Name: Détection de cassures d’ADN dans des cellules humaines en division par dosage de comète neutre (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-23T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: Découvrez le dosage de comète neutre pour évaluer les cassures d'ADN lors de la réplication dans des cellules humaines. Cette méthode permet d'étudier le remodelage de la chromatine et la stabilité du génome.

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Nous remercions les membres du laboratoire Dungrawala pour leurs contributions et leurs commentaires. Ce travail a été financé par une subvention des NIH R35GM137800 à HD.

Ce protocole (Figure 1) utilise principalement des lignées cellulaires cancéreuses U2OS adhérentes, mais est adaptable à une grande variété de cellules adhérentes et en suspension cultivées en culture tissulaire. Les solutions et les tampons utilisés dans cette étude sont détaillés dans le tableau 1. Les réactifs et l’équipement utilisés sont répertoriés dans la table des matériaux.
1. Préparation des matériaux
<ol><li>Avant le jour de l’expérience, placez la bouteille fournie avec de l’agarose à bas point de fusion (1% d’agarose à bas point de fusion dans PBS) dans un bain d’eau chaude pendant 5 à 10 minutes pour vous assurer que l’agarose a complètement fondu. REMARQUE : Ne chauffez pas le biberon au micro-ondes.</li>
	<li>Une fois fondu, aliquote rapidement 100 μL de l’agarose dans des tubes à centrifuger de 1,5 mL au besoin et stocker les tubes à 4 °C. L’agarose solidifiée peut être conservée à 4 °C jusqu’à 1 an.</li>
	<li>Le jour de l’expérience, retirer le nombre requis de tubes à centrifuger de la zone de stockage à 4 °C. Faites fondre l’agarose en plaçant les tubes dans un bloc de chaleur ou un bain-marie à 42 °C. REMARQUE : Placez les tubes à 42 °C avant de récolter les cellules pour vous assurer que l’agarose est complètement fondue pour la remise en suspension (étape 3.7).</li>
	<li>Préparez le tampon de lyse frais et le tampon TAE le jour de l’expérience et conservez-les à température ambiante et à 4 °C, respectivement, jusqu’au moment de l’utiliser. De plus, aliquote 1x PBS dans un tube conique de 15 mL et placez-le au réfrigérateur pour l’utiliser dans l’étape de remise en suspension (étape 3.5).</li>
	<li>Marquez les identifications d’échantillons sur l’extrémité givrée des lames de comète à 2 puits et conservez-les à température ambiante jusqu’au moment de les utiliser.</li>
</ol>2. Préparation des échantillons
<ol><li>Avant le jour de l’expérience, ensemencez les cellules dans une boîte à 6 puits et cultivez-les pendant une nuit à 37 °C avec 5 % de CO2. Pour les cellules U2OS, environ 2 à 3 x 105 cellules ont été ensemencées pour chaque échantillon. REMARQUE : Il peut être nécessaire d’ajuster les numéros de cellule en fonction du type de cellule utilisé pour les analyses.</li>
	<li>Le jour de l’expérience, traitez les cellules dans les conditions prévues par le plan expérimental. En tant que contrôle positif pour démontrer l’induction de cassures dépendante de la réplication, traitez les cellules avec 1 μM CPT pendant 1 h. CPT est un inhibiteur de la topoisomérase-1 qui induit des cassures double brin de manière dépendante de la réplication14.</li>
</ol>3. Mise en suspension et lyse cellulaires
<ol><li>Aspirez le milieu de culture cellulaire et rincez-le deux fois avec 1x PBS.</li>
	<li>Ajouter 300 μL de trypsine dans chaque puits. Incuber la boîte dans un incubateur de culture tissulaire pendant 2-3 min. REMARQUE : Une incubation prolongée dans la trypsine peut générer des résultats parasites lors des analyses de comètes.</li>
	<li>Ajouter 700 μL de milieu de culture cellulaire dans chaque puits. Remettre doucement les échantillons en suspension et transférer les échantillons dans des tubes à centrifuger de 1,5 mL. REMARQUE : Il est recommandé de compter les cellules à cette étape pour obtenir la densité de cellules appropriée à l’étape 3.6 afin de réduire la fréquence des queues qui se chevauchent pendant l’analyse.</li>
	<li>Centrifuger la suspension cellulaire à 2400 x g pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Aspirez le milieu et mettez les cellules en suspension dans 1 mL de PBS froid.</li>
	<li>Répétez deux fois les étapes 3.4 et 3.5 et mettez les cellules en suspension dans du PBS froid 1x PBS à une densité cellulaire de 2 x 105 cellules par ml. REMARQUE : Il est recommandé d’évaluer la viabilité des cellules à cette étape pour s’assurer qu’un nombre adéquat de cellules viables sont présentes. Une viabilité d’au moins 90 % est recommandée.</li>
	<li>Remettre en suspension 10 μL de suspension cellulaire dans 100 μL d’aliquote d’agarose fondue et, à l’aide de la même pointe de pipette, mélanger doucement et étaler le mélange uniformément dans un puits de la lame. Répétez cette étape pour tous les échantillons si nécessaire. REMARQUE : Évitez de retirer toutes les aliquotes du bain-marie à 42 °C en une seule fois pour éviter que l’agarose ne se solidifie. Cette étape doit de préférence être effectuée au bain-marie, et chaque échantillon est remis en suspension et étalé de manière échelonnée. Évitez d’introduire des bulles lors de l’étalement de l’agarose sur la lame car les poches d’air affecteront la migration des queues de comète lors de l’électrophorèse (étape 4.5) et introduiront des fissures dans l’étape de séchage (étape 5.3)</li>
	<li>Conservez les lames à 4 °C dans l’obscurité pendant 15 à 20 minutes pour vous assurer que l’agarose s’est complètement solidifiée (figure 2A).</li>
	<li>Placez les lames dans des bocaux Coplin et plongez les lames dans un tampon de lyse pendant 1 h à température ambiante.</li>
	<li>Rincez une fois les lames avec un tampon TAE froid et plongez les lames dans un tampon TAE froid pendant 30 min à 4 °C.</li>
</ol>4. Électrophorèse
<ol><li>Installez la chambre électrophorétique sur une surface plane et nivelez le système à l’aide des quatre boutons de nivellement situés sur les bords de l’appareil. Insérez des compresses froides dans la chambre inférieure pour garder la solution froide pendant l’électrophorèse.</li>
	<li>Versez environ ~850 mL de tampon froid 1x TAE dans l’appareil.</li>
	<li>Retirez les lames à 4 °C et placez-les sur le plateau d’électrophorèse dans la bonne orientation pour permettre la migration de l’ADN cassé. REMARQUE : Le plateau contient dix lames à 2 puits. Placez les lames au centre du plateau si vous travaillez avec un nombre inférieur d’échantillons. Si vous travaillez avec un nombre impair de diapositives, incluez une diapositive vierge telle que chaque puits puisse accueillir 2 diapositives.</li>
	<li>Placez délicatement le revêtement du plateau de diapositives fourni sur le dessus du plateau pour couvrir les diapositives. REMARQUE : Pour le bon fonctionnement de l’appareil, le volume du tampon TAE ne doit pas être inférieur à la surface inférieure du revêtement et ne doit pas dépasser la surface supérieure du revêtement.</li>
	<li>Après avoir connecté les câbles, réglez l’alimentation à 21 V et effectuez une électrophorèse (1 V/cm) pendant 40 min. REMARQUE : Il peut être nécessaire d’ajuster le temps d’électrophorèse en fonction du type de cellule utilisé pour les analyses. De longues queues dans les échantillons non traités indiquent un temps d’exécution excessif. À l’inverse, des queues courtes dans les échantillons de contrôle positif peuvent refléter un temps d’exécution insuffisant.</li>
</ol>5. Coloration
<ol><li>Une fois l’électrophorèse terminée, retirez les lames de l’appareil et immergez-les dans une solution de précipitation d’ADN pendant 30 minutes à température ambiante.</li>
	<li>Jetez la solution de précipitation de l’ADN et plongez les lames dans une solution d’éthanol à 70 % pendant 30 minutes à température ambiante.</li>
	<li>Jetez la solution d’éthanol à 70 %. Retirer les lames et les faire sécher dans un four d’hybridation à 45 °C pendant 30 min dans l’obscurité (figure 2B). REMARQUE : Les lames peuvent être laissées dans un endroit sombre et sec pendant la nuit pour l’étape de séchage.</li>
	<li>Incuber les puits avec 100 μL de 1x SYBR Green solution pendant 30 min à température ambiante dans l’obscurité.</li>
	<li>Décantez la solution SYBR Green en inclinant les lames et en enlevant l’excédent en tamponnant doucement le bord du puits avec une lingette non pelucheuse.</li>
	<li>Placez les lames dans un tiroir et laissez sécher pendant 30 min.</li>
	<li>Procédez à l’imagerie des lames.</li>
</ol>6. Imagerie et analyses
<ol><li>Configurez le microscope à des fins d’imagerie. REMARQUE : Toutes les images ont été acquises à l’aide d’un microscope à épifluorescence. Un grossissement de 10x avec une ouverture numérique de 0,45 a été utilisé avec un temps d’exposition de 1/40s et un gain de +6dB. Le mode de capture monochrome 8 bits a été utilisé avec le binning 2 x 2 et la correction de la balance des noirs.</li>
	<li>Placez les lames sur la platine du microscope et commencez l’imagerie à l’aide du filtre FITC. REMARQUE : Utilisez d’abord l’échantillon non traité pour tester le temps d’exposition. La plupart des cellules ne présentent pas de queues de comète car l’ADN est plus compact. Passez au puits avec des cellules traitées au CPT et imagez en utilisant le même temps d’exposition. Des queues de comète de plus grande longueur seront observées dans cet échantillon en raison de la migration des extrémités d’ADN brisées.</li>
	<li>Acquérez des images pour au moins 100 comètes par échantillon en utilisant le même temps d’exposition sur trois réplicats techniques. REMARQUE : Les queues de comète à l’extrémité des lamelles ont tendance à migrer de manière inégale et à agir comme des valeurs aberrantes dans la distribution de l’échantillon. La plupart des comètes capturées pour les analyses sont présentes près du centre de la lamelle (Figure 3).</li>
	<li>Exportez des images et notez les comètes soit manuellement (à l’aide de l’image J), soit à l’aide d’un logiciel de notation de comètes disponible gratuitement. Les comètes qui sont distinctes individuellement et entièrement contenues dans le champ de vision sont sélectionnées pour l’évaluation. Les comètes qui se chevauchent ou qui sont partiellement visibles ne sont pas prises en compte pour des analyses plus approfondies (Figure 4). REMARQUE : Les utilisateurs peuvent noter des comètes sur l’image J à l’aide du plugin suivant : https://cometbio.org/index.html. Les détails de l’évaluation des comètes à l’aide du logiciel CometScore sont inclus dans la figure 5.</li>
	<li>Tracez les moments de queue acquis à partir des analyses sous forme de diagrammes en boîte et à moustaches représentant des valeurs de 10 à 90 percentiles. Effectuer des tests de normalité pour déterminer si des tests paramétriques ou non paramétriques doivent être utilisés pour les analyses statistiques. REMARQUE : Dans la plupart des cas, les tests non paramétriques sont appliqués à l’aide du test de Mann-Whitney si l’on compare deux échantillons seulement ou du test de Kruskal-Wallis avec les comparaisons multiples de Dunn si l’on compare trois échantillons ou plus.</li>
</ol>

Étude de l’étendue des cassures de l’ADN se produisant lors de la réplication de l’ADN 

<ol><li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+proliferation+as+a+requirement+for+development+of+the+contact+effect+in+Chinese+hamster+v79+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Cell proliferation as a requirement for development of the contact effect in Chinese hamster v79 spheroids.</a> Radiat Res. 117 (1), 79-92 (1989).</li>
<li>Olive, P. L., Banath, J. P., Durand, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+radiation-induced+DNA+damage+and+repair+in+tumor+and+normal+cells+measured+using+the+%26%2334%3Bcomet%26%2334%3B+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the &#34;comet&#34; assay.</a> Radiat Res. 122 (1), 86-94 (1990).</li>
<li>Singh, N. P., Mccoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Exp Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).</li>
<li>Olive, P. L., Banath, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay%3A+A+method+to+measure+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The comet assay: A method to measure DNA damage in individual cells.</a> Nat Protoc. 1 (1), 23-29 (2006).</li>
<li>De Lapuente, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+and+its+applications+in+the+field+of+ecotoxicology%3A+A+mature+tool+that+continues+to+expand+its+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">The comet assay and its applications in the field of ecotoxicology: A mature tool that continues to expand its perspectives.</a> Front Genet. 6, 180(2015).</li>
<li>Azqueta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+comet+assay+in+human+biomonitoring%3A+An+hcomet+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res+Rev+Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Application of the comet assay in human biomonitoring: An hcomet perspective.</a> Mutat Res Rev Mutat Res. 783, 108288(2020).</li>
<li>Speit, G., Hartmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay%3A+A+sensitive+genotoxicity+test+for+the+detection+of+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The comet assay: A sensitive genotoxicity test for the detection of DNA damage.</a> Methods Mol Biol. 291, 85-95 (2005).</li>
<li>Collins, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+DNA+modifications+with+the+comet+assay%3A+A+compendium+of+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring DNA modifications with the comet assay: A compendium of protocols.</a> Nat Protoc. 18 (3), 929-989 (2023).</li>
<li>Rapp, A., Hausmann, M., Greulich, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet-fish+technique%3A+A+tool+for+detection+of+specific+DNA+damage+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The comet-fish technique: A tool for detection of specific DNA damage and repair.</a> Methods Mol Biol. 291, 107-119 (2005).</li>
<li>Saldivar, J. C., Cortez, D., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essential+kinase+atr%3A+Ensuring+faithful+duplication+of+a+challenging+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The essential kinase atr: Ensuring faithful duplication of a challenging genome.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (10), 622-636 (2017).</li>
<li>Cimprich, K. A., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atr%3A+An+essential+regulator+of+genome+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Atr: An essential regulator of genome integrity.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (8), 616-627 (2008).</li>
<li>Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-coupled+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Replication-coupled DNA repair.</a> Mol Cell. 74 (5), 866-876 (2019).</li>
<li>Strumberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+topoisomerase+I+cleavage+complexes+on+the+leading+strand+of+ribosomal+DNA+into+5%27-phosphorylated+DNA+double-strand+breaks+by+replication+runoff%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Conversion of topoisomerase I cleavage complexes on the leading strand of ribosomal DNA into 5'-phosphorylated DNA double-strand breaks by replication runoff.</a> Mol Cell Biol. 20 (11), 3977-3987 (2000).</li>
<li>Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+I+inhibitors%3A+Camptothecins+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase I inhibitors: Camptothecins and beyond.</a> Nat Rev Cancer. 6 (10), 789-802 (2006).</li>
<li>Hsiang, Y. H., Hertzberg, R., Hecht, S., Liu, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Camptothecin+induces+protein-linked+DNA+breaks+via+mammalian+DNA+topoisomerase+i%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Camptothecin induces protein-linked DNA breaks via mammalian DNA topoisomerase i.</a> J Biol Chem. 260 (27), 14873-14878 (1985).</li>
<li>Bryant, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+killing+of+brca2-deficient+tumours+with+inhibitors+of+poly%28adp-ribose%29+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specific killing of brca2-deficient tumours with inhibitors of poly(adp-ribose) polymerase.</a> Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).</li>
<li>Helleday, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+underlying+mechanism+for+the+parp+and+BRCA+synthetic+lethality%3A+Clearing+up+the+misunderstandings%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">The underlying mechanism for the parp and BRCA synthetic lethality: Clearing up the misunderstandings.</a> Mol Oncol. 5 (4), 387-393 (2011).</li>
<li>Mcglynn, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bromodeoxyuridine+comet+assay%3A+Detection+of+maturation+of+recently+replicated+DNA+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The bromodeoxyuridine comet assay: Detection of maturation of recently replicated DNA in individual cells.</a> Cancer Res. 59 (23), 5912-5916 (1999).</li>
<li>Morocz, M., Gali, H., Rasko, I., Downes, C. S., Haracska, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+of+human+rad18-dependent+DNA+post-replication+repair+by+alkaline+bromodeoxyuridine+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis of human rad18-dependent DNA post-replication repair by alkaline bromodeoxyuridine comet assay.</a> PLoS One. 8 (8), e70391(2013).</li>
<li>Thakar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lagging+strand+gap+suppression+connects+BRCA-mediated+fork+protection+to+nucleosome+assembly+through+PCNA-dependent+CAF-1+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Lagging strand gap suppression connects BRCA-mediated fork protection to nucleosome assembly through PCNA-dependent CAF-1 recycling.</a> Nat Commun. 13 (1), 5323(2022).</li>
<li>Vaitsiankova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parp+inhibition+impedes+the+maturation+of+nascent+DNA+strands+during+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Parp inhibition impedes the maturation of nascent DNA strands during DNA replication.</a> Nat Struct Mol Biol. 29 (4), 329-338 (2022).</li>
<li>Dungrawala, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radx+promotes+genome+stability+and+modulates+chemosensitivity+by+regulating+rad51+at+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Radx promotes genome stability and modulates chemosensitivity by regulating rad51 at replication forks.</a> Mol Cell. 67 (3), 374-386.e5 (2017).</li>
<li>Townsend, A., Lora, G., Engel, J., Tirado-Class, N., Dungrawala, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dcaf14+promotes+stalled+fork+stability+to+maintain+genome+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Dcaf14 promotes stalled fork stability to maintain genome integrity.</a> Cell Rep. 34 (4), 108669(2021).</li>
<li>Lemacon, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mre11+and+exo1+nucleases+degrade+reversed+forks+and+elicit+mus81-dependent+fork+rescue+in+brca2-deficient+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mre11 and exo1 nucleases degrade reversed forks and elicit mus81-dependent fork rescue in brca2-deficient cells.</a> Nat Commun. 8 (1), 860(2017).</li>
<li>Leung, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atr+protects+ongoing+and+newly+assembled+DNA+replication+forks+through+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Atr protects ongoing and newly assembled DNA replication forks through distinct mechanisms.</a> Cell Rep. 42 (7), 112792(2023).</li>
<li>Bhowmick, R., Mehta, K. P. M., Lerdrup, M., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrator+facilitates+RNApii+removal+to+prevent+transcription-replication+collisions+and+genome+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Integrator facilitates RNApii removal to prevent transcription-replication collisions and genome instability.</a> Mol Cell. 83 (13), 2357-2366.e8 (2023).</li>
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<li>Petermann, E., Orta, M. L., Issaeva, N., Schultz, N., Helleday, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyurea-stalled+replication+forks+become+progressively+inactivated+and+require+two+different+rad51-mediated+pathways+for+restart+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Hydroxyurea-stalled replication forks become progressively inactivated and require two different rad51-mediated pathways for restart and repair.</a> Mol Cell. 37 (4), 492-502 (2010).</li>
<li>Sestili, P., Cantoni, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmotically+driven+radial+diffusion+of+single-stranded+DNA+fragments+on+an+agarose+bed+as+a+convenient+measure+of+DNA+strand+scission%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Osmotically driven radial diffusion of single-stranded DNA fragments on an agarose bed as a convenient measure of DNA strand scission.</a> Free Radic Biol Med. 26 (7-8), 1019-1026 (1999).</li>
<li>Sestili, P., Martinelli, C., Stocchi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fast+halo+assay%3A+An+improved+method+to+quantify+genomic+DNA+strand+breakage+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">The fast halo assay: An improved method to quantify genomic DNA strand breakage at the single-cell level.</a> Mutat Res. 607 (2), 205-214 (2006).</li>
<li>Gorczyca, W., Gong, J., Darzynkiewicz, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+DNA+strand+breaks+in+individual+apoptotic+cells+by+the+in+situ+terminal+deoxynucleotidyl+transferase+and+nick+translation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of DNA strand breaks in individual apoptotic cells by the in situ terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays.</a> Cancer Res. 53 (8), 1945-1951 (1993).</li>
<li>Hanada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure-specific+endonuclease+mus81+contributes+to+replication+restart+by+generating+double-strand+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The structure-specific endonuclease mus81 contributes to replication restart by generating double-strand DNA breaks.</a> Nat Struct Mol Biol. 14 (11), 1096-1104 (2007).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Ce protocole décrit un test NC pour évaluer les cassures de l’ADN dans les cellules humaines subissant une réplication active. Le protocole est relativement simple à mettre en œuvre, et les chercheurs peuvent facilement l’adapter à des conditions de pH élevé pour des analyses alcalines8. Il comprend deux étapes critiques, comme décrit aux étapes 3.7 et 4.5. À l’étape 3.7, il est essentiel de répartir uniformément l’agarose fondue avec des cellules dans le puits pour éviter que les comètes ne se chevauchent pendant l’analyse. Assurez-vous que les agrégats cellulaires sont dissous avant de remettre les cellules en suspension dans l’agarose. Empêcher la libération de la pointe de la pipette lors de l’étalement de l’agarose aidera à minimiser l’introduction de bulles. Les conditions de l’électrophorèse sont cruciales pour obtenir une migration appropriée de la queue de comète pour l’imagerie et l’analyse. Les chercheurs doivent tenir compte de la nature des lignées cellulaires utilisées pour l’analyse, car l’étendue de la migration de la queue et le pourcentage de cellules présentant des queues de comète varient selon le type de cellule (figure 9). Par conséquent, il est recommandé de déterminer empiriquement le temps de fonctionnement de l’électrophorèse avant l’expérimentation.
Si aucune queue de comète n’est observée dans les échantillons de contrôle positif (cellules traitées par CPT), l’efficacité du médicament doit être corroborée en parallèle à l’aide d’approches alternatives, telles que l’immunocoloration pour le marqueur de dommages à l’ADN γH2AX. Une migration extensive de la queue peut empêcher l’analyse de l’induction des cassures. Minimiser le temps d’électrophorèse et évaluer la morphologie cellulaire avant l’analyse peut éviter d’obtenir des queues de comète trop longues. Un séchage insuffisant des diapositives peut entraîner des images de comètes floues et floues. Assurez-vous que l’agarose sur la lame de la comète est uniformément séchée et aplatie avant de la colorer avec une solution 1x SYBR. Si la plage d’induction du pli est étroite, l’exécution d’une courbe dose-réponse avec CPT peut aider à déterminer une plage de travail optimale à des fins expérimentales. L’application de ces conseils de dépannage vous aidera à maximiser les résultats de ces tests.
Cette méthodologie de test est rentable et très sensible par rapport à d’autres techniques utilisées pour étudier l’induction des cassures de l’ADN, telles que le test Halo29,30, le test TUNEL31 et l’électrophorèse sur gel en champ pulsé32. Cependant, la technique de dosage actuelle présente certaines limites. Il ne fournit pas un nombre précis de lésions de l’ADN mais offre une estimation relative de l’accumulation de cassures par rapport aux cellules non endommagées. De plus, il ne peut pas évaluer l’induction de cassures qui se produit d’une manière dépendante du cycle cellulaire. Pour exclure les modifications de l’induction des cassures dues à des différences dans la progression du cycle cellulaire, des analyses du cycle cellulaire par cytométrie en flux doivent être effectuées en parallèle.

Le test des comètes est une méthode d’électrophorèse sur gel utilisée pour détecter les cassures de l’ADN au niveau de la cellule unique. Il repose sur le principe que les cassures d’ADN ouvertes migrent dans des conditions électrophorétiques, tandis que l’ADN intact reste largement statique. L’ADN brisé migre parce que les cassures entraînent la relaxation de l’ADN surenroulé, provoquant sa relocalisation spatiale progressive vers l’anode dans la chambre électrophorétique, ce qui entraîne une apparence de comète observée par immunofluorescence 1,2. L’étendue des dommages à l’ADN est ensuite mesurée en quantifiant la quantité d’ADN brisé qui a migré par rapport à l’ADN compact.
Les deux méthodes de dosage des comètes les plus couramment utilisées sont le dosage des comètes alcalines (AC) et le dosage des comètes neutres (NC). Le dosage AC est effectué dans des conditions de dénaturation à l’aide d’une solution à pH alcalin élevé, tandis que le dosage NC est effectué dans une solution à pH neutre. Les tests NC et AC peuvent détecter de manière fiable les cassures d’ADN qui se produisent dans le noyau. Cependant, la version alcaline est également avantageuse pour la détection des sites alcalins-labiles3. Les deux formats de test nécessitent l’utilisation de conditions de lyse pour s’assurer que l’ADN est exempt de protéines avant l’électrophorèse.
Ce test est une méthode simple pour détecter les cassures de l’ADN et offre plusieurs avantages uniques pour déterminer les dommages à l’ADN cellulaire. La méthode est relativement facile à mettre en place et nécessite des réactifs qui peuvent être préparés en laboratoire ou achetés auprès de fournisseurs commerciaux. En tant que technique de résolution unicellulaire, le test nécessite très peu de matériel de départ. Notamment, le test NC peut mesurer les cassures avec une sensibilité élevée, détectant entre 50 et 10 000 cassures par cellule4. La polyvalence de cette technique est démontrée par son large éventail d’applications, notamment l’écotoxicologie5, la biosurveillance humaine6 et les études de génotoxicité7. Le test peut également être utilisé de manière fiable sur divers types de cellules et adapté aux tests à haut débit8 et à l’évaluation des cassures dans des régions génomiques spécifiques9. Ainsi, ce test constitue une technique rapide et fiable pour étudier la formation de cassures au niveau de la cellule unique.
Le processus de réplication de l’ADN est constamment mis à l’épreuve par plusieurs facteurs de stress endogènes et exogènes10,11. Le blocage des réplisomes dû à de telles lésions peut provoquer des cassures de l’ADN et entraîner une instabilité accrue du génome. Les cassures de l’ADN se produisent également souvent en tant qu’intermédiaires de réplication pour faciliter la réparation de l’ADN12. De plus, plusieurs agents chimiothérapeutiques induisent des cassures double brin (CDB) dépendantes de la réplication, telles que la camptothécine (CPT)13,14,15 et les inhibiteurs de PARP 16,17. Ainsi, ce test constitue une méthodologie puissante pour étudier la nature des lésions de l’ADN, évaluer le traitement des fourches de réplication et étudier le potentiel thérapeutique des agents endommageant l’ADN. Les adaptations du test qui impliquent le marquage de l’ADN nouvellement synthétisé avec BrdU ont été utiles pour étudier les phénotypes de stress associés à la réplication 18,19,20,21. Notamment, le test NC est une méthode fiable pour étudier l’induction des cassures de l’ADN dans le contexte de la réplication, comme le démontrent les études impliquant la caractérisation des protéines de fourche22,23, l’analyse des intermédiaires de réplication24,25 et l’étude des conflits de transcription-réplication dans la maintenance dugénome 26,27. Dans cet article, nous décrivons un protocole de test NC dans le but de quantifier les cassures de l’ADN lors de la réplication dans les cellules humaines. Ce protocole peut être facilement mis en œuvre par les chercheurs intéressés à évaluer les dommages associés au stress de réplication dans une grande variété de cellules humaines en division.

<table><tbody><tr><td>1x DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Camptothecin</td><td>Selleckchem</td><td>S1288</td><td></td></tr><tr><td>Comet LMAgarose (LMA)</td><td>R& D systems</td><td>4250-050-02</td><td></td></tr><tr><td>Système d’électrophorèse CometAssay II</td><td>R& D systems</td><td>4250-050-ES</td><td>Comprend un réservoir d’électrophorèse, un couvercle de sécurité, des câbles, des plateaux de lames 2/20 puits et une superposition de plateaux de diapositives</td></tr><tr><td>Logiciel CometScore</td><td>TriTek</td><td></td><td>open source</td></tr><tr><td>CometSlide</td><td>R& D systems</td><td>4250-050-03</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, haute teneur en glucose</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO&nbsp ;</td><td>FisherSci</td><td>D128-4</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à épifluorescence</td><td>Keyence</td><td>BZ-X810</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal - Premium</td><td>Bio-Techne</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Trypsin-EDTA (0.05 %), rouge de phénol</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 10.0</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T cellules</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>Cellules hTERT-RPE-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-4000</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyurea</td><td>Millipore Sigma</td><td>H8627</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de PARP Olaparib</td><td>Selleckchem</td><td>S8096</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac&nbsp ;</td><td>FisherSci</td><td>FB300Q</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture de tissus stériles traitée en surface</td><td>FisherSci</td><td>FB012927</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I Teinture gel d’acide nucléique (10 000x)</td><td>FisherSci</td><td>S7567</td><td></td></tr><tr><td>U2OS cellules</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>UVP&nbsp ; HB-1000 Incubateur d’hybridation</td><td>FisherSci</td><td>UVP95003001</td><td></td></tr></tbody></table>

détection de cassures d’adn dans des cellules humaines en division par dosage de comète neutre

Detection of DNA Breaks in Dividing Human Cells by Neutral Comet Assay

La réplication de l’ADN est constamment mise à l’épreuve par une grande variété de facteurs de stress endogènes et exogènes qui peuvent endommager l’ADN. De telles lésions rencontrées lors de la duplication du génome peuvent bloquer les réplisomes et convertir les fourches de réplication en cassures double brin. Si elles ne sont pas réparées, ces cassures d’ADN toxiques peuvent déclencher des réarrangements chromosomiques, entraînant une instabilité accrue du génome et une probabilité accrue de transformation cellulaire. De plus, les cellules cancéreuses présentent un stress de réplication persistant, ce qui fait du ciblage des vulnérabilités de la fourche de réplication dans les cellules tumorales une stratégie attrayante pour la chimiothérapie. Le test des comètes est une technique très polyvalente et puissante pour étudier les cassures de l’ADN pendant la réplication. Cette technique d’électrophorèse sur gel détecte de manière fiable l’induction et la réparation des cassures de l’ADN au niveau de la cellule unique. Ici, un protocole est décrit qui permet aux chercheurs de mesurer l’étendue des dommages à l’ADN dans la division mitotique des cellules humaines à l’aide d’agents de blocage à la fourche sur plusieurs types de cellules. Le couplage avec le scoring automatisé des comètes facilite l’analyse rapide et améliore la fiabilité de l’étude de l’induction des cassures de l’ADN.

Analyse de l’induction de cassures par des réactifs de contrainte de réplication Les cellules U2OS ont été traitées avec du DMSO, 4 de mM d’hydroxyurée (HU) ou 100 nM de CPT pendant 4 h et analysées pour l’accumulation de cassures par le test NC (Figure 6A). Alors que la CPT induit des cassures pendant la phase S en bloquant la topoisomérase-113, l’appauvrissement des pools de nucléotides induit par l’HU bloque les fourches de réplication qui sont progressivement converties en DSBs28. Les données indiquent que l’exposition à l’HU ou au CPT déclenche l’induction de la rupture en phase S, ce qui est détectable par le dosage NC.
Analyse de l’induction de la rupture comparant la lyse à différentes températures Les cellules U2OS non traitées ont été incubées dans un tampon de lyse à température ambiante (RT) ou à 4 °C avant les analyses de l’induction de la rupture (Figure 6B). Les résultats indiquent que la température à laquelle la lyse est effectuée a un impact minimal sur la migration des résidus dans l’essai.
Analyse temporelle des cassures par hydroxyurée (HU) Les cellules U2OS ont été laissées soit non traitées, soit traitées avec 4 mM de HU pendant 4 h et 8 h avant l’analyse de l’induction des cassures par le test NC (Figure 7). Les résultats indiquent que le blocage prolongé des fourches de réplication avec HU provoque l’effondrement de la fourche de réplication en DSB.
Analyse dose-dépendante des cassures par camptothécine Les cellules U2OS ont été traitées avec des doses accrues de CPT pendant 1 h et récoltées pour des analyses de cassures à l’aide du test NC (Figure 8). Alors que l’accumulation de cassures est minime dans les cellules non traitées par CPT, le degré d’induction des cassures augmente progressivement avec l’augmentation de la dose de CPT, démontrant ainsi l’utilité du test dans l’étude des effets dose-dépendants sur l’accumulation de cassures pendant la réplication de l’ADN.
Analyse comparative des cassures sur plusieurs types de cellules Les niveaux basaux de cassures de l’ADN ont été évalués dans trois types de cellules mitotiques divergentes : les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes immortalisées par hTERT (hTERT-RPE-1), le virus simien 40 (SV40), les cellules rénales embryonnaires humaines exprimant le grand antigène T (HEK293T) et les cellules d’ostéosarcome osseux (U2OS) (Figure 9). Chaque lignée cellulaire a démontré une migration différentielle des moments de queue en l’absence de stress de réplication supplémentaire, ce qui peut être dû à des différences dans la distribution du cycle cellulaire, l’organisation de la chromatine ou le nombre de fourches de réplication actives. Chaque type de cellule a également été exposé à 1 μM de CPT pendant 1 h pour valider une augmentation des cassures de l’ADN dépendantes de la réplication.
Analyses de l’induction de la rupture par dosage AC Les cellules U2OS ont été traitées avec du DMSO, 4 mM de HU, 1 μM de CPT ou 10 μM d’olaparib inhibiteur de PARP (PARPi) et analysées pour l’induction de la rupture (Figure 10). Les cellules ont été traitées avec du DMSO, du HU et du PARPi pendant 2 heures, tandis que le traitement CPT a duré 1 heure. Les résultats indiquent que l’exposition à la contrainte de réplication provoque une accumulation de ruptures, qui est observable par le test AC.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig01.jpg"> Figure 1 : Représentation schématique du dosage de la NC. (A) Le nombre requis de cellules est ensemencé la veille dans une boîte à 6 puits. (B) Après les traitements médicamenteux, les cellules sont trypsinisées et récoltées dans du PBS froid. (C) Les cellules sont remises en suspension doucement dans de l’agarose fondue selon un rapport de 10:1 (10 μL d’agarose pour 1 μL de suspension cellulaire) à l’aide d’une pointe de pipette. (D) La suspension cellulaire est transférée sur un puits à lames à l’aide d’une pointe de pipette et étalée uniformément pour couvrir complètement la surface du puits d’agarose. (E) Après l’incubation à 4 °C, les lames sont immergées dans un tampon de lyse, suivi d’un tampon TAE froid 1x. (F) Les échantillons sont soumis à l’électrophorèse à l’aide de l’appareil approprié. (G) Les lames sont ensuite immergées dans la solution de précipitation de l’ADN, suivie d’une solution d’éthanol à 70 %. (H) Après séchage, les puits sont colorés avec 1x solution SYBR Green. (I) Les lames sont imagées à l’aide d’un microscope à épifluorescence. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig02.jpg"> Figure 2 : Vue latérale de l’agarose sur les puits de la lame de comète. (A) Après incubation à 4 °C (étape 3.8), l’agarose solidifiée apparaît sous la forme d’une « bulle » de forme convexe. (B) Après séchage à 45 °C (étape 5.3), l’agarose apparaît aplatie sur le puits. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig03.jpg"> Figure 3 : Imagerie et analyse des comètes. (A) Les comètes situées dans le cercle intérieur du puits (surlignées en bleu) sont sélectionnées pour l’analyse. Les comètes situées vers le bord extérieur du puits sont exclues en raison de moments de queue anormalement plus longs, ce qui les marque comme des valeurs aberrantes. (B) Au moins 100 comètes représentatives sont sélectionnées au hasard dans la région de couleur bleue. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig04.jpg"> Figure 4 : Image représentative des comètes obtenue à partir de l’analyse NC. Le panneau de droite affiche un champ de vision représentatif des noyaux colorés en vert SYBR, tandis que le panneau de gauche met en évidence la région (contour vert) utilisée pour l’évaluation des comètes. Les noyaux partiellement visibles ou empilés à proximité les uns des autres (contour rouge, panneau de droite) ne sont pas inclus dans l’analyse. Les comètes sélectionnées pour l’évaluation doivent être distinctes individuellement, entièrement contenues dans le champ de vision et présenter une intensité de coloration uniforme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig05.jpg"> Figure 5 : Notation représentative des comètes obtenue à partir du test NC. (A) Les noyaux individuels sont décrits à l’aide du logiciel CometScore. (B) La vue complète du spectre (panneau de gauche) est activée et le seuil (barre de coupure) est ajusté pour obtenir une intensité de signal optimale avec un arrière-plan minimal. Le signal « spectre complet » doit correspondre à l’image « monochrome » (image du haut, panneau de droite) et ne pas dépasser le contour (image du bas, panneau de droite). (C) La ligne jaune verticale dans la boîte est alignée avec le centre de la tête de la comète, en utilisant la partie la plus large de la tête de la comète comme référence pour la cohérence. (D) Le score de chaque comète analysée est indiqué dans le coin supérieur droit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig06.jpg"> Figure 6 : Analyse de l’induction des cassures par des réactifs de stress de réplication. (A) Les cellules U2OS ont été traitées avec du DMSO, de la camptothécine 100 nM (CPT) ou de l’hydroxyurée (HU) 4 mM avant l’analyse de l’induction des cassures. Le graphique représentatif montre une augmentation de l’accumulation de cassures dans les cellules traitées par CPT ou HU. (B) Des cellules U2OS non traitées ont été ensemencées sur des lames de comètes et incubées pour la lyse (étape 3.9) soit à température ambiante (RT), soit à 4 °C pour comparer l’effet de la température de lyse. Les moments de queue des analyses sont représentés sous forme de diagrammes en boîte à moustaches représentant des valeurs de 10 à 90 percentiles, les valeurs médianes étant représentées par des lignes horizontales à l’intérieur des boîtes. Les valeurs p ont été calculées à l’aide du test de Kruskal-Wallis avec les comparaisons multiples de Dunn (valeur seuil de 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig07.jpg"> Figure 7 : Analyse temporelle des cassures induites par l’hydroxyurée. Les cellules U2OS ont été soit non traitées, soit traitées avec 4 mM HU pendant 4 h ou 8 h avant l’analyse d’induction de cassure. Le graphique représentatif représente une augmentation progressive de l’accumulation de cassures dans les cellules traitées avec l’HU. Les moments de queue des analyses sont représentés sous forme de diagrammes en boîte à moustaches représentant des valeurs de 10 à 90 percentiles, les valeurs médianes étant représentées par des lignes horizontales à l’intérieur des boîtes. Les valeurs p ont été calculées à l’aide du test de Kruskal-Wallis avec les comparaisons multiples de Dunn (valeur seuil de 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig07large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig08.jpg"> Figure 8 : Analyse dose-dépendante des cassures induites par la camptothécine. Les cellules U2OS ont été traitées avec du DMSO ou des concentrations croissantes de CPT (25 nM, 100 nM, 500 nM et 1 μM) pendant 1 h avant l’analyse des cassures. Les moments de queue des analyses sont représentés sous forme de diagrammes en boîte à moustaches représentant des valeurs de 10 à 90 percentiles, les valeurs médianes étant représentées par des lignes horizontales à l’intérieur des boîtes. Les valeurs p ont été calculées à l’aide du test de Kruskal-Wallis avec des comparaisons multiples de Dunn (valeur seuil de 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig08large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig09.jpg"> Figure 9 : Analyse comparative des cassures sur plusieurs types de cellules. Les cellules hTERT-RPE-1, HEK293T et U2OS ont été traitées avec du DMSO ou 1 μM CPT pendant 1 h. Le graphique représentatif montre l’étendue relative des dommages à l’ADN dans les trois types de cellules en présence ou en l’absence de CPT. Les moments de queue des analyses sont représentés sous forme de diagrammes en boîte et à moustaches représentant des valeurs de 10 à 90 percentiles, les valeurs médianes étant représentées par des lignes horizontales à l’intérieur des boîtes. Les valeurs p ont été calculées à l’aide du test de Kruskal-Wallis avec les comparaisons multiples de Dunn (valeur seuil de 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig09large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig10.jpg"> Figure 10 : Analyse de l’induction des cassures par le test AC. Les cellules U2OS ont été traitées avec du DMSO, 4 mM HU, 1 μM CPT ou 10 μM d’inhibiteur de PARP Olaparib avant l’analyse d’induction de cassure. Les cellules ont été traitées avec du DMSO, du HU et un inhibiteur de PARP pendant 2 heures, tandis que le traitement CPT a duré 1 heure. Le graphique représentatif montre une accumulation accrue de cassures dans les cellules traitées avec des inhibiteurs de CPT, HU ou PARP. Les moments de queue des analyses sont représentés sous forme de diagrammes en boîte à moustaches représentant des valeurs de 10 à 90 percentiles, les valeurs médianes étant représentées par des lignes horizontales à l’intérieur des boîtes. Les valeurs p ont été calculées à l’aide du test de Kruskal-Wallis avec les comparaisons multiples de Dunn (valeur seuil de 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig10large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Réactif</td>
			<td>Solution fonctionnelle</td>
		</tr><tr><td>Tampon de lyse</td>
			<td>0,5 % SDS, 200 mM Tris-Cl (pH 7,4), 50 mM EDTA</td>
		</tr><tr><td>1x tampon TAE</td>
			<td>40 mM de base Tris, 20 mM d’acide acétique, 1 mM d’EDTA à pH 8,45</td>
		</tr><tr><td>Solution de précipitation de l’ADN</td>
			<td>1 M d’acétate d’ammonium, 87 % d’éthanol</td>
		</tr><tr><td>Solution à 70% d’éthanol</td>
			<td>70% d’éthanol dans l’eau distillée</td>
		</tr><tr><td>1x solution SYBR Green</td>
			<td>1x SYBR Green dans 1x tampon TAE</td>
		</tr><tr><td>Milieux de culture DMEM</td>
			<td>DMEM avec 7,5% FBS</td>
		</tr><tr><td>Milieux de culture DMEM/F12</td>
			<td>DMEM/F12 avec 7,5 % FBS</td>
		</tr><tr><td>Solution de déroulement alcaline (à utiliser dans le dosage des comètes alcalines)</td>
			<td>200 mM de NaOH, 1 mM d’EDTA dans le pH&gt;13</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Liste des tampons et des solutions.

Ce protocole est conçu pour étudier l’étendue des dommages à l’ADN survenant lors de la réplication de l’ADN. Dans des conditions neutres, l’induction de cassures de l’ADN peut être facilement évaluée dans un court laps de temps. De plus, le protocole est adaptable à d’autres types de cellules et à divers réactifs de stress de réplication.

Détection de cassures d’ADN dans des cellules humaines en division par dosage de comète neutre

DNA replication is constantly challenged by a wide variety of endogenous and exogenous stressors that can damage DNA. Such lesions encountered during ...

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La vidéo montre le test de comète pour détecter les dommages à l’ADN après une exposition à des agents nocifs. Dans des conditions alcalines, l’ADN se déroule et se dénature, et lors de l’électrophorèse, l’ADN intact et endommagé migre différemment dans le gel d’agarose, formant une structure en forme de comète. L’ADN non endommagé qui migre lentement forme la tête de comète circulaire, tandis que les fragments d’ADN endommagés qui migrent rapidement forment la queue de comète allongée.

Dosage des comètes pour la détection des dommages à l’ADN dans les cellules

Le test des comètes est un moyen efficace de détection de ruptures simple et double brin, y compris alcali-labiles sites et DNA-DNA/DNA-protein liens croisés sur l'ADN dans toutes les cellules, y compris les neurones hippocampiques. La méthode tire parti de la migration différentielle de l'ADN dans un champ électrique dû à des différences de quantité de dommages de l'ADN.

Le dosage de dommages de l&#39;ADN dans les neurones hippocampiques Utilisation de l&#39;essai de comète

Nous décrivons ici une plate-forme qui permet la détection de test des comètes de dommages à l'ADN avec un débit sans précédent. Les motifs de dispositif de cellules de mammifères dans une puce et permet le traitement parallèle de 96 échantillons. L'approche facilite l'analyse des lésions de l'ADN au niveau de base, les dommages à l'ADN induits exposition et réparation de l'ADN cinétique.

CometChip: Une plate-forme à haut débit de 96 puits pour la mesure de dommages de l&#39;ADN dans les cellules humaines Microarrayed

Le test des comètes est une méthode efficace pour détecter les lésions de l’ADN dont l’ADN simple et double-brin se brise. Nous décrivons la comète neutres et alcalins des essais pour mesurer les lésions de l’ADN dans les cellules cancéreuses pour évaluer les effets thérapeutiques de la chimiothérapie.

Évaluation In Vitro dommages à l’ADN à l’aide du test des comètes

Ce protocole décrit plusieurs procédures pour la préparation d’échantillons de tissus congelés de haute qualité au moment de l’autopsie pour une utilisation dans l’essai de la comète pour évaluer les dommages à l’ADN : 1) tissu haché, 2) cellules épithéliales grattées du tractus gastro-intestinal, et 3) tissu en cubes d’échantillons, nécessitant l’homogénéisation à l’aide d’un dispositif de mincing tissulaire.

Utilisation de tissus congelés dans l’analyse de la comète pour l’évaluation des dommages à l’ADN

Nous décrivons ici deux modifications du test de la fibre d’ADN pour étudier les lacunes de l’ADN monocaténaire dans la réplication de l’ADN après l’induction de la lésion. Le test de fibre S1 permet la détection des lacunes post-réplicatives à l’aide de l’endonucléase S1 spécifique à l’ADNSS, tandis que le test de remplissage des lacunes permet la visualisation et la quantification de la réparation des lacunes.

Détection de l’accumulation et de la réparation des lacunes post-réplicatives dans les cellules humaines à l’aide du test de fibre d’ADN

Le test de comète est un moyen populaire de détecter les dommages à l’ADN. Cette étude décrit une approche pour exécuter des glissements dans des variantes représentatives du test de la comète. Cette approche a considérablement augmenté le nombre d’échantillons tout en réduisant la durée d’exécution des essais, le nombre de manipulations de lames et le risque d’endommagement des gels.

Une approche de dosage de comète à haut débit pour évaluer les dommages à l’ADN cellulaire

Ce protocole décrit une méthode efficace pour quantifier la différence dans les dommages à l’ADN induits par les inhibiteurs de type I et de type II dans les cellules mutantes FLT3 grâce à l’application du test de comète.

Test de comète pour quantifier les dommages à l’ADN dans les cellules 32D exprimant le mutant FLT3 après une exposition à des inhibiteurs de FLT3 de type I et de type II

«E-DNA» de capteurs, sans réactif, les biocapteurs électrochimiques qui se comportent bien, même si contesté directement dans le sang et d'autres matrices complexes, ont été adaptés à la détection d'une large gamme d'acides nucléiques, de protéines et de petites molécules d'analytes. Nous présentons ici une procédure générale pour la fabrication et l'utilisation de tels capteurs.

La fabrication des électrochimique de l&#39;ADN des Biocapteurs pour la détection sans réactif d&#39;acides nucléiques, protéines et petites molécules

Nous démontrons l'assemblage et l'application d'un dispositif à l'échelle moléculaire alimenté par une protéine topoisomérase. La construction est un capteur bio-moléculaires dont les étiquettes deux grands types de cassures de l'ADN dans les coupes de tissus en attachant deux fluorophores différents à leurs extrémités.

Assemblage in vitro de la semi-artificielle machine moléculaire et son utilisation pour la détection de lésions de l&#39;ADN

Découvrez le dosage de comète neutre pour évaluer les cassures d'ADN lors de la réplication dans des cellules humaines. Cette méthode permet d'étudier le remodelage de la chromatine et la stabilité du génome.

Détection de cassures d’ADN dans des cellules humaines en division par dosage de comète neutre

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