Wang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ultrasound+for+noninvasive%2C+focal+pharmacologic+neurointervention%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Focused ultrasound for noninvasive, focal pharmacologic neurointervention.</a> Front Neurosci. 14, 514541(2020).</li>
<li>Bystritsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+low-intensity+focused+ultrasound+pulsation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+stimulation%22%5BJournal%5D)">A review of low-intensity focused ultrasound pulsation.</a> Brain stimulation. 4 (3), 125-136 (2011).</li>
<li>Di Ianni, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+ultrasound+neuromodulation+in+awake+and+freely+behaving+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+stimulation%22%5BJournal%5D)">High-throughput ultrasound neuromodulation in awake and freely behaving rats.</a> Brain stimulation. 16 (6), 1743-1752 (2023).</li>
<li>Legon, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+focused+ultrasound+modulates+the+activity+of+primary+somatosensory+cortex+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transcranial focused ultrasound modulates the activity of primary somatosensory cortex in humans.</a> Nat Neurosci. 17 (2), 322-329 (2014).</li>
<li>Badran, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonication+of+the+anterior+thalamus+with+mri-guided+transcranial+focused+ultrasound+%28tfus%29+alters+pain+thresholds+in+healthy+adults%3A+A+double-blind%2C+sham-controlled+study%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+stimulation%22%5BJournal%5D)">Sonication of the anterior thalamus with mri-guided transcranial focused ultrasound (tfus) alters pain thresholds in healthy adults: A double-blind, sham-controlled study.</a> Brain stimulation. 13 (6), 1805-1812 (2020).</li>
<li>Yaakub, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+focused+ultrasound-mediated+neurochemical+and+functional+connectivity+changes+in+deep+cortical+regions+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Transcranial focused ultrasound-mediated neurochemical and functional connectivity changes in deep cortical regions in humans.</a> Nat Comm. 14 (1), 5318(2023).</li>
<li>Murphy, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tool+for+monitoring+cell+type-specific+focused+ultrasound+neuromodulation+and+control+of+chronic+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">A tool for monitoring cell type-specific focused ultrasound neuromodulation and control of chronic epilepsy.</a> Proc Natl Acad Sci. 119 (46), e2206828119(2022).</li>
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<li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nat Meth. 16 (7), 649-657 (2019).</li>
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<li>Legaria, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+photometry+in+striatum+reflects+primarily+nonsomatic+changes+in+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fiber photometry in striatum reflects primarily nonsomatic changes in calcium.</a> Nat Neurosci. 25 (9), 1124-1128 (2022).</li>
<li>Kamimura, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ultrasound+neuromodulation+of+cortical+and+subcortical+brain+structures+using+1.9+mhz%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Phys%22%5BJournal%5D)">Focused ultrasound neuromodulation of cortical and subcortical brain structures using 1.9 mhz.</a> Med Phys. 43 (10), 5730-5735 (2016).</li>
<li>Xian, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+deep+neural+circuits+with+sonogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Modulation of deep neural circuits with sonogenetics.</a> Proc Natl Acad Sci. 120 (22), e2220575120(2023).</li>
<li>Mohammadjavadi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+peripheral+auditory+pathway+activation+does+not+affect+motor+responses+from+ultrasound+neuromodulation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+stimulation%22%5BJournal%5D)">Elimination of peripheral auditory pathway activation does not affect motor responses from ultrasound neuromodulation.</a> Brain stimulation. 12 (4), 901-910 (2019).</li>
<li>Harris, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophone+measurements+for+biomedical+ultrasound+applications%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Ultrasonics+Ferroelect+Freq+Cont%22%5BJournal%5D)">Hydrophone measurements for biomedical ultrasound applications: A review.</a> IEEE Trans Ultrasonics Ferroelect Freq Cont. 70 (2), 85-100 (2022).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Cette approche combine FUN avec l’enregistrement par photométrie optique, ce qui permet d’étudier le fonctionnement du cerveau de la souris et le mécanisme FUN in vivo . L’ensemble du processus opérationnel, de la fabrication du transducteur aux procédures chirurgicales, est décrit, ce qui permet aux chercheurs d’effectuer indépendamment des opérations de divertissement en dehors du terrain.
Un aspect crucial du protocole est de s’assurer que l’implant optique est inséré en douceur dans le transducteur, que le ciment dentaire à travers le crâne est suffisamment mince pour la pénétration des ultrasons dans le cerveau, que l’implant optique est solidement connecté au crâne pour éviter de se déloger pendant l’expérience et que la sortie d’énergie du transducteur est suffisante pour une neuromodulation efficace. L’épaisseur du ciment dentaire entourant l’implant doit être égale ou inférieure au diamètre du trou du transducteur. Par conséquent, il est conseillé d’utiliser le même tuyau en polypropylène pour le processus de fabrication du transducteur et la chirurgie. Étant donné que le tuyau en polypropylène n’adhère pas au ciment dentaire, il est sélectionné pour mouler le ciment dentaire autour de l’implant, avec une coupe latérale, afin de faciliter le retrait du tuyau en polypropylène.
L’enregistrement électrophysiologique et l’enregistrement par photométrie optique sont des technologies couramment utilisées pour surveiller l’activité cérébrale in vivo, offrant une haute résolution temporelle et spatiale. Cependant, l’enregistrement électrophysiologique capture le signal d’activité de décharge des neurones attachés directement aux électrodes. Les ondes ultrasonores pourraient faire vibrer directement les électrodes, induisant des effets de confusion inutiles. Heureusement, la technologie de photométrie par fibre, qui est moins invasive, capture l’activité des neurones en dessous, ce qui pourrait réduire l’effet confondant des vibrations ultrasonores sur l’implant 7,19,26. Par conséquent, la technologie de neuromodulation par ultrasons focalisés simultanés et d’enregistrement par photométrie par fibre chez des souris en mouvement libre permet d’étudier les mécanismes in vivo de la neuromodulation par ultrasons et permet d’observer les réponses comportementales des souris sans l’interférence de l’anesthésie.
Cependant, la résolution spatiale de la photométrie par fibre est limitée car elle est incapable de surveiller l’activité des subcircuits et des microcircuits24. De plus, il fournit une représentation indirecte de l’activité neuronale puisqu’il n’enregistre pas directement les signaux électriques produits par l’activité neuronale.

La neuromodulation par ultrasons focalisés (FUN) est apparue comme un outil de neuromodulation prometteur et polyvalent, permettant l’exploration du fonctionnement et de l’organisation du cerveau à fort potentiel1. FUN est capable de fournir de l’énergie acoustique de manière non invasive à n’importe quelle position dans le tissu cérébral avec une précision extrême2. Sa capacité à moduler transitoirement et de manière réversible la neuroactivité dans la structure profonde du cerveau, avec une spécificité spatio-temporelle élevée, de manière sûre et non invasive, présente un attribut attrayant qui complète la technique de neuromodulation clinique existante3. La démonstration d’un FUN efficace a été confirmée chez les sujets humains 4,5,6 et chez divers modèles animaux, englobant les petitesespèces 7,8,9,10 et les grandes espèces 11,12,13,14,15,16,17.
En observant l’effet du FUN sur des types neuronaux spécifiques grâce à la surveillance de la neuroactivité pendant le FUN, nous pouvons approfondir le mécanisme derrière ce processus18,19. La photométrie par fibre basée sur des indicateurs de calcium génétiquement codés (GECI) est devenue largement utilisée au cours de la dernière décennie comme méthode polyvalente pour suivre l’activité de la population spécifique au type de cellule in vivo 20,21,22,23,24. Par conséquent, l’application simultanée du FUN et de la photométrie par fibre optique peut enrichir considérablement notre compréhension globale du FUN. Néanmoins, l’utilisation de transducteurs uniques encombrants nécessite une fixation à un cadre, tandis que les animaux doivent subir une anesthésie et être immobilisés dans un cadre stéréotaxique 7,19,25,26. Cette approche peut ne pas convenir à certains types d’expériences liées à la perception, à la cognition et à l’évaluation du comportement. Il est crucial d’établir un protocole qui facilite l’amalgame de la photométrie FUN et de la photométrie par fibre sans entraver la mobilisation des souris7.
Dans cette étude, nous présentons un protocole affiné utilisé dans nos études précédentes pour compléter de manière transparente et gracieuse la méthode de fabrication d’un seul transducteur et sa fixation temporaire sur les souris, ainsi que la fixation sécurisée d’un implant à fibre optique pour faciliter le passage en douceur du transducteur 7,19,26. Il permet aux chercheurs d’enregistrer la neuroactivité modulée par les ultrasons chez des souris non maîtrisées. Nous avons opté pour une enveloppe plus lisse, telle qu’une enveloppe sinusoïdale, pour réduire la confusion auditive27. La faisabilité de ce protocole est confirmée par l’enregistrement simultané de la neuroactivité dans le noyau thalamique antérieur de souris se déplaçant librement pendant le FUN. Il démontre que l’énergie du transducteur est suffisante pour réaliser la neuromodulation, et les méthodes de fixation de l’implant à fibre optique et du transducteur peuvent assurer leur stabilité.

<table><tbody><tr><td>Seringue jetable 1ml</td><td>DOUBLE-DOVE</td><td>Aiguilles</td><td>d’injection</td></tr><tr><td>1ml Aiguille calibre 26</td><td>Jin mao</td><td>JM-J02</td><td>Aiguilles de préparation</td></tr><tr><td>70 % éthanol</td><td>Dong de alcohol&nbsp ;</td><td>0.7</td><td>Désinfecter</td></tr><tr><td>l’alcool</td><td>Dong de alcohol&nbsp ;</td><td>0.75</td><td>Nettoyer la surface du transducteur</td></tr><tr><td>Écrou à baïonnette Connecteur</td><td>Risym</td><td>75-5</td><td>L’autre extrémité du fil de connexion est connectée à l’anneau de cuivre du dispositif d’excitation par ultrasons</td></tr><tr><td></td><td>Guowei Matériaux métalliques Diamètre</td><td>extérieur, épaisseur de paroi, hauteur (8mm, 0.2mm, 8mm)</td><td>Le boîtier de protection extérieur de la seringue jetable du transducteur</td></tr><tr><td></td><td>DOUBLE-DOVE</td><td>1ml</td><td>L’inhalation de résine époxy permet d’injecter de petites quantités précises dans le tuyau en cuivre</td></tr> ruban <tr><td>adhésif double face</td><td>3M</td><td>3M55236</td><td>Il est utilisé pour fixer le transducteur et le fil pour s’assurer que la colle époxy argent ne bouge pas avant le séchage</td></tr><tr><td>du fer à souder électronique</td><td>Victor</td><td>868A+</td><td>Les fils soudés sont connectés à la colle résine</td></tr><tr><td>époxy</td> BNC <td>Kraft</td><td>K 9741</td><td>Sceller l’arrière du transducteur</td></tr> pâte <tr><td>époxy argent</td><td>Vonroll</td><td>CB-052</td><td>Le fil est fixé aux pôles positif et négatif de la feuille de céramique piézoélectrique et la résistance est maintenue à un faible</td></tr><tr><td>fader&nbsp ;</td><td>JOQO</td><td>YP-7021</td><td>Retirez les poils de la tête de l’appareil d’anesthésie au gaz de souris</td></tr><tr><td></td><td>RWD</td><td>R500</td><td>Il est utilisé pour l’anesthésie dans la</td></tr><tr><td>feuille de verre</td><td>de souris Verre carré</td><td>80mm * 80mm</td><td>Une surface de fonctionnement temporaire pour placer des céramiques piézoélectriques et des fils peut être utilisée pour recouvrir la surface de la plaque de verre avec du ruban adhésif double face</td></tr><tr><td>kétamine / xylazine&nbsp ;</td><td>Shutai/shengxin</td><td>Zoletil 50/2ml*10</td><td>Anesthésier la souris</td></tr><tr><td>agent de couplage médical</td><td>Bestman</td><td>120g</td><td>Le couplant agit comme un moyen de conduire le signal d’échographie</td></tr><tr><td>souris</td><td>Bai shi tong</td><td>GCaMp6</td><td>Sujet de test</td></tr><tr><td>Pommade ophtalmique</td><td>Yun Zhi</td><td>0,5 % x 2,5 g x1</td><td>Humidifie le contour des yeux pour prévenir la cécité</td></tr><tr><td>&nbsp ; plaque piézoélectrique</td><td>Jiaming Electronics</td><td>Factory Diamètre, pore, épaisseur (7mm, 3mm, 3.56mm)</td><td>L’énergie électrique est émise sous la forme d’un tuyau en</td></tr><tr><td>polypropylène</td> à ultrasons <td>Baihao Pipe Factory</td><td>Diamètre extérieur, diamètre intérieur, longueur (3mm, 2mm, 500mm)</td><td>Empêchez la résine époxy de boucher les trous et de laisser les trous</td></tr><tr><td>povidone-iode</td><td>lefeke</td><td>500ml</td><td>Désinfecter</td></tr><tr><td>enregistrement du signal de la fibre</td><td>Thinker Tech Nanjing Biotech</td><td>Système d’enregistrement de fibre optique monocanal tricolore</td><td>Enregistrer les signaux de photométrie de la fibre</td></tr><tr><td>cadre stéréotaxique</td><td>RWD</td><td>68805</td><td>Fixer la tête de la souris et localiser la région du cerveau</td></tr><tr><td>stérile salin</td><td>Shijiazhuang si yao</td><td>500ML,4.5g</td><td>En tant que solvant, dissout la stimulation médicamenteuse</td></tr><tr><td>des ultrasons&nbsp ;</td><td>Deep Brain Technology</td><td>DB-USNM</td><td>Fournit une entrée stable à la machine de pesage du transducteur</td></tr><tr><td></td><td>Qin bo shi</td><td>1718</td><td>Peser le fil de souris</td></tr><tr><td></td><td>Jinpeng Cable Factory</td><td>0,3 mm2</td><td>La tension est fournie au transducteur</td></tr></tbody></table>

enregistrement simultané de neuromodulation par ultrasons focalisés et de photométrie par fibre chez une souris en mouvement libre

Simultaneous Focused Ultrasound Neuromodulation and Fiber Photometry Recording in Free-Moving Mouse

La neuromodulation par ultrasons focalisés (FUN) représente une approche prometteuse pour la perturbation non invasive des circuits neuronaux dans les régions profondes du cerveau. Il est compatible avec la plupart des modalités existantes de surveillance des fonctions cérébrales in vivo. L’intégration avec les modalités d’enregistrement des fonctions cérébrales nous permet non seulement d’aborder les ordres et les troubles de fonctions cérébrales spécifiques avec une rétroaction en boucle fermée, mais nous fournit également des informations mécanistes sur FUN lui-même. Ici, nous fournissons un protocole modifié, simple, fiable et robuste pour l’application simultanée de l’enregistrement de fluorescence FUN et de photométrie par fibre optique GCaMP6s chez des souris en mouvement libre. Cela implique la fabrication d’un transducteur unique de bonne taille et son placement temporaire sur les souris, ainsi que la fixation sécurisée d’un implant à fibre optique pour faciliter le passage en douceur du transducteur. La combinaison de FUN et de la photométrie par fibre permet l’enregistrement optique des réponses des circuits neuronaux lors de la lecture FUN en temps réel dans les régions profondes du cerveau. Pour démontrer l’efficacité de ce protocole, les souris Thy1-GCaMP6s ont été utilisées comme exemple pour enregistrer la neuroactivité dans le noyau thalamique antérieur pendant FUN pendant que les souris se déplacent librement. Nous pensons que ce protocole peut promouvoir l’utilisation généralisée de FUN dans le domaine des neurosciences et de l’échographie biomédicale.

La répartition de la pression acoustique dans le champ acoustique libre sur le plan XY et le plan XZ situés à 3,4 mm de la surface du transducteur, correspondant à la position du noyau thalamique antérieur de la souris, est illustrée sur les figures 2B et C. Ces mesures ont été acquises par balayage d’hydrophones dans le domaine XY et le domaine XZ. La répartition de la pression acoustique dans le champ acoustique transcrânien sur le plan XY et le plan XZ situés à 3,4 mm de la surface du transducteur est illustrée à la figure 2D,E. La pression acoustique libre mesurée est de 730 kPa, et la pression acoustique transcrânienne mesurée est de 580 kPa pour une fréquence centrale de 500 kHz. L’épaisseur du crâne mesurée est d’environ 0,2 mm, en moyenne. Nous supposons que la relation de dispersion est approximativement linéaire, de sorte que le crâne a un coefficient d’atténuation de 19,98 dB/cmMHz. Le transducteur léger, pesant environ 1,66 g, permet à la souris de se déplacer facilement, facilitant l’observation du comportement de réponse de la souris sous FUN et la traînée de mouvement.
Les signaux de fibre optique ont été enregistrés sous FUN (Figure 4B,D), l’enveloppe étant carrée et sinusoïdale, respectivement. Cinq souris mâles ont été utilisées dans l’expérience. Le carré a duré 300 ms, tandis que le sinusoïdal continu a duré 471 ms, ce qui peut garantir que l’énergie totale est la même dans deux FUN différents (Figure 4A,C). Une amélioration du signal de la fibre optique indique une augmentation de l’activité neuronale. La réponse neuronale est rapide sous le FUN, ce qui suggère que le transducteur a suffisamment d’énergie et d’excellentes capacités de concentration.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67090/67090fig01.jpg"> Figure 1 : Processus de production du transducteur. Il s’agit, à son tour, de connecter une feuille piézoélectrique à un fil, puis de l’emballer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67090/67090fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67090/67090fig02v2.jpg"> Figure 2 : Configuration et caractérisation de la mesure du champ ultrasonore pour le transducteur à ultrasons. (A) La configuration pour la mesure du champ par ultrasons comprend un hydrophone, un système moteur, un logiciel de contrôle, un générateur de signaux et un oscilloscope. (B, D) Schéma de principe des mesures par transducteur ultrasonore dans les champs acoustiques libres et transcrâniens et les résultats des mesures de champ acoustique transversal et longitudinal. (C, E) Schéma du champ sonore transversal à la position focale du transducteur, la ligne rouge indiquant le champ sonore à la position -3 dB. (F, G) Diagramme de forme d’onde de la sortie mesurée par l’hydrophone pour le transducteur. La zone à l’intérieur de la boîte en pointillés rouges et la zone à l’intérieur de la boîte en pointillés bleus représentent respectivement les périodes avant que la forme d’onde n’atteigne une amplitude stable et la période de résonance du transducteur à la fin. La zone à l’intérieur de la boîte pointillée orange représente la partie stable de la forme d’onde, qui est utilisée pour calculer l’amplitude de pression, notée p. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67090/67090fig02largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67090/67090fig03.jpg"> Figure 3 : Logiciel de calcul et paramètre d’échographie. (A) Une interface maison de calcul des paramètres d’échographie. MI, Isppa, et Ispta ont été calculés. L’interface pourrait être obtenue à partir de https://github.com/HQArrayLab/Ultrasound_Parameter_Caculation. (B) Schémas des formes d’onde de pression ultrasonore. Une enveloppe d’impulsion sinusoïdale et une enveloppe d’impulsion rectangulaire sont utilisées. La période (T) représente la durée d’un seul cycle de la fréquence de fonctionnement. Une impulsion, connue sous le nom de sonication continue unique, dure une durée spécifiée appelée durée d’impulsion (). En règle générale, les impulsions sont répétées dans une séquence connue sous le nom de train d’impulsions. L’intervalle de temps entre deux impulsions consécutives dans un train d’impulsions est appelé intervalle de répétition d’impulsions (PRI), calculé comme l’inverse de la fréquence de répétition d’impulsions (PRF). La séquence entière d’impulsions, connue sous le nom de train d’impulsions, a une durée spécifique connue sous le nom de durée du train d’impulsions. L’intervalle de temps correspond à la durée d’un seul essai. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67090/67090fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67090/67090fig04v2.jpg"> Figure 4 : Signal de la photométrie de la fibre pendant le FUN. (A, C) Paramètres échographiques enveloppés par carré (B) et sinusoïdal (D). (B, D) Le signal de photométrie de la fibre respectivement pendant le FUN de (A) et (C). L’ombre verte est la durée du FUN. La ligne continue est la moyenne, et les nuances de bleu et de rouge sont la moyenne et l’écart-type des signaux enregistrés. Cinq souris mâles ont été utilisées dans l’expérience. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67090/67090fig04largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Le protocole comprend la fabrication du transducteur, l’enregistrement des paramètres, l’intervention chirurgicale et l’enregistrement du signal pour l’ensemble du flux de travail opérationnel de neuromodulation par ultrasons focalisés simultanés et d’enregistrement par photométrie à fibre chez les souris en mouvement libre.

Enregistrement simultané de neuromodulation par ultrasons focalisés et de photométrie par fibre chez une souris en mouvement libre

Focused ultrasound neuromodulation (FUN) represents a promising approach for non-invasive perturbation of neuronal circuits at deep brain regions. It is ...

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Cette vidéo montre une méthode d’enregistrement de l’activité neuronale d’une souris se déplaçant librement à l’aide de la photométrie par fibre. Dans cette méthode, les neurones d’une région spécifique du cerveau expriment un indicateur de calcium codé génétiquement. Un stimulus est appliqué à cette région du cerveau, et le changement de fluorescence dépendant du stimulus est mesuré pour identifier l’activité neuronale.

Enregistrement de l’activité neuronale chez des souris se déplaçant librement à l’aide de la photométrie à fibre

Source : Maruoka, H., et. al.  Imagerie simultanée de la dynamique microgliale et de l’activité neuronale chez les souris éveillées. J. vis. exp..  (2022) Cette vidéo montre une procédure de microscopie à deux photons pour imager l’activité neuronale et la dynamique microgliale chez une souris éveillée pendant une stimulation visuelle, en mettant en évidence les transitoires calciques et les interactions cellulaires.

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Enregistrement simultané de neuromodulation par ultrasons focalisés et de photométrie par fibre chez une souris en mouvement libre

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