Détermination de la fonction ciliaire et de l’imperméabilité membranaire de l’épithélium des voies respiratoires pulmonaires pseudostratifié

Notre recherche vise à mesurer deux propriétés biophysiques critiques de l’épithélium des voies respiratoires pseudostratifié, qui peuvent être obtenues en différenciant les cellules épithéliales bronchiques humaines normales dans une interface air-liquide. Nous avons identifié différentes caractéristiques de différents virus respiratoires en utilisant un épithélium des voies respiratoires pseudostratifié. Par exemple, l’inflammation cytosquelettique induite par le virus respiratoire syncytial, qui est un mécanisme non canonique de la bronchiolite.

Nous avons également identifié que l’hyperplasie des cellules caliciformes augmente la réplication du SRAS-CoV-2 dans l’épithélium des voies respiratoires de la bronchopneumopathie chronique obstructive. Nous nous sommes concentrés sur l’élucidation du mécanisme de modulation de la signalisation cytosquelettique induite par le virus respiratoire syncytial afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour lutter contre l’infection par le VRS et la bronchiolite induite par le virus. Pour commencer, prenez une suspension de cellules épithéliales bronchiques humaines normales, ou NHBE.

À l’aide d’une pipette P200, ajoutez 50 000 cellules remises en suspension dans 200 microlitres de cellule épithéliale complète des voies respiratoires, ou AEC, moyenne sur la face apicale de l’insert. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur de culture cellulaire de dioxyde de carbone humidifié à 85 % à 95 %. Une fois que les cellules sont confluentes, transférez les inserts dans un puits vide à l’aide d’une pince stérile.

À l’aide d’une pipette P1000, aspirer tout le milieu AEC basal. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de milieu de différenciation ALI complet frais complété par 2 % de pénicilline-streptomycine et 1 % d’amphotéricine B dans le puits basal. À l’aide d’une pince stérile, transférez les inserts dans le puits basal avec le milieu ALI complet ajouté.

À l’aide d’une pipette P200, aspirez doucement le milieu AEC apical du puits et incubez-le. Après 48 heures, transférez les inserts dans un puits vide avec une pince stérile. À l’aide d’une pipette P1000, aspirez l’ancien milieu et ajoutez 500 microlitres de milieu ALI complet frais.

Remettez les inserts dans le puits avec un milieu frais à l’aide d’une pince stérile. Le jour 26, à l’aide d’une pipette P200, ajoutez 100 microlitres de DPBS sur la face apicale des inserts. Incuber à 37 degrés Celsius dans un incubateur de culture cellulaire humidifié pendant 30 minutes.

Ensuite, aspirez le DPBS à l’aide d’une pipette P200. Pour commencer, allumez le microscope, l’ordinateur connecté et la chambre environnementale. Ouvrez la porte de la chambre et placez la plaque contenant les inserts avec les cellules NBHE sur la platine du microscope.

Une fois la plaque sur la platine, fermez la chambre. Ensuite, utilisez le bouton de commande de la platine du microscope pour déplacer la plaque et afficher les inserts. Sur l’écran de l’ordinateur, cliquez sur l’icône du système SAVA pour ouvrir le programme SAVA.

Sur l’interface du logiciel, cliquez sur Configurer l’expérience. Dans l’onglet suivant, cliquez sur Créer une expérience. Ensuite, dans le nouvel onglet, entrez le répertoire dans lequel les données seront stockées dans le champ Entrer le nom du répertoire de l’expérience et fournissez les détails dans le champ Entrer la description de l’expérience, puis cliquez sur OK. Maintenant, cliquez sur l’expérience qui a été créée et qui est affichée dans le répertoire sous la section Expériences.

Ensuite, cliquez sur Modifier et fournissez les détails de l’échantillon dans le champ Description de l’échantillon. Cliquez sur Ajouter, puis sur Quitter pour quitter l’onglet. Sur l’interface principale du logiciel, sélectionnez l’expérience créée dans le menu déroulant de l’emplacement Expérience.

Ensuite, cliquez sur Enregistrer une vidéo pour surveiller la fréquence des battements ciliaires sur l’écran de l’ordinateur. L’écran affichera le mouvement ciliaire ciliaire. Pour chaque insertion, enregistrez six trames aléatoires différentes pendant 2,1 secondes à 120 images par seconde.

Cliquez sur Enregistrer la vidéo pour surveiller les données de fréquence des battements ciliaires. Pour analyser les données, cliquez sur Analyser la vidéo sur l’interface du logiciel. Et dans l’onglet suivant, cliquez sur OK. Allez ensuite dans l’onglet suivant et cliquez sur Analyser tout.

Téléchargez la feuille de calcul générée pour chaque expérience dans le dossier SAVA Data Acquisition de l’ordinateur. Prenons la fréquence moyenne gaussienne pour la présentation des données. La fréquence du battement ciliaire a atteint au moins trois hertz pour l’épithélium des voies respiratoires des adultes en bonne santé et des personnes atteintes de BPCO, montrant une fonction ciliaire comparable.

Pour commencer, allumez l’ohmmètre EVOM2 volts à l’aide de l’interrupteur d’alimentation. Connectez la résistance de test à l’EVOM2 au niveau de l’emplacement d’entrée. Surveillez la lecture sur l’écran EVOM2.

Si la lecture est supérieure ou inférieure à 1 000, tournez l’interrupteur ADJ de l’EVOM2 à l’aide d’une pince jusqu’à ce qu’il affiche une lecture uniforme de 1 000 pour calibrer l’appareil. Maintenant, prenez un encart vide pour la lecture de contrôle expérimental. À l’aide d’une pipette P200, ajoutez 100 microlitres de DPBS sur la face apicale de l’insert vide.

Ensuite, ajoutez 500 microlitres de DPBS sur la face basale avec une pipette P1000. Ensuite, débranchez la résistance de test et connectez l’électrode STX2 à la fente d’entrée de l’EVOM2. Ensuite, nettoyez délicatement l’électrode STX2 avec de l’éthanol à 70 %.

Insérez l’électrode STX2 dans l’insert vide avec DPBS, en gardant la patte d’électrode la plus courte sur la partie apicale et la jambe d’électrode la plus longue sur la partie basale. Maintenant, enregistrez la lecture stable sur l’écran EVOM2. Ensuite, à l’aide d’une pipette P200, ajoutez 100 microlitres de DPBS sur la face apicale de l’insert.

Insérez l’électrode STX2 dans l’insert avec l’épithélium différencié des voies respiratoires pendant 26 jours, comme indiqué précédemment. Ensuite, enregistrez la lecture stable sur l’écran EVOM2. Les valeurs de résistance électrique transépithéliale ont augmenté chez les adultes atteints de BPCO, indiquant une meilleure imperméabilité de la membrane dans la MPOC.