Name: Fabrication et caractérisation de patchs de micro-aiguilles pour le chargement et l’administration d’exosomes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T14:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Découvrez la fabrication de patchs de micro-aiguilles pour le chargement d'exosomes en biotechnologie. Cette méthode améliore la stabilité des exosomes et permet une administration efficace directement sur les zones cibles pour des applications cliniques.

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F.L.Q. apprécie le soutien du Programme de R&D pionnier du Zhejiang (2022C03031), du Programme national de recherche et développement clés de la Chine (2021YFA0910103), de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (22274141, 22074080), de la Fondation des sciences naturelles de la province du Shandong (ZR2022ZD28) et du Taishan Scholar Program de la province du Shandong (tsqn201909106). H.C. tient à souligner le soutien financier de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82202329). Les auteurs reconnaissent l’utilisation d’instruments à la plateforme d’instrumentation partagée de l’Institut de médecine de Hangzhou (HIM) de l’Académie chinoise des sciences.

Cette étude n’a pas besoin d’une autorisation éthique, car la peau de porc utilisée pour les expériences décrites à la section 3 a été achetée sur le marché sous forme d’oreilles de porc comestibles et ne provient pas d’animaux de laboratoire.
1. Isolement des exosomes
<ol><li>Culture cellulaire<ol><li>Cultivez des cellules cancéreuses épithéliales de l’ovaire ID8 de souris dans un milieu de culture DMEM (Modified Eagle Medium) de souris contenant 10 % de sérum fœtal bovin et une solution de pénicilline-streptomycine à 1 % (100×) (voir le tableau des matériaux) dans des boîtes de Pétri d’un diamètre de 15 cm.</li>
		<li>Incuber des cellules ID8 dans un incubateur de CO2 (voir Tableau des matériaux) à 37 °C et 5 % de CO2 jusqu’à ce que la densité cellulaire atteigne 90 %.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolement des exosomes<ol><li>Retirez le milieu de culture des boîtes de Pétri et lavez-le deux fois avec la solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco. Ajouter 20 mL de DMEM sans sérum fœtal bovin (voir le tableau des matières) et une solution de pénicilline-streptomycine (voir le tableau des matériaux). Poursuivre l’incubation à 37 °C et 5% de CO2 pendant 48 h.</li>
		<li>Prélever le surnageant de culture cellulaire dans 20 boîtes de Pétri de 15 cm de diamètre. Centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 °C et recueillir le surnageant pour éliminer les cellules libres.</li>
		<li>Centrifuger à 2000 x g pendant 10 min 4 °C, et recueillir le surnageant pour éliminer les débris cellulaires.</li>
		<li>Connectez le système de filtration sous vide jetable de 0,22 μm (voir tableau des matériaux) à la pompe à vide d’eau de circulation (voir tableau des matériaux). Créez un vide pour permettre au surnageant de passer à travers la membrane de polyéther sulfone de 0,22 μm et d’entrer dans la chambre inférieure du système de filtration, éliminant ainsi efficacement les vésicules ou les impuretés de plus de 0,22 μm du surnageant.<ol><li>Pour connecter la pompe à vide, allumez l’interrupteur de la pompe, puis connectez-la à l’entrée d’air du système de filtration sous vide. Lors de la fermeture, débranchez d’abord la connexion avec la pompe, puis éteignez la pompe à vide. Cette procédure permet d’éviter le reflux de la pompe à vide et la contamination du liquide de culture.</li>
		</ol></li>
		<li>Ajouter 15 mL de surnageant dans le tube intérieur du tube d’ultrafiltration de 100 kDa (voir le tableau des matériaux). Centrifuger à 3500 x g pendant 10 min à 4 °C et retirer le liquide du tube extérieur. REMARQUE : Retenir les particules de plus de 100 kDa sur la membrane du tube intérieur, tandis que les protéines de moins de 100 kDa seront centrifugées dans le tube extérieur avec la solution. Les exosomes étaient supérieurs à 100 kDa et étaient agrégés sur la membrane du tube interne.</li>
		<li>Répétez les étapes ci-dessus jusqu’à ce que le volume total du liquide soit inférieur à 5 ml. Recueillir le liquide de la chambre à air et ajouter 1 mL de DPBS. À l’aide d’une pipette, pipeter à plusieurs reprises dans le tube intérieur, en veillant à la remise en suspension des exosomes attachés dans le DPBS, puis collectez-les.</li>
		<li>Centrifuger à 10000 x g pendant 60 min à 4 °C et transférer le surnageant dans un tube à centrifuger à enclenchement rapide de 6 mL (voir le tableau des matériaux). Scellez le tube avec une thermosoudeuse.</li>
		<li>Centrifugeuse à 100 000 x g pendant 2 h 4 °C à l’aide d’une ultracentrifugeuse (voir tableau des matériaux). Ouvrez le tube de centrifugation à enclenchement rapide, retirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 100 μL de DPBS. C’est la solution de l’exosome. REMARQUE : Pendant le processus de remise en suspension de la pastille, il est nécessaire de pipeter et d’agiter la paroi du tube au moins 200 fois à l’aide d’une pipette.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Fabrication de exo@MN
<ol><li>Préparation du moule maître<ol><li>Construisez un modèle de micro-aiguille avec un réseau de 10 x 10 à l’aide d’un logiciel de CAO, avec des pointes de forme conique avec les paramètres suivants : une hauteur de 1200 μm, un diamètre de base de 400 μm et un pas (distance entre les micro-aiguilles adjacentes) de 900 μm.</li>
		<li>Utilisez de la résine HTL comme matériau et imprimez le moule maître de la micro-aiguille à l’aide d’une imprimante 3D (voir tableau des matériaux).</li>
		<li>Plongez le moule maître dans de l’éthanol absolu pendant 1 h pour enlever toute résine adhérant à la surface.</li>
		<li>Exposez le moule à la lumière ultraviolette pendant 5 minutes pour le durcir.</li>
		<li>Plongez à nouveau le moule dans de l’éthanol absolu pendant 1 h, puis séchez-le à 60 °C dans une étuve de séchage pendant 1 h. Le moule maître est prêt.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation du moule de production<ol><li>Mélangez les composants A et B du polydiméthylsiloxane (PDMS, voir le tableau des matériaux) dans un rapport de 10:1. Mélangez bien et versez le mélange dans un moule maître.</li>
		<li>Placez le moule PDMS sous une pression de 1 psi pendant 15 min pour éliminer les bulles d’air du mélange PDMS.</li>
		<li>Durcir le moule PDMS à 60 °C pendant 2 h puis démouler pour obtenir le moule de production de la micro-aiguille.</li>
		<li>Nettoyez le moule de production avec de l’eau ultra-pure avant utilisation.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation de la solution<ol><li>Quantifiez la teneur en protéines de la solution d’exosomes à l’aide d’un kit de dosage BCA (voir la table des matériaux). Ajouter une quantité appropriée de DPBS pour obtenir une concentration de 10 μg/μL pour la solution d’exosomes.</li>
		<li>Préparez une solution de tréhalose à 200 mg/mL (voir le tableau des matériaux) en utilisant le DPBS comme solvant. Remuer pendant 20 minutes pour assurer une dissolution complète.</li>
		<li>Préparez une solution de 200 mg/mL d’acide hyaluronique (HA, voir tableau des matériaux) en utilisant le DPBS comme solvant. Remuer toute la nuit pour assurer une dissolution complète.</li>
		<li>Préparez une solution de 150 mg/mL de polyvinylpyrrolidone (PVP, voir le tableau des matières) en utilisant de l’éthanol absolu comme solvant. Remuer toute la nuit pour assurer une dissolution complète.</li>
		<li>Mélanger la solution d’exosome (10 μg/μL) et la solution de tréhalose (200 mg/mL) dans un rapport de volume de 1:1. Ajouter ensuite un volume égal de solution d’AH (200 mg/mL). Mélangez soigneusement pour obtenir la solution de pointe.</li>
	</ol></li>
	<li>Fabrication de exo@MN<ol><li>Traitez la surface du moule PDMS à l’aide d’un nettoyeur plasma (voir le tableau des matériaux) pendant 30 s à faible intensité pour améliorer son hydrophilie.</li>
		<li>Ajouter 40 μL de la solution de pointe dans le moule PDMS. Centrifuger à température ambiante (RT) et 3000 x g pendant 3 min pour s’assurer que le liquide remplit la couche d’aiguille du moule.</li>
		<li>Retirer l’excès de liquide dans le moule et sécher à RT dans une étuve de séchage sous vide (voir tableau des matériaux) pendant 1 jour.</li>
		<li>Ajouter 200 μL de solution PVP dans le moule PDMS. Centrifuger 3000 x g pendant 3 min à RT pour s’assurer que le liquide remplit la couche de support du moule.</li>
		<li>Sécher le moule à RT dans une étuve de séchage pendant 1 jour, puis démouler pour obtenir le patch exo@MN. REMARQUE : Conservez le patch exo@MN dans un four de séchage jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Schéma du processus de préparation des exosomes ; centrifugation, séchage sous vide, ajout de polymère pour la stabilisation." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67109/67109fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figure 1 : Processus de fabrication de exo@MN patchs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67109/67109fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
3. Caractérisation des patchs exo@MN
<ol><li>Observation de la morphologie<ol><li>Collez le support du patch sur une surface inclinée à 45° et placez-le sous un microscope stéréoscopique (voir Tableau des matériaux).</li>
		<li>Allumez l’illuminateur et capturez la morphologie du patch à l’aide d’un objectif 4x.</li>
	</ol></li>
	<li>Microscopie électronique à balayage (MEB)<ol><li>Fixez le patch à la platine de l’échantillon à l’aide d’un adhésif conducteur et traitez-le avec un enduiseur automatique fin (voir le tableau des matériaux) pendant 30 s.</li>
		<li>Capturez des images du patch exo@MN à l’aide du MEB (voir Tableau des matériaux) avec une tension d’accélération de 1 kV.</li>
	</ol></li>
	<li>Essais mécaniques<ol><li>Découpez un réseau de 3 x 3 dans le patch et placez-le avec les pointes vers le haut sur la plate-forme rigide d’un tensimètre (voir le tableau des matériaux). Ajustez la hauteur de la sonde pour la rapprocher des pointes des aiguilles sans les toucher.</li>
		<li>Réglez les paramètres pour qu’ils s’arrêtent automatiquement lorsque la pression atteint 20 N. Comprimez les pointes des aiguilles verticalement à une vitesse de 0,5 mm/min et enregistrez le profil de charge en fonction du déplacement.</li>
	</ol></li>
	<li>Dissolution<ol><li>Achetez des oreilles de porc fraîches au marché et coupez-les en morceaux (5 cm x 5 cm x 0,3 cm). Étalez la peau de porc sur une table et utilisez du papier pour sécher l’humidité de surface.</li>
		<li>Préparez quatre patchs secs à micro-aiguilles avec les pointes des aiguilles vers le bas sur la peau du porc, en espaçant légèrement chaque patch. À l’aide du pouce et de l’index, appuyez verticalement sur chaque patch de micro-aiguille. Retirez un timbre toutes les 15 s.</li>
		<li>Placez immédiatement le patch retiré dans une étuve de séchage et séchez-le pendant 5 min. Coupez une colonne de pointes de micro-aiguilles, placez-les horizontalement sous un microscope (voir le tableau des matériaux) et utilisez une lentille d’objectif 4x pour observer la dissolution des pointes.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Caractérisation des exosomes dans exo@MN patch
REMARQUE : Les pointes des micro-aiguilles de exo@MN sont dissoutes dans 100 μL de solution de DPBS pour effectuer la caractérisation suivante sur les exosomes libérés.
<ol><li>Microscopie électronique à transmission (MET)<ol><li>Traitez le treillis de cuivre (voir Tableau des matériaux) avec un traitement hydrophile à l’aide d’un nettoyant ionique (voir Tableau des matériaux) pendant 5 min.</li>
		<li>Versez 10 μL de l’échantillon sur le côté carbone du treillis de cuivre. Laissez reposer pendant 1 min, puis retirez le liquide en l’épongeant avec du papier filtre sur les bords.</li>
		<li>Ajouter 10 μL d’acétate d’uranyle à 3 % (voir le tableau des matériaux) à l’échantillon. Laissez reposer pendant 10 s, puis retirez le liquide en épongeant avec du papier filtre sur les bords.</li>
		<li>Ajouter 10 μL d’acétate d’uranyle à 3 % à l’échantillon. Laissez reposer pendant 1 min, puis retirez le liquide en l’épongeant avec du papier filtre sur les bords et en le faisant sécher à l’air libre à RT.</li>
		<li>Capturer des images des exosomes à l’aide de la MET (voir Tableau des matériaux) avec une tension d’accélération de 80 kV.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse de suivi des nanoparticules (NTA)<ol><li>Diluer la solution d’exosomes avec du DPBS pour obtenir une concentration de particules de 1 x 107 particules/mL. Injecter lentement 1 mL de la solution d’exosome dans la chambre d’échantillonnage du NTA à l’aide d’une seringue de 1 mL (voir le Tableau des matières).</li>
		<li>Réglez le type de procédure d’utilisation standard (SOP) de l’instrument sur EV-488 pour détecter la distribution granulométrique des exosomes.</li>
	</ol></li>
	<li>Western blot (WB)<ol><li>Préparez le tampon de lyse en mélangeant le tampon de lyse du test de radio-immunoprécipitation (RIPA) : fluorure de phénylméthanesulfonyle (voir le tableau des matériaux) dans un rapport de 100:1. Lyser les exosomes sur la glace pendant 20 min, en tourbillonnant toutes les 10 min.</li>
		<li>Centrifuger la solution à 12 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Prélever le surnageant pour mesurer la concentration en protéines.</li>
		<li>Ajoutez 5 tampons de chargement SDS-PAGE (voir tableau des matériaux) au surnageant dans un rapport de volume de 1 : 4 et mélangez bien. Chauffer à 100 °C pendant 10 min pour dénaturer les protéines.</li>
		<li>Ajouter 5 μL d’un marqueur protéique pré-coloré de 180 kDa (voir le tableau des matériaux) et 10 μg d’échantillon dénaturé à un gel préfabriqué à 4 % à 20 % (voir le tableau des matériaux). Faites fonctionner le système d’électrophorèse (voir tableau des matériaux) à 60 V pendant 10 min, puis à 140 V pendant 50 min.</li>
		<li>Transférez les protéines du gel vers une membrane PVDF (voir Tableau des matériaux) pré-activée avec du méthanol. Effectuer le système d’électrophorèse à 290 mA pendant 90 min sur glace.</li>
		<li>Incuber la membrane PVDF dans une solution de lait écrémé à 5 % pendant 1 h. Laver trois fois avec une solution saline tamponnée avec tween (TBST, voir tableau des matériaux) pendant 5 min chacune.</li>
		<li>Découpez les bandes cibles en fonction de la position de la protéine. Incuber les bandes avec l’anticorps anti-souris CD63 et l’anticorps anti-souris Alix (voir le tableau des matériaux) dilués à la concentration appropriée selon les instructions du fabricant, et incuber toute la nuit à 4 °C.</li>
		<li>Lavez les bandes trois fois avec du TBST. Incuber avec des IgG anti-lapin conjuguées à la HRP (voir tableau des matériaux) à RT pendant 1 h. Ensuite, lavez à nouveau trois fois avec du TBST.</li>
		<li>Appliquez un réactif de détection super ECL (voir Tableau des matériaux) pour couvrir la surface des bandes, et exposez et capturez immédiatement les bandes à l’aide d’un imageur sur gel (voir Table des matériaux).</li>
	</ol></li>
	<li>Microscopie confocale à balayage laser (CLSM)<ol><li>Cultivez 5 x 105 DC dans une boîte confocale en utilisant 2 ml de milieu Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) (voir la table des matériaux). Ajouter des exosomes ou du exo@MN et incuber à 37 °C pendant 24 h.</li>
		<li>Ajouter une goutte de Hoechst 33342 dans chaque plat confocal et incuber dans l’obscurité à 37 °C pendant 20 min.</li>
		<li>Effectuez l’imagerie avec un CLSM (voir Tableau des matériaux) à l’aide d’un objectif 60x. Appliquez une goutte d’huile d’immersion (voir tableau des matériaux) sur l’objectif et placez la parabole confocale sur la platine. Ajustez les axes x/y/z pour localiser le plan focal approprié des cellules.</li>
		<li>Lancez l’imagerie avec les canaux DAPI/TRITC/TD, sélectionnez une résolution de 1024 px et réglez le mode rapide sur 1/8 s.</li>
	</ol></li>
	<li>Cytométrie en flux<ol><li>Cultivez les DC dans une plaque à 6 puits, chaque puits contenant 5 x 105 cellules et 2 mL de milieu 1640. Ajouter des volumes égaux de solution de DPBS, d’exosomes, de micro-aiguilles sans exosomes et de exo@MN, respectivement, et incuber à 37 °C pendant 24 h.</li>
		<li>Transférez le fluide de chaque puits dans des tubes centrifuges. Centrifuger à 300 x g pendant 3 min à 4 °C et retirer le surnageant.</li>
		<li>Ajouter 0,5 μL d’anticorps FITC-CD11c, 2,5 μL d’anticorps APC-CD80 et 0,5 μL d’anticorps Pacific Blue I-A/I-E (voir le tableau des matières) à 100 μL de solution de BSA à 5 % (voir le tableau des matériaux). Mélangez bien, remettez les cellules en suspension et incubez sur un shaker dans de la glace et à l’obscurité pendant 20 min.</li>
		<li>Ajouter 1 mL de DPBS et centrifuger à 300 x g pendant 3 min à 4 °C, puis retirer le surnageant. Répétez le lavage deux fois pour éliminer les anticorps non liés, puis procédez à l’analyse des canaux fluorescents correspondants par cytométrie en flux (voir le tableau des matériaux).<ol><li>Tout d’abord, dans le diagramme de dispersion FSC-A/SSC-A, la population cellulaire principale est P1. Dans le nuage de points SSC-A/SSC-H de la population de cellules P1, tracez une barrière d’une région P2 carrée le long de la diagonale pour supprimer les cellules agrégées.</li>
			<li>Effectuez une analyse de fluorescence sur la population de cellules P2 à l’aide des canaux FITC, APC et Pacific Blue. Définissez la condition d’arrêt pour collecter 10 000 cellules dans la porte P2.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>5. Analyse statistique
<ol><li>Exprimer les données quantitatives en moyens ±écarts-types (ET). Évaluez la signification statistique à l’aide de l’analyse du test t à l’aide d’un logiciel d’analyse de données approprié. Considérez des valeurs p inférieures à 0,05 pour indiquer la signification statistique. *p &lt; 0,05, **p &lt; 0,01, ***p &lt; 0,001, ****p &lt; 0,0001.</li>
</ol>

Patchs à micro-aiguilles pour l’administration prolongée d’exosomes dans des applications biomédicales

<ol><li>Barile, L., Vassalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+Therapy+delivery+tools+and+biomarkers+of+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases.</a> Pharmacol Ther. 174, 63-78 (2017).</li>
<li>Kalluri, R., Lebleu, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology%2C+function%2C+and+biomedical+applications+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The biology, function, and biomedical applications of exosomes.</a> Science. 367 (640), 6977(2020).</li>
<li>Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificities+of+secretion+and+uptake+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+cell-to-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication.</a> Nat Cell Biol. 21 (1), 9-17 (2019).</li>
<li>Nair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+nanoparticle+system+integrating+tumor-derived+exosomes+and+poly%28amidoamine%29+dendrimers%3A+Implications+for+an+effective+gene+delivery+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Mater%22%5BJournal%5D)">Hybrid nanoparticle system integrating tumor-derived exosomes and poly(amidoamine) dendrimers: Implications for an effective gene delivery platform.</a> Chem Mater. 35 (8), 3138-3150 (2023).</li>
<li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell-derived+exosomes+elicit+tumor+regression+in+autochthonous+hepatocellular+carcinoma+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell-derived exosomes elicit tumor regression in autochthonous hepatocellular carcinoma mouse models.</a> J Hepatol. 67 (4), 739-748 (2017).</li>
<li>Oskouie, M. N., Aghili Moghaddam, N. S., Butler, A. E., Zamani, P., Sahebkar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+use+of+curcumin-encapsulated+and+curcumin-primed+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic use of curcumin-encapsulated and curcumin-primed exosomes.</a> J Cell Physiol. 234 (6), 8182-8191 (2019).</li>
<li>Yuan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+exosomes+as+natural+nanocarriers+for+protein+delivery+to+inflamed+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Macrophage exosomes as natural nanocarriers for protein delivery to inflamed brain.</a> Biomaterials. 142, 1-12 (2017).</li>
<li>Liao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+The+next+generation+of+endogenous+nanomaterials+for+advanced+drug+delivery+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Exosomes: The next generation of endogenous nanomaterials for advanced drug delivery and therapy.</a> Acta Biomater. 86, 1-14 (2019).</li>
<li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+toxicity+and+immunogenicity+studies+reveal+minimal+effects+in+mice+following+sustained+dosing+of+extracellular+vesicles+derived+from+hek293t+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Comprehensive toxicity and immunogenicity studies reveal minimal effects in mice following sustained dosing of extracellular vesicles derived from hek293t cells.</a> J Extracell Vesicles. 6 (1), 1324730(2017).</li>
<li>Wen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodistribution+of+mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles+in+a+radiation+injury+bone+marrow+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Biodistribution of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in a radiation injury bone marrow murine model.</a> Int J Mol Sci. 20 (21), 5468-5482 (2019).</li>
<li>Cheng, Y., Zeng, Q., Han, Q., Xia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pH%2C+temperature+and+freezing-thawing+on+quantity+changes+and+cellular+uptake+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Effect of pH, temperature and freezing-thawing on quantity changes and cellular uptake of exosomes.</a> Protein Cell. 10 (4), 295-299 (2019).</li>
<li>Jana, B. A., Shivhare, P., Srivastava, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gelatin-PVP+dissolving+microneedle-mediated+therapy+for+controlled+delivery+of+nifedipine+for+rapid+antihypertension+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertens+Res%22%5BJournal%5D)">Gelatin-PVP dissolving microneedle-mediated therapy for controlled delivery of nifedipine for rapid antihypertension treatment.</a> Hypertens Res. 47 (2), 427-434 (2024).</li>
<li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapidly+dissolvable+microneedle+patch+with+tip-accumulated+antigens+for+efficient+transdermal+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol+Biosci%22%5BJournal%5D)">A rapidly dissolvable microneedle patch with tip-accumulated antigens for efficient transdermal vaccination.</a> Macromol Biosci. 23 (12), e2300253(2023).</li>
<li>Huang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+delivery+of+nucleic+acid+molecules+into+skin+by+combined+use+of+microneedle+roller+and+flexible+interdigitated+electroporation+array%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Efficient delivery of nucleic acid molecules into skin by combined use of microneedle roller and flexible interdigitated electroporation array.</a> Theranostics. 8 (9), 2361-2376 (2018).</li>
<li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+immune+suppressive+microenvironment+in+tumor+draining+lymph+nodes+to+enhance+anti-pd1+immunotherapy+via+nanovaccine+complexed+microneedle%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Res%22%5BJournal%5D)">Reverse immune suppressive microenvironment in tumor draining lymph nodes to enhance anti-pd1 immunotherapy via nanovaccine complexed microneedle.</a> Nano Res. 13 (6), 1509-1518 (2020).</li>
<li>Kim, Y. C., Park, J. H., Prausnitz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microneedles+for+drug+and+vaccine+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Microneedles for drug and vaccine delivery.</a> Adv Drug Deliv Rev. 64 (14), 1547-1568 (2012).</li>
<li>Bui, V. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissolving+microneedles+for+long-term+storage+and+transdermal+delivery+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Dissolving microneedles for long-term storage and transdermal delivery of extracellular vesicles.</a> Biomaterials. 287, 121644(2022).</li>
<li>Nir, Y., Potasman, I., Sabo, E., Paz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fear+of+injections+in+young+adults%3A+Prevalence+and+associations%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Fear of injections in young adults: Prevalence and associations.</a> Am J Trop Med Hyg. 68 (3), 341-344 (2003).</li>
<li>Zhang, Y., Jiang, G., Yu, W., Liu, D., Xu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microneedles+fabricated+from+alginate+and+maltose+for+transdermal+delivery+of+insulin+on+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Sci+Eng+C+Mater+Biol+Appl%22%5BJournal%5D)">Microneedles fabricated from alginate and maltose for transdermal delivery of insulin on diabetic rats.</a> Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 85, 18-26 (2018).</li>
<li>Roy, G., Garg, P., Venuganti, V. V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microneedle+scleral+patch+for+minimally+invasive+delivery+of+triamcinolone+to+the+posterior+segment+of+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pharm%22%5BJournal%5D)">Microneedle scleral patch for minimally invasive delivery of triamcinolone to the posterior segment of eye.</a> Int J Pharm. 612, 121305(2022).</li>
<li>Creighton, R. L., Woodrow, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microneedle-mediated+vaccine+delivery+to+the+oral+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthc+Mater%22%5BJournal%5D)">Microneedle-mediated vaccine delivery to the oral mucosa.</a> Adv Healthc Mater. 8 (4), 1801180(2019).</li>
<li>Hu, S., Zhu, D., Li, Z., Cheng, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detachable+microneedle+patches+deliver+mesenchymal+stromal+cell+factor-loaded+nanoparticles+for+cardiac+repair%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Detachable microneedle patches deliver mesenchymal stromal cell factor-loaded nanoparticles for cardiac repair.</a> ACS Nano. 16 (10), 15935-15945 (2022).</li>
<li>Yang, W., Zheng, H., Lv, W., Zhu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+and+prospect+of+immunotherapy+for+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Colorectal+Dis%22%5BJournal%5D)">Current status and prospect of immunotherapy for colorectal cancer.</a> Int J Colorectal Dis. 38 (1), 266-276 (2023).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+and+technologies+for+exosome+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Small+Methods%22%5BJournal%5D)">Methods and technologies for exosome isolation and characterization.</a> Small Methods. 2 (9), 1800021(2018).</li>
<li>Bosch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trehalose+prevents+aggregation+of+exosomes+and+cryodamage%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage.</a> Sci Rep. 6, 36162(2016).</li>
<li>Bhattacharyya, M., Jariyal, H., Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronic+acid%3A+More+than+a+carrier%2C+having+an+overpowering+extracellular+and+intracellular+impact+on+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr+Polym%22%5BJournal%5D)">Hyaluronic acid: More than a carrier, having an overpowering extracellular and intracellular impact on cancer.</a> Carbohydr Polym. 317, 121081(2023).</li>
<li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryomicroneedles+for+transdermal+cell+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Cryomicroneedles for transdermal cell delivery.</a> Nat Biomed Eng. 5 (9), 1008-1018 (2021).</li>
</ol>

H. C., F.L.Q et S.J.M sont les inventeurs d’une demande de brevet qui a été déposée sur la base des données de ce manuscrit. H.C. est le fondateur scientifique de Medcraft Biotech. Inc.

Actuellement, les principales méthodes d’isolement des exosomes comprennent l’ultracentrifugation, la centrifugation à gradient de densité, l’ultrafiltration, la précipitation, les billes magnétiques d’immunoaffinité et la microfluidique24. En raison de la capacité de charge limitée des micro-aiguilles causée par leur petit espace de pointe d’aiguille, il est nécessaire d’augmenter la concentration d’exosomes pour charger davantage. Par conséquent, nous avons choisi l’ultrafiltration pour concentrer le surnageant de culture cellulaire, puis nous avons utilisé l’ultracentrifugation pour isoler les exosomes. La concentration d’exosomes a été augmentée par une petite quantité de liquide en suspension afin que les micro-aiguilles puissent être chargées avec des dizaines à des centaines de microgrammes d’exosomes. Cependant, cette méthode entraîne une présence importante de protéines dans la solution isolée de l’exosome. De plus, une perte substantielle d’exosomes se produit pendant le processus de centrifugation. De nos jours, l’une des limites de l’application thérapeutique des exosomes est le manque de méthodes efficaces pour isoler les exosomes de haute pureté et en grande quantité. Alors que le potentiel clinique des exosomes est de plus en plus exploré, il est nécessaire de développer des techniques plus avancées à l’avenir pour relever les défis associés à leur extraction.
La technologie clé de cette étude est la conception de micro-aiguilles à base d’exosomes. Afin de minimiser le gaspillage d’exosomes et d’obtenir des effets thérapeutiques plus forts, une méthode de moulage en deux étapes a été adoptée pour fabriquer exo@MN patchs. Le tréhalose a déjà été signalé comme un matériau approprié pour la conservation lyophilisée des exosomes25, tandis que l’AH présente une excellente biocompatibilité, hydrophilie et fonctions dans l’inhibition de l’inflammation et la promotion de la réparation cutanée26. La fabrication d’embouts d’aiguilles chargés d’exosomes à l’aide de ces deux matériaux aide à maintenir l’activité biologique des exosomes, permettant leur dissolution et leur libération rapides dans la peau. De plus, cette approche minimise le risque d’infection et contribue à la récupération rapide de la peau. Par centrifugation et séchage sous vide, les exosomes ont été concentrés à l’extrémité des micro-aiguilles. Compte tenu de l’incompatibilité de l’éthanol et du tréhalose, le PVP dissous dans de l’éthanol absolu a été choisi comme matériau de support. Cette méthode de fabrication en couches a efficacement amélioré l’efficacité de l’administration des exosomes.
La faible stabilité des exosomes in vitro, qu’ils soient stockés à 4 °C, 37 °C ou -80 °C, peut entraîner des modifications de la structure ou une dégradation des exosomes11. Afin de résoudre ce problème, plusieurs études ont exploré les méthodes de stockage des exosomes, telles que la lyophilisation. La technologie des micro-aiguilles offre une autre stratégie novatrice. En séchant à RT, la technologie des micro-aiguilles peut améliorer la stabilité des exosomes et peut être directement utilisée pour l’administration d’exosomes sans autres traitements. De plus, le processus d’extraction des exosomes est complexe et sujet à la dégradation, ce qui rend les applications à grande échelle difficiles. Le stockage des exosomes extraits à l’aide de la technologie des micro-aiguilles ne simplifie pas les étapes d’extraction, mais réduit le nombre d’extractions nécessaires. Une seule extraction peut produire une grande quantité de patchs de exo@MN, qui peuvent être stockés pendant une période prolongée. L’utilisation de micro-aiguilles d’exosomes du même lot pour chaque traitement minimise l’impact potentiel des variations entre les différents lots sur les résultats thérapeutiques, améliorant ainsi la répétabilité et la fiabilité de la nanoplateforme d’exosomes27. Cela offre plus de possibilités pour l’application clinique des exosomes.
Dans les recherches futures, il vaut la peine d’explorer des méthodes qui permettent un contrôle précis de la charge utile et minimisent les variations de médicament entre les pointes d’aiguille. Cela peut être accompli par l’optimisation des processus, la mise en œuvre de mesures de contrôle de la qualité et l’utilisation de techniques avancées. La prise en compte de ces aspects contribuera de manière significative à la mise au point de systèmes d’administration de médicaments fiables et cohérents.

Les exosomes, qui sont de petites vésicules libérées par les cellules dans la matrice extracellulaire, ont été proposés comme biothérapies potentielles et vecteurs d’administration de médicaments pour le traitement de plusieurs maladies et cancers1. Au cours de leur processus de biogenèse, les exosomes encapsulent diverses molécules biologiquement actives à l’intérieur des cellules, y compris des protéines fonctionnelles et des acides nucléiques2. Par conséquent, lorsqu’ils sont absorbés par les cellules réceptrices pendant le processus de transport, les exosomes ont la capacité de moduler l’expression des gènes et les fonctions cellulaires dans les cellules cibles3. En tant que sorte de messager d’information naturel, les exosomes ont été pleinement exploités dans la régénération des tissus, la régulation immunitaire et en tant que vecteur de livraison4. Grâce à des techniques d’ingénierie, des ligands spécifiques peuvent être enrichis à la surface des exosomes, ce qui permet d’induction ou d’inhibition d’événements de signalisation dans les cellules réceptrices ou de cibler des types cellulaires spécifiques5. Les agents chimiothérapeutiques peuvent également être chargés dans les exosomes pour le traitement du cancer6. De plus, les exosomes ont la capacité de traverser la barrière hémato-encéphalique pour l’administration de cargaisons thérapeutiques, ce qui les rend très prometteurs pour le traitement des troubles cérébraux7. Par rapport aux liposomes, les exosomes présentent une absorption cellulaire accrue et une biocompatibilité améliorée8. Ils sont capables de pénétrer efficacement dans d’autres cellules tout en faisant preuve d’une meilleure tolérance et d’une toxicité plus faible9. Cependant, l’injection traditionnelle d’exosomes en bolus est sujette à la séquestration et à l’élimination rapide par le foie, les reins et la rate dans la circulation sanguine10. De plus, les exosomes ont une faible stabilité in vitro et sont sensibles aux conditions de stockage, ce qui limite leurs applications cliniques11.
Les micro-aiguilles, un ensemble de pointes d’aiguilles de taille micrométrique, ont la capacité de pénétrer les barrières physiologiques pour l’administration de petites molécules de médicaments12, de protéines13, d’acides nucléiques14 et de nanomédicaments15. Les micro-aiguilles sont conçues avec précision pour cibler les lésions à la surface de la peau, et leurs pointes dispersées assurent une distribution uniforme du médicament sur le site ciblé, amplifiant ainsi leur impact thérapeutique16. La conception et la composition des matériaux des micro-aiguilles facilitent le stockage à sec de substances bioactives telles que les protéines et les acides nucléiques, améliorant ainsi leur stabilité17. Les méthodes d’injection traditionnelles ont une durée d’action relativement courte et peuvent provoquer des douleurs, induisant la peur chez les patients18. La longueur de la micro-aiguille, de taille micrométrique, minimise les traumatismes tissulaires et empêche la stimulation nerveuse, éliminant ainsi la douleur et améliorant l’observance du patient19. De plus, la nature conviviale des micro-aiguilles permet aux patients de s’auto-administrer le traitement sans avoir besoin de personnel spécialisé16. En plus de la peau, les micro-aiguilles peuvent également être utilisées dans des tissus tels que les yeux20, la muqueuse buccale21, le cœur22 et les vaisseaux sanguins23. L’application de micro-aiguilles pour l’administration clinique d’exosomes fournit une stratégie prometteuse et prospective.
Par conséquent, nous introduisons un patch de micro-aiguille (exo@MN) chargé d’exosomes et divulguons sa méthode de fabrication. Les patchs à micro-aiguilles ont été fabriqués à l’aide d’une méthode de coulée en deux étapes, ainsi que d’une centrifugation et d’un séchage sous vide, ce qui favorise l’agrégation des exosomes à l’extrémité des micro-aiguilles, améliorant ainsi l’efficacité de l’administration. Les pointes des aiguilles et le support ont été fabriqués à l’aide de matériaux qui présentent une excellente biocompatibilité et une excellente solubilité dans l’eau. Le tréhalose et l’acide hyaluronique (HA) ont été incorporés comme matériaux de pointe pour protéger les exosomes, et la polyvinylpyrrolidone (PVP) dissoute dans de l’éthanol absolu a été choisie comme matériau de support. La morphologie du patch de micro-aiguilles a été caractérisée à l’aide de la microscopie et du microscope électronique à balayage (MEB). Les essais mécaniques des micro-aiguilles ont été évalués à l’aide d’un tensimètre pour confirmer leur capacité à pénétrer la peau, et le taux de libération sur la peau de porc a été évalué à 60 s. De plus, la morphologie, la taille et la teneur en protéines des exosomes frais et des exosomes en exo@MN ont été caractérisées à l’aide d’un microscope électronique à transmission (MET), d’une analyse de suivi des nanoparticules (NTA) et d’un western blot (WB). L’internalisation des exosomes par les cellules dendritiques (DC) a été caractérisée à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser (CLSM), et la maturation des DC a été évaluée par cytométrie en flux. La caractérisation morphologique et les fonctions biologiques des deux types d’exosomes sont essentiellement cohérentes.

<table><tbody><tr><td>100x solutions de pénicilline-streptomycine</td><td>Jrunbio Scientific</td><td>MA0110</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Marqueur protéique pré-coloré 180 kDa</td><td>Thermo</td><td>26616</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>3 % Acétate d’uranyle</td><td>Henan Ruixin Fournitures expérimentales</td><td>GZ02625</td><td>Caractérisation morphologique des exosomes</td></tr><tr><td>Imprimante 3D</td><td>Technologie</td><td>BMF nanoArch S130</td><td>Moule Préparation</td></tr><tr><td>4 %&ndash ; 20 % gel préfabriqué</td><td>Genscript</td><td>ExpressPlus PAGE GEL</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>5& fois ; Tampon de chargement SDS-PAGE</td><td>Titan</td><td>04048254</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Anticorps anti-souris Alix</td><td>Biolegend</td><td>12422-1-AP</td> Western <td>blot</td></tr><tr><td>Anticorps anti-souris CD63</td><td>Biolegend</td><td>ab217345</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>APC anti-souris CD80 anticorps</td><td>Biolegend</td><td>104713</td><td></td></tr><tr><td>Antibody Auto fine</td><td>coater ZIZHU</td><td>JBA5-100</td><td>Caractérisation morphologique d’un kit de dosage BCA à micro-aiguilles</td></tr><tr><td></td><td>Beyotime</td><td>P0012</td><td>Dosage de la concentration en protéines</td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Thermo Fisher</td><td>Muitifuge X1R pro</td><td>Centrifugeuse</td></tr><tr><td>à eau circulante Pompe à vide d’eau circulante</td><td>Yuhua Instrument</td><td>SHZ-D(III)</td><td>incubateur</td></tr> de <tr><td>CO2</td><td>Eppendorf</td><td>CellXpert C170</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Microscope confocal à balayage laser</td><td>Nikon</td><td>A1HD25</td><td>Imagerie par fluorescence</td></tr><tr><td>Maille de cuivre</td><td>Beijing Zhongjingkeyi Technology&nbsp ;</td><td>JF-ZJKY/300</td><td>Caractérisation morphologique des exosomes</td></tr><tr><td>D-(+)-tréhalose dihydraté</td><td>Aladdin</td><td>5138-23-4</td><td>Fabrication de micro-aiguilles&nbsp ;</td></tr><tr><td>Dulbecco' Eagle modifié' s milieu</td><td>Meilunbio</td><td>MA0212</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Dulbecco' s solution saline tamponnée au phosphate</td><td>Meilunbio</td><td>MA0010</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Système d’électrophorèse</td><td>Bio-rad</td><td>PowerPac-basic</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Jrunbio Scientific</td><td>JR100</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>FITC anti-souris Anticorps CD11c</td><td>Biolegend</td><td>117305</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps Cytométrie en flux</td><td>BD</td><td>LSR Fortessa</td><td>Détection de fluorescence</td></tr><tr><td>Imageur gel</td><td>Cytiva</td><td>Amersham ImageQuant 800</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>HRP conjugué anti-lapin IgG</td><td>CST</td><td>7074S</td> Western <td>blot</td></tr><tr><td>Résine HTL</td><td>technologie BMF Préparation</td><td></td> de <td>moule</td></tr><tr><td>Acide hyaluronique (MW = 300 kDa)</td><td>Bloomage Biotechnology</td><td>9004-61-9</td><td>Fabrication de micro-aiguilles&nbsp ;</td></tr><tr><td>Huile d’immersion</td><td>Nikon</td><td>MXA22168</td><td>Imagerie par fluorescence</td></tr><tr><td>Nettoyeur d’ions</td><td>JEOL</td><td>EC-52000IC</td><td>Caractérisation morphologique des exosomes</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>CKX53</td><td>Observer le processus de dissolution de la pointe d’une micro-aiguille</td></tr><tr><td>Cellule cancéreuse épithéliale de l’ovaire de souris ID8</td><td>MeisenCTCC</td><td>&nbsp ; CC90105</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Analyse de suivi des nanoparticules</td><td>Particle Metrix</td><td>ZetaView</td><td>Analyse de la taille des exosomes</td></tr> Pacific <tr><td>Blue Anticorps anti-souris I-A/I-E Biolegend</td><td></td><td>107619</td><td>Anticorps</td></tr><tr><td>Fluorure de phénylméthanesulfonyle</td><td>Beyotime</td><td>ST507</td><td>Inhibiteurs de protéase</td></tr><tr><td>Nettoyeur de plasma</td><td>Hefei Kejing Technologie des matériaux</td><td>PDC-36G</td><td>Fabrication de micro-aiguilles&nbsp ;</td></tr><tr><td>Polydiméthylsiloxane</td><td>Dow Corning</td><td>9016-00-6</td><td>Préparation de moules</td></tr><tr><td>Polyvinylpyrrolidone (MW = 40 kDa)</td><td>Aladdin</td><td>9003-39-8</td><td>Fabrication de micro-aiguilles&nbsp ;</td></tr><tr><td>Prisme&nbsp ;</td><td>GraphPad</td><td>Version 9</td><td>Analyse statistique</td></tr><tr><td>Membrane PVDF</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Centrifugeuse Quick-snap</td><td>Beckman</td><td>344619</td><td>Extraction d’exosomes</td></tr><tr><td>Tampon de lyse RIPA</td><td>Applygen</td><td>C1053</td><td>Membrane de lyse</td></tr><tr><td>Roswell park memorial institute 1640</td><td>Meilunbio</td><td>MA0548</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Microscope électronique à balayage</td><td>JEOL</td><td>JSM-IT800</td><td>Caractérisation morphologique de micro-aiguille</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td>Caractérisation de la morphologie</td></tr><tr><td>Réactif de détection Super ECL</td><td>Applygen</td><td>P1030</td> Western <td>blot</td></tr><tr><td>Tenducteur</td><td>Instron</td><td>68SC-05</td><td>Essais mécaniques</td></tr><tr><td>Microscope électronique à transmission</td><td>JEOL</td><td>JEM-2100plus</td><td>Caractérisation morphologique d’exosomes</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée Tris</td><td>Sangon Biotech</td><td>JF-A500027-0004</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Beyotime</td><td>ST825</td> Western <td>blot</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman</td><td>Optima XPN-100</td><td>Extraction d’exosomes</td></tr><tr><td>Tube d’ultrafiltration</td><td>Millipore</td><td>UFC910096</td><td>Concentration d’exosomes</td></tr><tr><td>Four de séchage sous vide</td><td>Shanghai Yiheng Technology</td><td>DZF-6024</td><td>Fabrication de micro-aiguilles Système de filtration sous</td></tr><tr><td>vide</td><td>Biosharp</td><td>BS-500-XT</td><td>Filtration</td></tr></tbody></table>

fabrication et caractérisation de patchs de micro-aiguilles pour le chargement et l’administration d’exosomes

Fabrication and Characterization of Microneedle Patches for Loading and Delivery of Exosomes

Les exosomes, en tant que biothérapies émergentes de « nouvelle génération » et vecteurs d’administration de médicaments, recèlent un immense potentiel dans divers domaines biomédicaux, allant de l’administration de médicaments et de la médecine régénérative au diagnostic des maladies et à l’immunothérapie tumorale. Cependant, la clairance rapide par injection traditionnelle en bolus et la faible stabilité des exosomes limitent leur application clinique. Les micro-aiguilles servent de solution qui prolonge le temps de séjour des exosomes sur le site d’administration, maintenant ainsi la concentration du médicament et facilitant les effets thérapeutiques durables. De plus, les micro-aiguilles possèdent également la capacité de maintenir la stabilité des substances bioactives. Par conséquent, nous introduisons un patch de micro-aiguilles pour le chargement et l’administration d’exosomes et partageons les méthodes, y compris l’isolement des exosomes, la fabrication et la caractérisation des patchs de micro-aiguilles chargés d’exosomes. Les patchs à micro-aiguilles ont été fabriqués en utilisant du tréhalose et de l’acide hyaluronique comme matériaux de pointe et de la polyvinylpyrrolidone comme matériau de support par une méthode de moulage en deux étapes. Les micro-aiguilles ont démontré une résistance mécanique robuste, avec des pointes capables de résister à 2 N. La peau de porc a été utilisée pour simuler la peau humaine, et les pointes des micro-aiguilles ont complètement fondu dans les 60 secondes suivant la perforation de la peau. Les exosomes libérés par les micro-aiguilles présentaient une morphologie, une taille de particules, des protéines marqueurs et des fonctions biologiques comparables à celles des exosomes frais, permettant l’absorption des cellules dendritiques et favorisant leur maturation.

Ici, nous présentons un protocole pour l’isolement des exosomes, la fabrication et la caractérisation de exo@MN patch. La figure 1 illustre l’organigramme du processus de fabrication de exo@MN patch. Les exosomes ont été mélangés avec du tréhalose et de l’HA, puis le mélange a été ajouté au moule à micro-aiguilles et centrifugé. Ce processus a facilité l’agrégation des exosomes à l’extrémité des aiguilles, favorisant une libération rapide. Après séchage, une solution PVP a été ajoutée et centrifugée pour remplir complètement le moule. Une fois le séchage terminé, le moule a été retiré pour obtenir les exo@MN patchs. La morphologie des micro-aiguilles a été caractérisée à l’aide de la microscopie et du MEB, comme le montre la figure 2. Les pointes de la exo@MN patch présentaient une forme conique disposée en un réseau de 10 x 10 avec des pointes d’aiguille pointues et intactes. La pointe de la micro-aiguille peut résister à une force de 2 N, ce qui lui permet de pénétrer à travers la barrière cutanée. De plus, la peau de porc a été utilisée comme substitut de la peau humaine pour simuler l’application de patchs exo@MN. Les patchs ont été pressés sur la peau du porc pour observer le temps de libération, les pointes des micro-aiguilles fondant complètement en 60 s. Les exo@MN plaques ont été dissoutes dans le DPBS et caractérisées, comme le montre la figure 3. Les images TEM ont capturé des vésicules avec des structures typiques en forme de coupe, compatibles avec la morphologie des exosomes. La distribution granulométrique de la solution exo@MN par NTA a révélé que les particules étaient principalement concentrées dans la plage de 50 à 250 nm. Cependant, il y avait aussi des particules plus grosses présentes, ce qui peut être attribué aux propriétés adhésives du matériau HA, provoquant l’agrégation d’exosomes. L’analyse WB des protéines CD63/Alix dans la solution exo@MN a démontré que exo@MN était capable de retenir partiellement les protéines des exosomes. La fonctionnalité biologique des exosomes libérés par le exo@MN a été validée dans la figure 4, en se concentrant sur l’absorption des exosomes par les cellules et l’activation des cellules dendritiques par rapport aux exosomes frais. Les images CLSM ont confirmé l’absorption efficace des exosomes frais et des exosomes dans le exo@MN par les DC. Des images représentatives et des statistiques proportionnelles de la cytométrie en flux démontrent que les exosomes dans exo@MN possèdent des fonctions biologiques qui favorisent l’activation des DC similaires aux exosomes frais.
<img alt="Schéma de fabrication de micro-aiguilles, image MEB, graphique pression-déplacement, séquence de test de pénétration." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67109/67109fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figure 2 : Caractérisation de exo@MN plaques. (A) Images stéréoscopiques de exo@MN plaques. Barre d’échelle = 400 μm. (B) Image MEB de exo@MN patchs. Barre d’échelle = 200 μm. (C) Les profils de charge en fonction du déplacement de exo@MN patch. (D) Images microscopiques de exo@MN plaques insérées dans la peau du porc à différents moments. Barre d’échelle = 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67109/67109fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Microscopie électronique des exosomes ; graphique de distribution de taille ; Western Blot de marqueurs protéiques." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67109/67109fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figure 3 : Caractérisation des exosomes frais et des exosomes en exo@MN. (A) Morphologie des exosomes par MET. Barre d’échelle = 100 nm. (B) Distribution granulométrique des exosomes par NTA. (C) CD63 et Alix des exosomes par WB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67109/67109fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Résultats de la microscopie des exosomes et de la cytométrie en flux ; coloration cellulaire, analyse en flux, expression de CD80 MHCII." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67109/67109fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figure 4 : Essais biologiques d’exosomes frais et d’exosomes en exo@MN. (A) Images CLSM d’exosomes absorbés par les DC. Barre d’échelle = 10 μm. (B) Graphiques représentatifs de l’activation des DC par cytométrie en flux. (C) Quantification du pourcentage de CD CD11c+CD80+MHCII+. Les données sont présentées en moyenne ± ET (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67109/67109fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Les exosomes possèdent un potentiel clinique important, mais leur application pratique est limitée en raison de la facilité d’élimination in vivo et de la faible stabilité. Les micro-aiguilles présentent une solution en permettant une administration localisée en perforant les barrières physiologiques et la conservation à l’état sec, remédiant ainsi aux limites de l’administration d’exosomes et élargissant leur utilité clinique.

Fabrication et caractérisation de patchs de micro-aiguilles pour le chargement et l’administration d’exosomes

Exosomes, as emerging &#34;next-generation&#34; biotherapeutics and drug delivery vectors, hold immense potential in diverse biomedical fields, ranging ...

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Le présent travail vise à servir de guide pratique permettant aux chercheurs de préparer leurs propres dispositifs DMAP en utilisant la méthode de moulage par solvant, également appelée micromoulage, et d’effectuer une caractérisation de base.

Patchs à microaiguilles dissolvables fabriqués par la technique de moulage au solvant et caractérisation essentielle des dispositifs biomédicaux à microaiguilles

Cet article décrit la construction d'un multiplex microaiguilles capteur à base de. Le dispositif est en cours d'élaboration pour l'échantillonnage in situ et d'analyse électrochimique des analytes multiples, d'une manière rapide et sélective. Nous envisageons la médecine clinique et la recherche biomédicale utilise pour ces capteurs à base de micro-aiguille.

MICRO-creux à base de capteur pour multiplexée transdermique Sensing électrochimique

Nous avons conçu un nouveau bioréacteur de chargement mécanique qui peut appliquer une contrainte mécanique uniaxiale ou biaxiale à une biocomposites du cartilage avant la transplantation dans un défaut de cartilage articulaire.

Conception d&#39;un bioréacteur de chargement mécanique biaxial pour l&#39;ingénierie tissulaire

PH biocompatibles adaptés nanocapteurs sol-gel peuvent être incorporés dans le poly (acide lactique-co-glycolique) (PLGA) échafaudages électrofilées. Les échafaudages d'auto-déclaration produits peuvent être utilisés pour la surveillance in situ des conditions micro-environnementales dans tout la culture de cellules sur l'échafaud. Cela est bénéfique que la construction cellulaire 3D peut être contrôlé en temps réel sans perturber l'expérience.

Les échafaudages auto-déclaration pour les 3-Dimensional Culture cellulaire

Deux fluides adjacents passant par un canal microfluidique rainuré peuvent être dirigés pour former une gaine autour d’un noyau de prépolymère; déterminant ainsi à la fois la forme et la section transversale. La polymérisation photoinitiée, telle que la chimie du clic thiol, est bien adaptée à la solidification rapide du fluide central en une microfibre avec une taille et une forme prédéterminées.

Fabrication microfluidique de fibres polymères et biohybrides avec une taille et une forme redessinées

Cet article présente des méthodes de fabrication et de caractérisation d’un système électronique conforme, semblable à la peau, et des protocoles pour une utilisation dans des applications cliniques, en particulier sur la gestion des plaies cutanées.

Fabrication et caractérisation d&#39;un système électronique conforme de la peau comme pour la gestion quantitative, cutanée plaies

La matrice extracellulaire tissu-spécifique (ECM) est un médiateur clé de la fonction cellulaire. Cet article décrit les méthodes de synthèse pures mousses dérivées ECM et microporteurs qui sont stables dans la culture sans la nécessité d' une réticulation chimique pour des applications en 3D avancées in vitro des modèles de culture cellulaire ou bioscaffolds pro-régénération.

Fabrication de Mousses et microsupports dérivés Matrice extracellulaires culture cellulaire spécifique de tissu et plates-formes de livraison

Découvrez la fabrication de patchs de micro-aiguilles pour le chargement d'exosomes en biotechnologie. Cette méthode améliore la stabilité des exosomes et permet une administration efficace directement sur les zones cibles pour des applications cliniques.

Fabrication et caractérisation de patchs de micro-aiguilles pour le chargement et l’administration d’exosomes

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